fibroblastes stromales dans le microenvironnement des carcinomes gastriques favorisent les métastases tumorales via upregulating expression TAGLN

les fibroblastes du stroma dans le microenvironnement des cancers gastriques favorisent les métastases tumorales par l'intermédiaire de la régulation positive de l'expression TAGLN
Résumé de l'arrière-plan
Fibroblastes jouent un rôle crucial dans la tumorigenèse, la progression tumorale et les métastases. Cependant, leurs caractéristiques moléculaires détaillées et la signification clinique sont encore insaisissable. TAGLN est une protéine liant l'actine qui joue un rôle important dans la tumorigenèse.
Résultats
Nous avons étudié l'interaction entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement de la tumeur afin de déterminer comment les fibroblastes de cancer de l'estomac humain facilitent la tumorigenèse par TAGLN. QRT-PCR et par transfert de Western a indiqué que l'expression était régulée positivement TAGLN dans les fibroblastes de carcinome gastrique associé (CEFA) qui favorisent la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion. Au moyen de petits ARN interférents (ARNsi), on a trouvé que CAFs améliorée métastases tumorales par TAGLN régulée positivement in vitro et in vivo. L'expression de la métalloprotéinase-2 matricielle (MMP-2) était significativement plus faible après TAGLN knock-down par ARNsi. niveaux TAGLN ont été élevés dans le stroma de cancer gastrique humain que stroma gastrique normale et associés à la différenciation et métastase ganglionnaire du cancer gastrique.
les CAFs Conclusion de peuvent favoriser la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion par upregulating TAGLN et TAGLN induites MMP-2 production.
Mots-clés
TAGLN Fibroblast Microenvironnement tumeur métastatique carcinome gastrique Contexte
carcinome gastrique est la deuxième causes les plus fréquentes de décès liés au cancer dans le monde, notamment en Asie [1, 2]. La plupart des patients atteints de cancer gastrique sont morts de récidive de la tumeur causée par des métastases à distance. Métastase est un processus en plusieurs étapes par lequel les cellules cancéreuses diffusent à partir de la tumeur primaire et envahissent les organes de tissus et la distance périphérique impliquant la motilité de cellules cancéreuses, intravasculaire, de transit dans le sang ou la lymphe et l'extravasation [3]. Ce processus dépend étroitement sur le microenvironnement entourant et le développement des tumeurs repose sur une diaphonie continue entre les cellules cancéreuses et des micro-environnements extracellulaires [4]. Le plus transgelin (TAGLN, également connu sous SM22) est une protéine de réticulation actine qui est impliqué dans les interactions de calcium et régule les propriétés contractiles [5]. Il peut jouer un rôle dans la différenciation cellulaire, l'invasion de cellules de migration cellulaire et remodelage de la matrice, en stabilisant le cytosquelette d'actine par liaison de la [6, 7]. La surexpression de la protéine TAGLN a été observée dans les carcinomes de l'estomac, du foie et de l'oesophage, alors que des taux réduits de TAGLN ARNm ont été observées dans les lignes du sein et de cellules de cancer du côlon et les tumeurs primaires [8].
Il est généralement admis que la tumeur -stroma interactions jouent un rôle important dans le développement et la progression tumorale. Le stroma est constituée principalement de la matrice extracellulaire (ECM), et éléments cellulaires, telles que les fibroblastes [9, 10]. Les composants cellulaires du stroma sont bien reconnus comme ayant un rôle de soutien dans la carcinogenèse [11, 12]. Ces éléments agissent stromales dans une diaphonie synergique avec des cellules cancéreuses provenant de sites primaires pour soutenir la croissance du cancer et les métastases [13, 14]. Le stroma de la tumeur qui est désignée sous le nom de "stroma réactif" est associée à une augmentation du nombre de fibroblastes, de la densité capillaire améliorée et le dépôt d'une nouvelle ECM riche en type 1 et le collagène et la fibrine [15]. L'accumulation des données révèle que les cellules stromales, telles que les fibroblastes ont une influence plus profonde sur le développement et la progression du cancer que précédemment apprécié [15-17].
Fibroblastes sont bien connus pour jouer un rôle dans la tumorigenèse et la progression. Fibroblastes expriment la vimentine, la fibronectine, l'actine α-muscle lisse (α-SMA), fibroblaste protéine de surface ainsi que des marqueurs fibroblastiques. fibroblastes Carcinome-associés (CEFA) fibroblastes sont activés, biologiquement différents à partir de fibroblastes présents dans microenvironnements bénignes dans plusieurs aspects importants [17, 18]. CAFs ne sont pas des spectateurs passifs dans la tumorigenèse et la métastase, mais contribuent activement à ces processus [19]. Nos connaissances sur le rôle des fibroblastes de repos et activés dans le cancer est encore en évolution. Ici, nous nous concentrons sur l'interaction entre les cellules cancéreuses et leurs microenvironnements pour étudier comment les fibroblastes isolés à partir de carcinomes gastriques humains facilitent la tumorigenèse.: Résultats
L'expression de TAGLN est surexprimés dans les fibroblastes de carcinome associées gastriques
Le carcinome fibroblastes -Associated (de CEFA), les fibroblastes de contrepartie (CPF) et des fibroblastes normaux (FN) ont été obtenus à partir de la culture de tissus primaires en utilisant des tissus provenant de régions associées au cancer, stroma non associée au cancer et de la muqueuse normale, respectivement. Nous avons ensuite vérifié la pureté des différentes populations fibroblaste par immunocoloration. Ces populations fibroblaste exprimées levls élevées de marqueurs fibroblastiques tels que la vimentine, α-SMA et de la fibronectine. D'autre part, ces cellules n'expriment des marqueurs épithéliaux, tels que la cytokératine (figure 1A). Ces données ont confirmé la pureté des fiborblasts. Ces observations indiquent que les cellules de culture étaient principalement des fibroblastes ont été préparées avec un minimum de contamination par d'autres cellules. Figure 1 L'expression de TAGLN est régulée positivement dans les fibroblastes associés au cancer gastrique. A: caractérisation des fibroblastes gastriques (ICC). a1: vimentine, positive. a2: α-SMA, positive. a3: fibronectine, positive. a4: cytokératine, négative. grossissements originales: × 200. Les barres d'échelle, 100 um. B: analyse QRT-PCR de TAGLN en CAF, CPF et NF. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, par rapport à la norme NF. C: analyse par Western blot de TAGLN dans CAF, CPF et NF, le niveau d'expression de TAGLN a diminué successivement. D: courbe de croissance de fibroblastes ont été déterminés par dosage CCK-8, a augmenté CAFs quickier que les autres. E: CAF avait plus grande capacité à améliorer la capacité de migration de MKN-45 que CPF et NF, ***, P
< 0,001 par rapport à MKN-45. F: CAF avait plus grande capacité à améliorer la capacité d'invasion de MKN-45 que CPF et NF, *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, comparativement à MKN-45.
L'ARNm et les niveaux de TAGLN de protéines étaient plus faibles dans les CPF et FNs comparativement à CAFs (Figure 1B et C). Nous avons d'abord montré que CAFs a augmenté de manière significative plus de CPF et FNs in vitro la prolifération des cellules (figure 1D). Ensuite, nous avons effectué une invasion cellulaire et la détermination de la migration pour tester si l'invasion et la migration capacité des cellules de cancer gastrique serait améliorée par les fibroblastes. L'expérience a été conçue pour étudier les effets du stroma TAGLN, qui a été sécrétée par les fibroblastes, sur les cellules cancéreuses gastriques humaines. Les niveaux internes de TAGLN dans les cellules de cancer gastrique pourraient interférer le processus expérimental. Par conséquent, nous avons choisi MKN-45 lignée cellulaire, parce que son niveau d'expression de TAGLN était le plus bas en sept lignées cellulaires de cancer gastrique (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 et SGC-7901; les données pas montré). Fait intéressant, l'invasion et la migration capacité des MKN-45 a augmenté dans tous les trois groupes (CEFA, CPF et FN), et a augmenté le plus dans le groupe avec la CAF (Figure 1E et F). Les CAF de l'acquisition de la migration et le comportement invasif est l'une des étapes du processus métastatique. promouvoir les métastases tumorales par upregulating TAGLN
Pour examiner l'effet de TAGLN en fibrobalsts, nous avons utilisé l'ARNi pour abattre l'expression TAGLN. CEFA, CPF et FNs ont été transfectées avec spécifiques TAGLN ou non-silence ARNsi. ARN et des protéines ont été obtenus à 24, 48 ou 72 heures après la transfection, les taux de protéine TAGLN ARNm et ont été étudiées par QRT-PCR et transfert de Western. TAGLN ARNm et la protéine ont été significativement inhibée dans les cellules traitées avec le siRNA spécifiques TAGLN (figure 2A et B). Figure 2 CAFs améliorer lignée cellulaire tumorale MKN-45 et l'invasion par La migration vers TAGLN upregulated. A: TAGLN expression par analyse QRT-PCR après siRNA knockdown dans les fibroblastes. B: expression de TAGLN par analyse de Western blot après siRNA knockdown dans les fibroblastes. C: cellule essai de migration in vitro (fibroblastes avec ou sans interférences TAGLN siRNA). D: cellule invasion test in vitro (fibroblastes avec ou sans interférences TAGLN siRNA). Les valeurs représentent la moyenne ± écart-type à partir d'au moins trois expériences distinctes, chacune effectuée en triple. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, ***, P
< 0,001, par analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA).
Nous avons ensuite étudié si l'invasion et la migration capacité des cellules du cancer de l'estomac sera renforcée par l'expression de TAGLN dans les fibroblastes, nous avons effectué une invasion cellulaire et essai de migration in vitro . Les fibroblastes et MKN-45 étaient non-contactedly co-cultivées. Fait intéressant, l'invasion et la migration capacité des MKN-45 a diminué immédiatement dans le groupe avec CAFs et légèrement diminué dans le groupe avec CPF et FN. Les résultats ont montré que l'invasion et la migration capacité des MKN-45 peut diminuer grâce à la régulation négative de l'expression de TAGLN (figure 2C et D).
Afin d'évaluer la contribution des CAFs-TAGLN à des métastases de la tumeur in vivo, nous emplyed un modèle de xénogreffe. Nous avons mélangé TAGLN siARN CAFs, CAFs non-silence, CPF et FNs avec MKN-45 cellules de cancer de l'estomac de l'homme dans un rapport 2: 1 ou MKN-45 seul et inoculé ces cellules par la queue injection intraveineuse chez la souris nude immunodéficientes. Après 6 semaines, MKN-45 mélangé avec CAFs généré plus nodules pulmonaires métastatiques que MKN-45 mélangé avec TAGLN siARN CAFs, CPF et FNs, semblable à MKN-45 mélangé avec non-silence ARNsi CAFs (tableau 1). Ces données suggèrent que CAFs montrent une plus grande capacité à stimuler les métastases tumorales (Figure 3A et B). Toutes les observations indiquent que, en présence d'CAFs, les tumeurs sont devenues plus agressifs, ce qui suggère que CAFs pourrait jouer un rôle dans la promotion de métastases dans le cancer gastrique. La figure 3 TAGLN améliore les métastases tumorales par modèle de xénogreffe de tumeur humaine in vivo. A: souris nude nodules métastatiques dans le poumon. a1: nodules pulmonaires métastatiques de la souris Tomur portant. Arrow: nodule métastatique. a2: non nodule métastatique dans les poumons. a3: H & E coloration pour le poumon nodule métastatique sous champ lumineux microscope. Les barres d'échelle, 200 um. a4: H & E coloration pour le poumon sans nodule métastatique sous champ lumineux microscope. Les barres d'échelle, 200 um. B: quantification des souris nude nodules pulmonaires métastatiques dans divers groupes à travers la queue injection intraveineuse. *, P
< 0,05, par une analyse de variance (ANOVA).
Tableau 1 souris Nude pulmonaires des nodules métastatiques dans divers groupes à travers la queue injection intraveineuse (Chaque groupe contenait 6 souris)
groupes

TAGLN siRNA CAF -MKN45
non-silence ARNsi CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 seul
Nombre de 2
5
5 3
2 2
Nombre de tumeurs chez des souris porteuses de nodules métastatiques 2
10
9
5 3
2
TAGLN favorise les métastases tumorales par upregulating MMP-2
de nombreuses études ont mis l'accent sur le rôle des métalloprotéinases matricielles (MMP) à l'invasion des environs le tissu conjonctif et les métastases des cellules tumorales de la lésion primaire vers des sites distants dans la progression tumorale [20, 21]. Dans nos travaux précédents, nous avons examiné la MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 et MMP-9 niveaux après TAGLN knock-down par siRNA par ELISA, seulement niveau MMP-2 était significativement réglementés vers le bas, d'autres MMP les niveaux ont montré aucun changement. Par conséquent, nous focued sur la MMP-2 dans cette étude. Comme la figure 4A montre, par rapport à MKN-45 co-coultured avec CAF /neg et CAF /mock, MMP-2 niveaux dans le surnageant de MKN-45 co-cultivées avec CAF /siTAGLN étaient significativement supprimées. Nous avons ensuite examiné l'activité de MMP-2 en utilisant un dosage de gélatine zymographie. Nous avons trouvé la MMP-2 activité a été considérablement inhibé dans le surnageant de MKN-45 co-cultivées avec CAF /siTAGLN qu'avec CAF /neg et CAF /mock (figure 4B). Ainsi, TAGLN peut augmenter les métastases tumorales à travers les MMP-2 enzymes dégradent les membranes basales (par ex. Le collagène IV). La figure 4 TAGLN améliore les métastases tumorales par MMP-2 régulée à la hausse. A: MMP-2 expression dans CAF decresed évidemment après TAGLN ARNi par ELISA. *, P
< 0,05 par une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA). Les barres d'erreur représentent l'erreur-type autour de la moyenne. B:. Knockdown TAGLN porté atteinte à la capacité de la CAF au secret de MMP-2 par zymographie de gélatine
expression TAGLN dans le cancer gastrique humain et de son association avec la différenciation chez les patients atteints de cancer gastrique
Pour évaluer l'expression de TAGLN dans le cancer gastrique, TAGLN immunocoloration 98 dans les tissus de cancer gastrique primaires ont été examinés. expression TAGLN a été régulée à la hausse dans le stroma de cancer gastrique humain par rapport au tissu gastrique normale (Figure 5A: tissu gastrique normale; Figure 5B: tissu de cancer gastrique). La corrélation de l'expression TAGLN avec les caractéristiques clinico a été montré dans le tableau 2. niveaux de TAGLN étaient plus élevés dans les tumeurs indifférenciées (mal des adénocarcinomes différenciés, les carcinomes anneau sigillaire et les carcinomes mucineux) que dans ceux différenciés (puits et adnocarcinomas modérés) (P
= 0,003). De plus, les niveaux TAGLN a été corrélée avec métastase ganglionnaire (P = 0,029
). Il n'y avait pas de différences significatives dans l'expression de TAGLN tumorale selon les autres caractéristiques clinico tels que le sexe, l'âge, la taille de la tumeur, la classification Lauren, le stade T, les métastases à distance et le stade TNM (P
≥ 0,05). La figure 5 Expression de TAGLN dans les tissus du cancer de l'estomac humain. A: niveau d'expression de TAGLN dans le tissu gastrique normale par IHC. Les barres d'échelle, 100 um. B: TAGLN est surexprimé dans le stroma du cancer gastrique humain par IHC. Les barres d'échelle, 100 um. C: TAGLN ARNm est régulée positivement dans le cancer gastrique humain analysé par QRT-PCR. D: protéine TAGLN est régulée positivement dans le cancer gastrique humain analysé par Western Blot. Les valeurs représentent la moyenne ± écart-type à partir d'au moins trois expériences distinctes, chacune effectuée en triple. *, P
< 0,001 par paried-échantillons test.
Tableau de T 2 associations clinicopathologiques d'expression de TAGLN dans le cancer gastrique
Nombre de cas
TAGLN immunocoloration
P

faible (+)
Strong (++)
Sexe
60
27
33
Femme de 0,778
Homme
38
16
22
Age
0,739
≤60y
46
21
25
> 60y
52
22
30 taille de la tumeur

0,852
≤5 cm
58
25
33
> 40
18
5 cm 22
Différenciation
0,003
bien + Modéré
46
13
33
Pauvre 52
30
22
Lauren classement
> 0,059
Intestinal
40
13
27
diffuse
58
30
28
T étape
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + 42
22
20
ganglionnaire de métastases du T4
27
0,029
N0 26
7
19
N3 de 32
15
17
N2 de 11
16
N1
13
10
3
métastases à distance
0,709 Sans
95
42
53
Avec 3
1 2
stade TNM
0,722
I
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15 8
en outre, nous avons utilisé QRT-PCR et Western blot pour évaluer l'expression de TAGLN dans les tissus de cancer gastrique (Figure 5C et D). Ces résultats suggèrent que l'expression de TAGLN dans les tissus du cancer de l'estomac était beaucoup plus élevée dans le cancer de l'estomac que dans les tissus normaux appariés. Discussion de l'accumulation des données
montre que l'initiation et la progression du cancer impliquent des interactions entre les deux tumeurs stromales et les cellules. Les cellules tumorales peuvent activement recruter des cellules stromales, comme les cellules vasculaires, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes, dans la tumeur, générant ainsi microenvironnement pour favoriser la croissance des tumeurs [16, 22, 23]. Fibroblastes constituent souvent la majorité des cellules stromales dans un carcinome gastrique, mais les contributions fonctionnelles de ces cellules à la tumorigenèse et les métastases tumorales sont encore mal connus.
TAGLN est l'un des premiers marqueurs de différenciation des muscles lisses pendant l'embryogenèse [24], et des études antérieures relatives à TAGLN ont porté essentiellement sur les cellules musculaires lisses [25]. des états pathologiques accompagnés d'un remodelage tissulaire et fibrogenèse, telles que la cicatrisation des plaies et lésions néoplasiques, sont caractérisées par l'apparition de cellules de stroma avec des caractéristiques ultrastructurales intermédiaires entre celles des fibroblastes typiques et ceux des cellules musculaires lisses. Ces fibroblastes présentent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules musculaires lisses et myofibroblastes sont donc nommés [26], comme CAFs. Dans notre étude, TAGLN surexpression a également été observée dans les EFC. Il est rapporté que la protéine TAGLN est surexprimée dans le cancer gastrique lorsque le spectre du cancer gastrique d'expression de protéine a été analysée par électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-DE) [27]. En outre, la protéine de TAGLN est l'un des deux antigènes associés à des tumeurs qui ont été identifiés dans le sérum des patients atteints de carcinome du rein par Klade utilisant du 2-DE [28]. Ces rapports sont compatibles avec les résultats que nous avons observés en utilisant PCR en temps réel et Western Blot. Chose intéressante, nous avons constaté que TAGLN a été principalement détectée dans les fibroblastes dérivés du stroma tumoral, plutôt que dans les cellules tumorales. De même, d'autres chercheurs ont découvert que la TAGLN n'a pas été exprimé dans les cellules malignes, mais dans des cellules mésenchymateuses du stroma de la tumeur [27].
Fibroblastes du stroma régulent endothélial ou le comportement des cellules épithéliales grâce à des interactions directes ou indirectes des cellules CEL1. L'activation de stroma1 hôte microenvironnement est considéré comme une étape critique dans la croissance et la progression tumorale [13, 29]. Les protéines sécrétées par les cellules stromales dans les tumeurs peuvent affecter positivement ou négativement la progression tumorale. Les actions les plus importantes de TAGLN peuvent favoriser la tumeur motilité et l'invasion cellulaire [7, 30, 31]. Nous avons constaté que la TAGLN était significativement augmenté dans le groupe de métastases des ganglions lymphatiques de groupe négatif des ganglions lymphatiques. Pour c1arify le rôle de TAGLN dans les fibroblastes du stroma pendant la tumorigenèse du cancer gastrique et la métastase, nous taire l'expression de TAGLN dans les EFC humaines. Il a été indiqué que seul le MKN-45 co-cultivées avec des CAFs exprimant TAGLN de haut niveau présentait beaucoup plus la capacité d'invasion et la migration. Fibroblastes qui TAGLN avait été renversé ne présentaient pas cette fonction. Pris ensemble, nous suggérons que TAGLN pourrait être responsable de l'amélioration de l'estomac métastase des cellules cancéreuses par les cellules stromales telles que CAFs. Expression
de TAGLN est augmenté de manière significative dans les EFC gastriques. CAFs avec des niveaux accrus d'expression de TAGLN peuvent augmenter l'invasion des cellules tumorales et la migration capacité qui favorisent une expression accrue de MMP-2. La stimulation de l'expression de MMP dans les fibroblastes, soit après un contact direct avec des cellules tumorales ou après contact avec des facteurs solubles cellules tumorales dérivées de tumeurs provenant de cellules epitheliales a été démontré dans plusieurs études [32-35]. Clarifier les mécanismes sous-jacents peut donc atténuer la récurrence de la tumeur et les métastases chez les patients atteints de cancer gastrique.
Conclusions
En résumé, notre étude démontre que CAFs peut favoriser la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion par l'intermédiaire d'augmentation de la production de MMP-2 causée par TAGLN surexpression .
Méthodes
échantillons de tissus
Un total de 40 paires de tissus cancéreux et de la muqueuse normale pour QRT-PCR et Western blot et 98 cancers gastriques primaires pour immunocoloration correspondants ont été recueillis dans le cancer gastrique enlevé chirurgicalement diagnostiqué au Département de chirurgie, l'hôpital Ruijin, école de médecine de l'Université de Shanghai Jiao Tong. Des échantillons de muqueuse normale ont été prélevés à partir de la marge de résection où les tumeurs situées au moins au-dessus de 6 cm à l'écart de celui-ci. Ce protocole d'étude a été approuvée par le comité d'éthique indépendant de l'hôpital Ruijin, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Le consentement éclairé a été écrit. Tous les échantillons ont été congelés rapidement dans de l'azote liquide et conservées pendant une nuit à -80 ° C avant utilisation. des sections de tissu de 4% de formaldéhyde fixe à la fois la tumeur et la muqueuse ont été colorées avec H &E et examinées et vérifiées histopathologique par deux pathologistes. Chaque spécimen a été attribué un diagnostic et a marqué pour la classification Lauren, la différenciation, le stade de pTNM. taille de la tumeur, l'emplacement et d'autres caractéristiques pathologiques cliniques ont été obtenues à partir des dossiers cliniques avec la permission du patient
lignées cellulaires
lignées cellulaires de cancer gastrique SNU-1 (ATCC: CRL-de 5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) et KATOIII (ATCC: HTB-103) ont été obtenus à partir de la American type Culture Collection (Manassas, VA, USA). 3 autres lignées cellulaires de cancer gastrique, MKN-45, MKN-28 et SGC-7901, ont été conservés à notre institut. Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS).

Anticorps Les anticorps primaires utilisés pour la coloration comprenaient l'anti-vimentine humaine spécifique (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-fibronectine ( Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), l'actine anti-α-muscle lisse (Sigma Chemical, St Louis, MO, USA), anti-pan-cytokératine (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et une souris anti-GAPDH (Kangchen, Chine).
Isolement de fibroblastes gastriques humaines
fibroblastes ont été isolés à partir des régions cancer- et non associés au cancer des tissus gastriques disséqués de patients atteints de cancer de l'estomac lors d'une résection gastrique radicale de Département de chirurgie, l'hôpital Ruijin, école de Medcine Université Jiao Tong de Shanghai. Les régions associées au cancer ont été choisies pour être des régions nécrotiques au minimum de la masse tumorale. Non associée au cancer du stroma, qui a été isolé à partir de tissu d'au moins 2 cm distal par rapport à la marge extérieure de la masse cancéreuse. Des échantillons de muqueuse normale ont été prélevés à partir de la marge de résection où les tumeurs situées au moins au-dessus de 6 cm à l'écart de celui-ci. Les tissus ont été réduites en organites d'environ 1 mm 3 et ensemencées sur la matière plastique non revêtue dans un milieu RPMI 1640 contenant du facteur humain basique de croissance des fibroblastes, 20% de sérum de foetus de veau (FCS) et de la pénicilline et de la streptomycine comme antibiotiques. Ces conditions ont produit une population de cellules fibroblastiques homogène au bout de 7 jours de culture. Chaque fibroblaste a ensuite été augmenté à un rapport de 1: 3 par trypsine-EDTA dans 10 cm boîtes de Pétri. Nous avons utilisé des fibroblastes à des passages jusqu'à 8 doublements de population (PDS) pour les expériences ultérieures, afin de minimiser la sélection clonale et le stress de la culture qui pourrait se produire pendant la culture tissulaire prolongée.
Coloration immunohistochimique (IHC)
cellules ou tissus ont été fixés pendant 30 min avec 4% de formaldehyde et on rince avec du tampon phosphate salin (PBS). Après une activité de peroxydase endogène a été stoppée avec 0,3% de H 2 O 2, les cellules ont été bloquées avec du sérum non-immune normale pendant 30 minutes avant d'être mis à incuber avec l'anticorps primaire à 37 ° C pendant 2 heures. Les cellules ou tissus ont ensuite été marquées avec le kit peroxydase coloration streptavidine-biotine-raifort (Dako, Carpinteria, CA, USA). La présence de la peroxydase marquée sur les sections a été visualisée par incubation avec 3,3 '- diaminobenzidine, DAB + substrat chromogène et les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline. Les lames de contrôle négatives ont été réalisées par omission de l'anticorps primaire.
expression TAGLN a été évaluée par l'intensité des cellules colorées, et déterminée en deux catégories (faiblement positif et fortement positif). L'intensité de la coloration a été classé en fonction de quatre catégories (scores d'intensité): pas de coloration (grade 0), coloration brun clair (grade 1), coloration brune (grade 2), et de coloration brun foncé (grade 3). Niveau 0 et grade 1 a été défini comme positif faible, de grades 2 et 3 ont été définis comme positif fort.
Quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR)
ARN total a été extrait en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. L'ADNc a été obtenu avec 1 pg d'ARN en utilisant le kit système de transcription inverse (Promega, Madison, WI, USA) et QRT-PCR a été réalisée par le kit de réactifs de base SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Warrington, Royaume-Uni). Des amorces spécifiques à TAGLN étaient les suivantes: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 "(supérieur), 5 ' - GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 '(inférieur). On a utilisé Glyceral-déhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), comme référence endogène. Ses séquences étaient 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (supérieur), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (inférieur). QRT-PCR pour la quantification des taux d'ARNm de TAGLN a été fait sur un ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les données ont été analysées en utilisant la méthode comparative CT. Spécificité des produits de PCR résultant a été confirmée par des courbes de fusion.
Western blot
Les cellules ont été récoltées et lysées avec un mammifère réactif d'extraction de protéines (Pierce, Rockford, IL, USA). Les concentrations en protéines ont été déterminées avec un acide bicinchoninique (BCA) kit de dosage de protéines (Pierce, Rockford, IL, USA). Les échantillons contenant 50 ug de protéine totale ont été chargés sur chaque voie de gel d'acrylamide 12% dans un appareil de minigel (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Les protéines séparées ont été transférées à un polyfluorure de vinylidène (PVDF) (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Après avoir été mis en incubation avec l'anticorps primaire (1: 1000) et de l'anticorps conjugué à HRP secondaire (1: 5000) système, respectivement, les complexes immuns ont été détectés par chimioluminescence améliorée (ECL) (Millipore, Bedford, MA, USA) Enzyme
. lié en immunosorbent assay (ELISA)
les niveaux de protéine de MMP-2 dans les surnageants ont été mesurées par un kit ELISA (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) selon les instructions du fabricant
croissance cellulaire. dosage
Les différents groupes de cellules (1 x 10 3) ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits en triple exemplaire. Le nombre de cellules viables a été déterminée quotidiennement en utilisant le kit cellule de comptage (CCK-8) en utilisant un très soluble dans l'eau du sel de tétrazolium WST-8 [2- (2-méthoxy-4- nitrophényl) -3- (4-nitrophényl) -5- (2,4-disulfophényl) -2H-tétrazolium, sel monosodique] (Dojindo, Japon). Évaluation de bref, 20 pi de CCK-8 solution a été ajoutée en plaques, l'absorbance à 450 nm a été mesurée après 4 heures d'incubation. De l'invasion de la tumeur et la migration
invasion tumorale et la migration test ont été réalisées avec le kit d'invasion QCMTM24 puits (Millipore, Bedford, MA, USA) et le kit de migration QCMTM24 puits (Millipore, Bedford, MA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant, respectivement. Ajouter préparé MKN-45 suspension de cellules (2 x 10 5 cellules /puits) à la chambre supérieure et ajouter des fibroblastes pré-suspension (5 x 10 4 cellules /puits dans un milieu RPMI 1640 contenant 20% de FBS) à la chambre inférieure. Le TAGLN de certains fibroblastes dans les chambres basses a été inhibée en utilisant siRNA 24 heures plus tard. MKN-45 et les fibroblastes ont été co-cultivées non-contactedly pendant 48 heures, puis lysised les cellules et déterminé les valeurs RFU avec un lecteur de plaque de fluorescence en utilisant 480/520 nm jeu de filtres.
TAGLN siRNA
Le logiciel Qiagen a été utilisé pour concevoir des séquences d'ARNi ciblant TAGLN humaine (N ° d'accès NM_003186.) et la séquence d'ARNsi avec l'efficacité supposée la plus élevée (sens: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', anti-sens: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') a été synthétisé par Shanghai GeneChem Co, Ltd siRNA avec une séquence aléatoire (sens: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', antisens: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') contre aucun gène (groupe d'ARNsi crypté) a été transfecté comme témoin interne. Pour les expériences, les cellules ont été transfectées avec le réactif de transfection DOTAP liposomale (Roche, Allemagne). Les cellules ont été ensemencées à 2 x 10 5 cellules /puits dans des plaques 6 puits. Après 24 heures, lorsque les cellules étaient en phase de croissance logarithmique, 250 ul Opti-MEM I a été mélangé avec 5 pi de 20 uM siRNA duplex, tandis qu'un autre 250 ul Opti-MEM I a été séparément incubé avec 11,88 pi de DOTAP liposome. Les deux mélanges ont été mélangés doucement et mis en incubation pendant environ 30 min à température ambiante. Pour la transfection, on a ajouté la totalité du mélange à chaque puits dans 1,5 ml de milieu frais sans antibiotiques. La concentration finale transfectées de siRNA était de 20 nM. Les cellules ont été collectées pour des essais supplémentaires à 24, 48 et 72 heures après la transfection. Gélatine la zymographie
Les surnageants de culture ont été récoltés au bout de 24 heures et on mélange avec un tampon d'échantillon de gel (0,5 M de Tris-HCl, le glycerol, 10% de dodécylsulfate de sodium [SDS], β-mercaptoéthanol et 0,5% de bleu de bromophénol). Dix microgrammes de protéines ont été prises par SDS-PAGE de séparation; les gels SDS-PAGE contenaient 0,1% de gélatine (Sigma Chemical, St Louis, MO, USA). Après électrophorèse, les gels ont été lavés dans du tampon Tris 50 mM contenant 2,5% de Triton X-100. Les gels ont été incubées pendant 24 heures supplémentaires dans le liquide d'incubation (50 mM de tampon Tris [pH 7,6], 10 mM CaCl 2, et 200 mM de NaCl). Les gels ont été colorés avec 0,5% bleu de Coomassie, des bandes blanches (72 kDa) sur un fond bleu indiquent des zones de digestion correspondant à la présence de la MMP-2. Modèle souris
Femme BALB /c nu /nu
souris nude, appariés selon l'âge entre 4-5 semaines (Institut de zoologie de l'Académie chinoise des sciences), ont été logés dans un environnement exempt d'organismes pathogènes spécifiques à l'Unité des animaux de laboratoire, Shanghai School of Medicine, la Chine Université Jiao Tong. MKN-fibroblastes et 45 ont été mélangés dans un rapport de 1: 4 à 0,1 ml de PBS et injectées dans la veine caudale latérale. Six souris ont été inclus dans chaque groupe dans toutes les expériences, et chaque expérience a été réalisée deux fois. Les animaux ont été sacrifiés et les nodules métastatiques pulmonaires ont été enregistrées à 6 semaines après l'implantation des cellules tumorales. échantillons de tumeur ont été prélevés, mélangés dans du formol, inclus dans la paraffine, et on les soumet à H & E coloration. P
< Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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