Kötőszöveti fibroblasztok mikrokörnyezetében gastricus karcinómák elősegítik a tumor metasztázis keresztül upregulating TAGLN expression

Villogófény fibroblasztok mikrokörnyezetében gastricus karcinómák elősegítik a tumor metasztázis keresztül upregulating TAGLN expressziós
Abstract
alapon
fibroblasztok kritikus szerepet játszanak a tumorigenezisben, a tumor progresszió és metasztázis. Azonban a részletes molekuláris jellemzői és a klinikai jelentősége még nem tisztázott. TAGLN egy aktin-kötő fehérje, amely fontos szerepet játszik a tumorigenezisben.
Eredmények
Megvizsgáltuk a kölcsönhatás a rákos sejtek és a tumor mikrokörnyezetében, hogy meghatározza, hogy a fibroblasztok a humán gyomor karcinóma megkönnyítése tumorigenezis keresztül TAGLN. QRT-PCR és Western blot azt jelezte, hogy TAGLN expresszió fokozódik gyomorkarcinóma-asszociált fibroblasztok (CAF-eket), amelyek elősegítik a gyomorrák sejtek migrációját és invázióját. Segítségével a kis interferáló RNS-t (siRNS-t), azt találtuk, hogy a CAF-ek fokozott tumor metasztázis útján serkentett TAGLN in vitro és in vivo. A kifejezés a mátrix metalloproteináz-2 (MMP-2) jelentősen alacsonyabb volt, miután TAGLN knock-down által siRNS. TAGLN szintek emelkedettek voltak humán gyomorrák stroma, mint a normál gyomor stroma és társított differenciálódást és nyirokcsomó-metasztázist gyomorrák.
Következtetés
CAF-ek elősegíthetik a gyomorrák sejt migrációs és behatolás keresztül upregulating TAGLN és TAGLN indukált MMP-2 termelés.
Kulcsszavak katalógusa TAGLN fibroblaszt Mikrokörnyezet tumormetasztázisban gyomorrák Háttér katalógusa gyomorrák a második leggyakoribb oka a rák összefüggő halálesetek a világon, különösen Ázsiában [1, 2]. A legtöbb gyomorrákos betegek halt daganat kiújulásának okozta távoli áttét. Metasztázis egy többlépcsős folyamat, amely a rákos sejtek terjesztése az elsődleges daganat és terjedtek át a környező szövetek és szervek távolság, amely magában foglalja a rákos sejtek mozgékonyságát, intravasation, átutazás a vér vagy nyirok és kiáramlást [3]. Ez a folyamat függ szorosan a környező mikrokörnyezet és a tumor fejlődését támaszkodik folyamatos közötti áthallás a rákos sejtek és az extracelluláris mikrokörnyezetet [4].
Transzgelin (TAGLN, más néven SM22) egy aktin térhálósító protein, amely részt vesz kalciumban kölcsönhatások és szabályozza összehúzódási tulajdonságokat [5]. Ez szerepet játszhat a sejt differenciálódás, sejtmigráció sejtek invázióját és a mátrix remodelling stabilizálásával a citoszkeleton keresztül aktin kötő [6, 7]. Overexpressziója TAGLN fehérje figyelték meg carcinomák a gyomor, a máj, és a nyelőcső, miközben csökkent szintje TAGLN mRNS figyeltek meg az emlő- és vastagbélrák sejtvonalak és primer tumorokban [8].
Általánosan elfogadott, hogy a tumor -stroma kölcsönhatások fontos szerepet játszanak a tumor kifejlődésében és progressziójában. A stroma alkotja főként az extracelluláris mátrix (ECM) és celluláris elemeket, mint például a fibroblasztokban [9, 10]. A sejtes elemei a stroma jól ismerik el, a támogató szerepet karcinogenezissel [11, 12]. Ezek a kötőszöveti elemek járnak el szinergikus áthallás rákos sejteket a primer oldalak fenntartásához a rák növekedését és a metasztázist [13, 14]. A tumor sztróma amely a továbbiakban mint a "reaktív stroma" van társítva megnövekedett számú fibroblasztok, fokozott kapilláris sűrűség és a lerakódás egy új ECM gazdag 1-es típusú kollagén és a fibrin [15]. Egyre több bizonyíték azt mutatja, hogy kötőszöveti sejtek, például fibroblasztok egy mélyebb hatással fejlődését és progresszióját carcinoma, mint azt korábban értékelik [15-17].
Fibroblasztokat jól ismert, hogy szerepet játszanak a tumorigenezis és progressziójában. Fibroblasztok kifejezni a vimentin, a fibronektin, α-sima-izom aktin (α-SMA), fibroblaszt felszíni fehérje, valamint a fibroblaszt markerek. Carcinoma-asszociált fibroblasztok (CAF) vannak kapcsolva fibroblasztok biológiailag eltérnek fibroblasztok jelen jóindulatú mikrokörnyezet számos fontos szempontot [17, 18]. CAF nem passzív járókelők a tumorigenezis és metasztázis, hanem aktívan hozzájárulni ezeknek a folyamatoknak. [19] Tudásunk a szerepét nyugvó és aktivált fibroblasztok a rák még mindig fejlődik. Itt elsősorban a kölcsönhatás a rákos sejtek és a mikrokörnyezet, hogy tanulmányozza, hogy a fibroblasztok izolált emberi gyomor carcinoma megkönnyítése tumorigenezis. Katalógusa Eredmények katalógusa kifejezése TAGLN felülszabáiyoződik gyomorrák összefüggő fibroblasztok
carcinoma -asszociált fibroblasztok (CAF-eket), megfelelője fibroblasztok (CPF) és normál fibroblasztok (NFS) nyertünk elsődleges szövettenyészet alkalmazásával szöveteket a rákhoz kapcsolódó régiókban, nem rákos asszociált váz és a normál nyálkahártya, ill. Ezután ellenőrzött, a tisztaság a különböző fibroblaszt populációk által immunfestés. Ezek a fibroblaszt populációk kifejezve magas levls a fibroblaszt markerek, mint például vimentin, α-SMA és a fibronektin. Másrészt, ezek a sejtek nem expresszálták epithelialis markerek, mint a citokeratin (1a ábra). Ezek az adatok megerősítették a tisztaság a fiborblasts. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy a tenyészet sejtek túlnyomórészt fibroblasztokat készítünk minimális szennyeződés más sejtek. 1. ábra A expresszióját TAGLN felülszabályozott a gyomorrák-asszociált fibroblasztok. A: jellemzése gyomor fibroblasztok (ICC). a1: vimentint, pozitív. A2: α-SMA, pozitív. a3: fibronektin, pozitív. a4: citokeratinnal, negatív. Eredeti nagyítások: × 200. Scale bárok, 100 nm. B: QRT-PCR analízise TAGLN CAF, CPF és NF. *, P katalógusa < 0,05, ** P katalógusa < 0,01, szemben a NF. C: A Western-blot-analízise TAGLN CAF, CPF és az NF, TAGLN expressziós szintje csökkent mossuk. D: fibroblasztok növekedési görbe határoztuk meg a CCK-8 esszé, CAF nőtt quickier mint a többiek. E: CAF volt magasabb képesség növelése MKN-45 migrációs képessége, mint a CPF és NF, ***, P katalógusa < 0,001 képest MKN-45. F: CAF volt magasabb képesség növelése MKN-45 inváziója képessége, mint a CPF és az NF *, P katalógusa < 0,05, ** P katalógusa < 0,01, míg a MKN-45.
A mRNS és fehérje szint TAGLN alacsonyabb volt CPF és NFS képest CAF (1B és C). Először azt mutatta, hogy a CAF-ek nőtt jelentősen több, mint CPF és NFS in vitro sejtproliferációs (1D ábra). Ezután végeztünk sejtek invázióját és migrációs assay tesztelni, hogy az invázió és migrációs képességét gyomorrák sejtek javulna a fibroblasztok. A kísérlet célja az volt, hogy vizsgálja meg a hatását stroma TAGLN, amelyet által szekretált fibroblasztok, az emberi gyomor rákos sejteket. A belső szintek TAGLN gyomorrákban sejtek megzavarhatják a kísérleti folyamat. Ezért, mi választottuk MKN-45 sejtvonal, mert TAGLN expressziós szintje volt a legalacsonyabb hét gyomor rákos sejtvonalak (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28, SGC-7901, az adatok nem látható). Érdekes, hogy az invázió és migrációs képességét MKN-45 emelkedett mind a három csoportban (CAF, CPF és NFS), és a megnövekedett leginkább a csoport CAF (1 E. ábra és F). Az akvizíció a migráció és invazív viselkedését az egyik lépés a metasztatikus folyamatban. Katalógusa CAF elősegítik a tumor metasztázis keresztül upregulating TAGLN katalógusa A hatásának vizsgálata TAGLN a fibrobalsts szoktuk RNSi leüt TAGLN kifejezést. CAF-ek, CPF és NFS transzfektáltunk TAGLN-specifikus vagy nem-csend siRNS. RNS és fehérje kaptuk 24, 48 vagy 72 óra után transzfekció TAGLN mRNS és fehérje szinten vizsgáltuk QRT-PCR és Western-blottal. TAGLN mRNS és fehérje szignifikánsan gátolta a sejtek kezelt TAGLN-specifikus siRNS (2A ábra és B). 2. ábra CAF-ek fokozzák tumor sejtvonal MKN-45 MIGRATON és invázió keresztül serkentett TAGLN. A: TAGLN kifejezés QRT-PCR analízis után siRNS kiütése a fibroblasztok. B: TAGLN expresszió Western-blot-analízis után siRNS knockdown fibroblasztokban. C: A sejt migrációs vizsgálattal, in vitro (fibroblasztok, vagy anélkül TAGLN siRNS interferencia). D: sejt inváziós vizsgálati eljárás in vitro (fibroblasztok, vagy anélkül TAGLN siRNS interferencia). Az értékek az átlag ± SD legalább három külön kísérletben, az egyes végzett három példányban. *, P katalógusa < 0,05, ** P katalógusa < 0,01, *** P katalógusa < 0,001, egyutas varianciaanalízis (ANOVA).
Mi következő vizsgáltuk, hogy az invázió és migrációs képességét, gyomorrák sejtek fogja erősíteni az expressziója TAGLN fibroblasztokban végeztünk sejtek invázióját és migrációs assay in vitro . A fibroblasztok és MKN-45 volt, nem contactedly együtt tenyésztettük. Érdekes, hogy az invázió és migrációs képességét MKN-45 azonnal lecsökkent a csoportban lévő CAF és enyhén csökkent a csoport CPF és az NFS. Az eredmények azt mutatták, hogy az invázió és migrációs képességét MKN-45 csökkenti a le-expresszióját szabályozó TAGLN (2C ábra és D).
Annak érdekében, hogy értékelje a hozzájárulása CAF-TAGLN a tumor metasztázis in vivo, emplyed xenograft modellben. Kevertünk TAGLN siRNS CAF-ek, nem-hangtompítós CAF-ek, CPF és NFS a MKN-45 humán gyomorrák sejteket egy 2: 1 arányban, vagy MKN-45 önmagában és beoltott ezek a sejtek át farok intravénás injekció immunhiányos, csupasz egerekben. 6 hét után, MKN-45 keverve CAF-ek által generált több tüdő metasztázisos gócok mint MKN-45 keverve TAGLN siRNS CAF-ek, CPF és az NFS, hasonló a MKN-45 keverve nem-csend siRNS CAF-ek (1. táblázat). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a CAF-ek mutatja a megnövekedett képessége, hogy stimulálják a tumor metasztázis (3A és B). Minden megfigyelések azt mutatták, hogy a jelenlétében CAF-ek, tumorok egyre agresszívabb, ami arra utal, hogy a CAF-ek játszhat szerepet előmozdításában áttét gyomorrák. 3. ábra TAGLN fokozza tumor metasztázis útján humán tumor xenograft modell in vivo. A: csupasz egerekben áttétes csomók a tüdőben. a1: tüdő áttétes gócok származó tomur hordozó egér. Arrow: áttétes góc. a2: nem áttétes góc a tüdőben. A3: H &E festés a tüdő áttétes góc alatt világos látóterű mikroszkóppal. Scale bárok, 200 nm. A4: H &E festés a tüdő nélkül áttétes góc alatt világos látóterű mikroszkóppal. Scale bárok, 200 nm. B: számszerűsítése csupasz egerek tüdő metasztázisos gócok különböző csoportokban a farok intravénás injekció. *, P katalógusa < 0,05, egyutas varianciaanalízis (ANOVA).
1. táblázat Nude egerek tüdő metasztázisos gócok különböző csoportokban a farok intravénás injekció (Minden csoport tartalmazott 6 egér)
csoportok
TAGLN siRNS CAF -MKN45 Matton nem csend siRNS CAF-MKN45 Matton CAF-MKN45 Matton CPF-MKN45 Matton NF-MKN45 Matton MKN45 egyedül Matton száma daganatos egerekben katalógusa 2 | 5 katalógusa 5 katalógusa 3 katalógusa 2 | 2 | száma áttétes gócok
2 | 10 katalógusa 9 katalógusa 5 katalógusa 3 katalógusa 2 | TAGLN elősegíti tumormetasztázisban felfelé szabályozásával MMP-2 | Számos tanulmány foglalkozott a szerepe mátrix metalloproteinázok (MMP) az invázió környező kötőszöveti és metasztázis tumorsejtek a primer lézió a távoli helyek a tumor progresszióját [20, 21]. A mi korábbi munka, megvizsgáltuk MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 és MMP-9 szint után TAGLN knock-down siRNS keresztül ELISA, csak az MMP-2 szint szignifikánsan down-szabályozott, egyéb MMP-k szint nem mutatott változást. Ezért, mi focued on MMP-2 ebben a vizsgálatban. Ahogy ábra 4A azt mutatta, összehasonlítva a MKN-45 co-coultured CAF /NEG és CAF /ál, MMP-2 szintek felülúszóban MKN-45 együtt tenyésztett CAF /siTAGLN szignifikánsan elnyomott. Mi következő vizsgált aktivitását MMP-2 segítségével zselatin zimográfiás vizsgálati eljárásban. Azt találtuk, MMP-2 aktivitás drámai gátolt felülúszóban MKN-45 együtt tenyésztett CAF /siTAGLN mint CAF /NEG és CAF /mock (4b ábra). Így TAGLN fokozhatja a tumor metasztázis keresztül a MMP-2 enzimek lebontják a bazális membránok (pl. Kollagén IV). 4. ábra TAGLN fokozza tumor metasztázis által serkentett MMP-2. A: MMP-2 expresszió CAF decresed nyilvánvalóan után TAGLN RNSi ELISA-val. *, P katalógusa < 0,05 egyutas varianciaanalízissel (ANOVA). Hiba sávok ábrázolják standard hiba az átlag körüli. B: knockdown TAGLN felület képes a CAF titkos MMP-2 zselatin zimográfiával. Katalógusa TAGLN expresszió humán gyomorrák és kapcsolata differenciálódást gyomorrákos betegek
Értékelni TAGLN kifejezést gyomorrák, TAGLN immunfestés 98 primer gyomorrák szöveteket vizsgáltak. TAGLN expressziót túlszabályozott a humán gyomorrák stroma, összehasonlítva a normál gyomor szövet (5A ábra: normál gasztrikus szövet; 5B ábra: a gyomorrák szövet). A korreláció TAGLN kifejezés a klinikopatológiai jellemzői ben a 2. táblázat mutatja TAGLN magasabb volt differenciálatlan daganatok (rosszul differenciált adenokarcinómák, pecsétgyűrű sejt karcinómák és mucinosus karcinómák), mint a differenciált is (jól és mérsékelt adnocarcinomas) (P
= 0,003). Sőt, TAGLN szint korrelált a nyirokcsomó-metasztázis (P = 0,029 katalógusa). Nem volt szignifikáns különbség a tumor TAGLN kifejezés a másik szerint klinikopatológiai funkciók, mint a nem, az életkor, a tumor mérete, Lauren besorolás, T-stádium, a távolság és a metasztázis TNM (P
≥ 0,05). 5. ábra kifejezése TAGLN humán gyomorrák szöveteket. A: TAGLN expressziós szintje a normális gyomor szöveteit IHC. Scale bárok, 100 nm. B: TAGLN túlzottan kifejeződik a stroma humán gyomorrák IHC. Scale bárok, 100 nm. C: TAGLN mRNS felülszabáiyoződik humán gyomorrák analizálása QRT-PCR-rel. D: TAGLN fehérje felülszabályozott humán gyomorrák analizáltuk Western-blottal. Az értékek az átlag ± SD legalább három külön kísérletben, az egyes végzett három példányban. *, P katalógusa < 0,001 paried-minták T katalógusa teszt.
2. táblázat Klinikopatológiai társulásai TAGLN kifejezés gyomorrákban
esetek száma Matton TAGLN immunfesté Matton P
katalógusa Gyenge (+) Matton Strong (++) Matton nemek katalógusa 0,778 katalógusa Férfi katalógusa 60 katalógusa 27 katalógusa 33 fiatal női katalógusa 38 katalógusa 16 katalógusa 22 katalógusa Kor
0,739 katalógusa ≤60y katalógusa 46 katalógusa 21 katalógusa 25 katalógusa > 60y katalógusa 52 katalógusa 22 katalógusa 30 katalógusa tumor méretét katalógusa 0.852 katalógusa ≤5 cm katalógusa 58 katalógusa 25 katalógusa 33 katalógusa > 5 cm katalógusa 40 katalógusa 18 katalógusa 22 katalógusa differenciálás
0.003 katalógusa Nos + Mérsékelt katalógusa 46 katalógusa 13 katalógusa 33 katalógusa Gyenge katalógusa 52 katalógusa 30 katalógusa 22 katalógusa Lauren besorolás
0,059 katalógusa Bél katalógusa 40 katalógusa 13 katalógusa 27 katalógusa Diffúz katalógusa 58 katalógusa 30 katalógusa 28
T fázisban katalógusa 0,142 katalógusa T1 + T2
56 katalógusa 21 katalógusa 35 katalógusa T3 + T4 katalógusa 42 katalógusa 22 katalógusa 20 katalógusa nyirokcsomó áttétek katalógusa 0.029 katalógusa N0 katalógusa 27 katalógusa 11 katalógusa 16 katalógusa N1 katalógusa 32 katalógusa 15 katalógusa 17 katalógusa N2 katalógusa 26 katalógusa 7 katalógusa 19 katalógusa N3 katalógusa 13 katalógusa 10
3 katalógusa távoli áttét katalógusa 0,709 katalógusa nélkül katalógusa 95 katalógusa 42 katalógusa 53 katalógusa A katalógusa 3 katalógusa 1 katalógusa 2 | TNM
0.722 katalógusa I
20 katalógusa 7 katalógusa 13 katalógusa II katalógusa 25 katalógusa 11 katalógusa 14 katalógusa III
30 katalógusa 10 katalógusa 20 katalógusa IV katalógusa 23 katalógusa 15 katalógusa 8 katalógusa is használtuk QRT-PCR és Western blot, hogy értékelje a kifejeződése TAGLN gyomorrákban szövetekben (5C és D). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a TAGLN expresszió gyomorrák szövetekben sokkal magasabb volt, a gyomorrák, mint hogy párosított normál szövetekben.
Discussion
Egyre több bizonyíték azt mutatja, hogy a rák kialakulásában és progressziójában vonja közötti kölcsönhatásokat a tumoros és stroma sejteket. Tumorsejtek aktívan toborozni stromális sejtek, mint például a vaszkuláris sejtek, simaizom sejtek és fibroblasztok, a tumorba, így a termelő mikrokörnyezet, hogy elősegítse a tumor növekedését [16, 22, 23]. Fibroblasztok gyakran alkotják a többség a kötőszöveti sejtek egy gyomor karcinóma, mégis funkcionális hozzájárulások e sejtek a tumorigenezis és metasztázis marad kevéssé ismert.
TAGLN egyik legkorábbi markerek simaizom differenciálódás embriogenezis során [24], és a korábbi tanulmányok kapcsolódó TAGLN főleg simaizomsejtekben [25]. Patológiás körülmények között kísérik a szöveti remodelling és fibrogenesis, mint például a sebgyógyulás és neoplasztikus elváltozások, jellemzi a megjelenése stromális sejtek ultrastrukturális jellemzői közbenső közötti tipikus fibroblasztok és azok a simaizomsejtek. Ezek a fibroblasztok mutatnak fenotípusos és funkcionális jellemzői a simaizomsejtek, és így vannak elnevezve myofibroblastok [26], például a CAF-ek. Tanulmányunkban TAGLN túltermelése is megfigyelhető volt CAF. Úgy tűnik, hogy a TAGLN fehérje túlzott mértékben expresszálódik a gyomorrák, amikor fehérje expressziós spektrumát gyomorrák alkalmazásával elemeztük kétdimenziós gélelektroforézis (2-DE) [27]. Továbbá a TAGLN fehérje egyike a két tumor-asszociált antigének, amelyeket azonosítottak szérumában vese karcinóma betegek Klade használva 2-DE [28]. Ezek a jelentések összhangban vannak a megállapítást, hogy az általunk megfigyelt real-time PCR és Western-blot. Érdekes módon azt találtuk, hogy TAGLN főként kimutatható fibroblasztok származó tumor sztróma helyett a tumorsejtekben. Hasonlóképpen, más kutatók felfedezték, hogy a TAGLN nem expresszálódik a rosszindulatú sejtek, de mesenchymalis sejtek a tumor sztróma [27].
Villogófény fibroblasztok szabályozzák endoteliális vagy epiteliális sejtek viselkedésének közvetlen, vagy közvetett sejt-cel1 kölcsönhatások. Aktiválása gazda stroma1 mikrokörnyezet azt gondolják, hogy egy kritikus lépés a tumor növekedéséhez és progressziójához [13, 29]. Kiválasztott fehérjéket a vázsejtje a daganatok pozitívan vagy negatívan befolyásolja a betegség progresszióját. A legjelentősebb akciók TAGLN kedvezhet a tumor sejtek mozgékonyságát és inváziós [7, 30, 31]. Azt találtuk, hogy a TAGLN szignifikánsan nagyobb volt a nyirokcsomó-metasztázis csoportban, mint a nyirokcsomó negatív csoporthoz. Hogy c1arify szerepének TAGLN stromális fibroblasztok alatt gyomorrák tumorigenezis és metasztázis, mi elhallgattatta a TAGLN kifejezés humán CAF. Jelezték, hogy csak az MKN-45 együtt tenyésztett CAF-ek expresszáló magas szintű TAGLN mutatott sokkal magasabb inváziójára és migrációjára képességét. Fibroblasztok amely TAGLN már leütött nem jeleníti meg ezt a funkciót. Összefoglalva, azt javasoljuk, hogy TAGLN lehet felelős javítására gyomorrák sejt metasztázis keresztül stromalis sejteket, mint például CAF-eket.
TAGLN expresszió jelentősen nőtt a gyomor CAF-eket. CAF-ek megnövekedett TAGLN expressziós szintje fokozhatja a tumorsejtek invázióját és migrációs képessége, amelyek elősegítik a fokozott expresszióját MMP-2. A stimuláció MMP expresszióját fibroblasztokban vagy után közvetlen érintkezés tumorsejtekben vagy érintkezés után a tumor sejt-eredetű oldható faktorok kiinduló daganatok hámsejtek kimutatták több tanulmány [32-35]. Tisztázása, a mögöttes mechanizmusok tehát gyengítik a tumor kiújulásának és metasztázis gyomorrákos betegek.
Következtetések katalógusa Összefoglalva, a vizsgálat azt mutatja, hogy a CAF elősegítheti gyomorrák sejtek migrációját és invázióját keresztül fokozott MMP-2 termelés okozta TAGLN upreguláció .
módszerek
szövetmintákat
összesen 40 pár rákos szöveteket és a megfelelő normális nyálkahártya QRT-PCR és Western blot és a 98 primer gyomor- rákok esetében immunfestés gyűjtöttünk sebészileg eltávolították gyomorrák diagnosztizált Tanszék Sebészeti Ruijin kórházi, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normál nyálkahártya mintákat vettünk a különbözet ​​a reszekció, ahol a tumorok található legalább több mint 6 cm kívül. Ez a tanulmány protokollt jóváhagyta a független etikai bizottság Ruijin Kórház, Shanghai Jiaotong Egyetem, School of Medicine. A beleegyező nyilatkozatot írtak. Minden mintát hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben egy éjszakán át, -80 ° C-on felhasználás előtt. 4% -os formaldehid-fixált szöveti szakaszok mind tumor, mind nyálkahártya megfestettük H &E és a vizsgált és ellenőrzött kórszövettanilag által Két patológus. Mindegyik mintából tulajdonították a diagnózis és a szerzett Lauren besorolás, differenciálódás pTNM színpadon. A tumor mérete, elhelyezkedése és egyéb klinikai patológiai jellemzőket kaptuk klinikai feljegyzések a beteg engedélyével. Katalógusa sejtvonalak
Gyomorrák sejtvonalak SNU-1 (ATCC CRL-5971), AGS (ATCC CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) és az KATOIII (ATCC: HTB-103) kaptuk az American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). További 3 gyomorrák-sejtvonalak, MKN-45, MKN-28, SGC-7901, őrződtek intézetünkben. Az összes sejtvonalat RPMI-1640-ben, kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS).
Antitestek
elsődleges antitesteket használtunk a festéshez tartalmazza humán specifikus anti-vimentin (ABCAM, Cambridge, UK), anti-fibronektin ( ABCAM, Cambridge, UK), anti-α-sima-izom aktin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), az anti-pán-citokeratin (ABCAM, Cambridge, UK), anti-SM22 (ABCAM, Cambridge, Egyesült Királyság) és egér anti-GAPDH (Kangchen, Kína).
izolálása emberi gyomor fibroblasztok
fibroblasztokat izoláltuk rákkal és a nem rákhoz kapcsolódó régióiban gyomor szövetek kivágjuk gyomorrákos betegeknél alatt radikális gyomor reszekció -tól a Sebészeti Osztály, Ruijin kórházi, Shanghai Jiao Tong University School of medcine. A rákhoz kapcsolódó régiók kerültek kiválasztásra, hogy minimálisan nekrotikus régióban a tumor tömegét. Nem rákos asszociált váz, amelyet izolált szövet legalább 2 cm disztálisan külső széltől a rák tömeget. Normál nyálkahártya mintákat vettünk a különbözet ​​a reszekció, ahol a tumorok található legalább több mint 6 cm kívül. A szöveteket apróra organoids körülbelül 1 mm 3 és szélesztettünk bevonat nélküli műanyag RPMI 1640 közegben, amely a humán bázikus fibroblaszt növekedési faktor, 20% magzati borjúszérumot (FCS) és penicillin és sztreptomicin, mint az antibiotikumok. Ezen körülmények között homogén fibroblaszt sejt populáció 7 nap után a kultúra. Mindegyik fibroblaszt ezután bővült egy 1: 3 arányban által tripszin-EDTA-val 10 cm Petri-csészékben. Használtunk fibroblasztok passzáltuk legfeljebb 8 népesség megduplázódásának (PDS) ezt követő kísérletekben, annak érdekében, hogy minimálisra csökkentsék klónszelekció és kultúra stressz, amely során esetleg előforduló kiterjesztett szövettenyészetben.
Immunhisztokémiai (IHC) katalógusa sejteket vagy szöveteket fixáltuk 30 percig 4% -os formaiinban és öblítjük foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS). Miután az endogén peroxidáz aktivitást leállítottuk 0,3% H 2 O 2 sejteket blokkoltuk normál nem-immun szérum 30 percig mielőtt primer antitesttel inkubáltuk 37 ° C-on 2 óra hosszat. A sejteket vagy szöveteket ezután jelölt sztreptavidin-biotin-torma-peroxidáz festés kit (Dako, Carpinteria, CA, USA). A jelenléte jelzett peroxidáz a szakaszok tettük láthatóvá inkubációval, 3,3 '- diaminobenzidin, DAB + szubsztrát kromogén és a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük. Negatív kontroll lemezeket végeztük kihagyva a primer ellenanyag.
TAGLN expressziót értékelték az intenzitást a megfestett sejteket, és határozzuk meg két kategóriában (gyenge pozitív és erős pozitív). A festés intenzitását szerint osztályozott négy évfolyamon (intenzitás pont): nincs festés (grade 0), világos barna festéssel (1. osztály), barna festéssel (grade 2) és sötét barna elszíneződést (3 fokozatú). Grade 0 és az 1. fokú definiáltuk gyenge pozitív, grade 2 és 3-as fokozatú definiáltuk erős pozitív. Katalógusa kvantitatív real-time PCR (QRT-PCR) hotelben teljes RNS-Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a gyártó utasításai szerint. cDNS-t kapunk 1 ng RNS felhasználásával reverz transzkripciós rendszer Kit (Promega, Madison, WI, USA) és a QRT-PCR-t végeztünk a SYBR Green PCR core reagenskészlet (Applied Biosystems, Warrington, Egyesült Királyság). Primerek specifikus TAGLN a következők voltak: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (felső), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (alsó). A glicerin-dehyde-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) használtunk, mint az endogén referencia. A szekvenciák 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (felső), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 "(alsó). QRT-PCR mennyiségi mRNS szintek TAGLN végeztük ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Az adatokat elemeztük használatával az összehasonlító Ct módszer. Sajátosságai kapott PCR-termékeket is megerősítette olvadási görbe.
Western blot
sejteket összegyűjtöttük, és lizáltuk emlős fehérje Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL, USA). A protein koncentrációt határoztuk meg bicinchoninsav- (BCA) fehérje esszé kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Tartalmazó mintákat 50 pg teljes proteint vittünk fel minden egyes sávba 12% -os akrilamid-gélen egy minigélen készülék (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Az elválasztott fehérjéket átvittük egy polivinilidén-difluorid (PVDF) membránra (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Miután primer antitesttel inkubáltuk (1: 1000), és HRP-konjugált másodlagos antitesttel (1: 5000), illetve immun komplexek által érzékelt megnövelt kemilumineszcens (ECL) rendszerrel (Millipore, Bedford, MA, USA).
Enzyme -hez kötődő immunszorbens vizsgálat (ELISA)
a fehérje szintje MMP-2 felülúszójában mértük ELISA kit (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA), a gyártó utasításai szerint.
Cell növekedés assay
a különböző csoportokban a cellák (1 × 10 3) beoltunk 96 lyukú lemezekre három példányban. Az életképes sejtek számát meghatároztuk naponta a sejtszámlálás Kit (CCK-8) felhasználásával egy vízben jól oldódó tetrazólium só WST-8 [2- (2-metoxi-4- nitro-fenil) -3- (4-nitro-fenil) -5- (2,4-diszulfo) -2H-tetrazólium, mononátrium só] (Dojindo, Japán). Röviden, 20 ul CCK-8-oldatot adunk be a lemezeket, az abszorbancia 450 nm-nél mértük után 4 óra inkubálás után.
Értékelése tumor invázió és a migráció
daganatinvázió és migrációs assay végeztük QCMTM24 lyukú invázió készlet (Millipore, Bedford, MA, USA) és QCMTM24 mérőhelyes Migration kit (Millipore, Bedford, MA, USA) protokoll szerint a gyártó által biztosított, ill. Add elkészített MKN-45 sejt-szuszpenzió (2 × 10 5 sejt /lyuk) a felső kamrába, és adjunk hozzá pre-felfüggesztett fibroblasztok (5 × 10 4 sejt /lyuk RPMI 1640 közegben, amely 20% FBS-t), hogy az alsó kamra. A TAGLN néhány fibroblasztok alsó kamrák gátolta a siRNS 24 óra múlva. MKN-45 és fibroblasztok együtt tenyésztettünk, nem contactedly 48 órán, majd lysised a sejteket, és meghatározva RFU értéket egy fluoreszcens lemezleolvasóval alkalmazásával 480/520 nm-es szűrővel készlet.
TAGLN siRNS katalógusa A Qiagen szoftvert használtunk tervezni RNSi szekvenciákat célzó emberi TAGLN (elérési szám. NM_003186) és az siRNS-szekvenciát a legnagyobb feltételezett hatékonyság (szensz: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antiszensz: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') szintetizálunk Shanghai GeneChem Co, Ltd. siRNS randomizált szekvencia (ész: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', antiszensz: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ) ellen nincs gén (kódolt siRNS csoport) transzfektált mint a belső ellenőrzés. A kísérletekhez a sejteket transzfektáltunk a DOTAP liposzómás transzfekciós reagens (Roche, Németország). A sejteket beoltottuk 2 × 10 5 sejt /lyuk mennyiségben egy 6-lyukú lemezeken. 24 óra elteltével a, ha a sejteket a fázis a log növekedési, 250 ul Opti-MEM-I-t összekeverünk 5 ul 20 pM siRNS duplex, míg egy másik 250 ul Opti-MEM-I-t külön-külön inkubálunk 11,88 ul DOTAP liposzóma. A két keveréket óvatosan összekeverjük, és inkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten. A transzfekcióhoz az egész elegyet hozzáadjuk az egyes lyukakhoz, 1,5 ml friss tápközeggel antibiotikumok nélkül. A végső transzfektált koncentrációja siRNS volt 20 nM. A sejteket összegyűjtjük további vizsgálatban 24, 48 és 72 óra a transzfekció után.
Zselatin zimográfia
A tenyészet felülúszókat 24 óra, és összekeverjük egy gél minta puffert (0,5 M Tris-HCl-t, glicerin, 10% nátrium-dodecil-szulfát [SDS], β-merkapto-etanol, és 0,5% brómfenolkék). Tíz mikrogramm fehérje vettünk SDS-PAGE elválasztás; Az SDS-PAGE géleken tartalmazott 0,1% zselatin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Az elektroforézis után a géleket mossuk, 50 mM Tris-pufferben, amely 2,5% Triton X-100. A géleket inkubáljuk további 24 órán át inkubációs közeg (50 mM Tris-pufferben [pH = 7,6], 10 mM CaCI 2, és 200 mM NaCl). A géleket megfestettük 0,5% Coomassie kék, fehér sávok (72 kDa) a kék háttér jelzett zónák emésztés jelenlétének megfelelő MMP-2.
Egérmodellben
nőstény Balb /c nu /nu
nude egerekben, korban illesztett között 4-5 hét (Zoológiai Intézet kínai Tudományos Akadémia), tartottunk egy meghatározott kórokozóktól mentes környezetben az Állat-Laboratóriumi berendezés, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kína. Fibroblasztok és az MKN-45 összekevertük az arány 1: 4 belül 0,1 ml PBS-ben, és injektáltuk az oldalsó farokvénába. Hat egereket vontunk minden egyes csoportban az összes kísérletben, és mindegyik kísérletet kétszer végezzük el. Állatokat leöltük, és a tüdő metasztázisos gócok feljegyeztük után 6 héttel a tumorsejtek beültetése. A tumor mintákat összegyűjtjük, kevert formalinban, paraffinba ágyaztuk, és alá kell vetni H &E festés. P katalógusa < Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Együttes előfordulása többszörös agyi infarktus miatt hypercoagulopathia járó malignus és meningealis carcinomatosis kezdeti megnyilvánulása gyomorrák
• Vajon gyomor tonometriával irányított kezelés csökkenti a teljes mortalitás kritikus állapotú betegek?