fibroblasti stromali del microambiente dei carcinomi gastrici promuovere metastasi tumorali tramite upregulating espressione TAGLN

fibroblasti stromali del microambiente dei carcinomi gastrici promuovere metastasi tumorali tramite upregulating espressione TAGLN
Abstract
sfondo
fibroblasti svolgono un ruolo critico nella tumorigenesi, la progressione del tumore e metastasi. Tuttavia, le loro caratteristiche molecolari dettagliate e significato clinico sono ancora sfuggente. TAGLN è una proteina actina-di legame che svolge un ruolo importante nella tumorigenesi.
Risultati
Abbiamo studiato l'interazione tra cellule tumorali e microambiente tumorale per determinare come i fibroblasti da carcinoma gastrico umano facilitano tumorigenesi attraverso TAGLN. QRT-PCR e Western Blot hanno indicato che l'espressione è stata TAGLN upregulated in fibroblasti di carcinoma gastrico-associato (CAF) che promuovono la migrazione delle cellule cancro gastrico e l'invasione. Utilizzando piccoli RNA interferenti (siRNA), abbiamo scoperto che CAF migliorate metastasi tumorali attraverso TAGLN upregulated in vitro e in vivo. L'espressione di metalloproteinasi della matrice-2 (MMP-2) era significativamente più bassa dopo TAGLN knock-down da siRNA. livelli TAGLN sono stati elevati in stroma cancro gastrico umano rispetto al normale stroma gastrica e associati con la differenziazione e la metastasi linfonodali del cancro gastrico.
Conclusione
CAF possono favorire la migrazione delle cellule di cancro gastrico e l'invasione via upregulating TAGLN e TAGLN indotti MMP-2 produzione.
Parole
TAGLN fibroblasti microambiente tumorale metastasi di carcinoma gastrico Sfondo
carcinoma gastrico è la seconda causa più comune di morte per cancro nel mondo, soprattutto in Asia [1, 2]. La maggior parte dei pazienti affetti da cancro gastrico è morto di recidiva del tumore causato da metastasi a distanza. Metastasi è un processo a più stadi con cui le cellule tumorali diffondono dalla neoplasia primaria e invadono circostante organi tessuti e distanza, coinvolgendo la motilità delle cellule tumorali, intravasation, il transito nel sangue o linfa e stravaso [3]. Questo processo dipende strettamente sul microambiente circostante e sviluppo tumorale si basa su un continuo cross-talk tra cellule tumorali e microambienti extracellulari [4].
Transgelin (TAGLN, noto anche come SM22) è una proteina actina reticolazione che è coinvolto nelle interazioni di calcio e regola le proprietà contrattili [5]. Si può giocare un ruolo nella differenziazione cellulare, l'invasione delle cellule migrazione cellulare e rimodellamento della matrice stabilizzando il citoscheletro attraverso actina vincolante [6, 7]. Sovraespressione di proteine ​​TAGLN è stata osservata nei carcinomi dello stomaco, del fegato, e l'esofago, mentre diminuzione dei livelli di mRNA TAGLN sono stati osservati in linee di cellule della mammella e il cancro del colon e tumori primari [8].
È generalmente accettato che del tumore interazioni -stroma svolgono un ruolo importante nello sviluppo del tumore e la progressione. Lo stroma è costituito principalmente di matrice extracellulare (ECM) e elementi cellulari quali fibroblasti [9, 10]. I componenti cellulari dello stroma sono ben riconosciuti come aventi un ruolo di supporto nella carcinogenesi [11, 12]. Questi elementi stromali agiscono in sinergia cross-talk con le cellule tumorali dai siti primari per sostenere la crescita del cancro e metastasi [13, 14]. Lo stroma tumorale che viene indicato come "stroma reattiva" è associato ad un aumento del numero dei fibroblasti, maggiore densità capillare e la deposizione di un nuovo ECM ricco di tipo-1-collagene e fibrina [15]. Accumulando prove rivela che le cellule stromali, come i fibroblasti hanno una più profonda influenza sullo sviluppo e progressione del carcinoma rispetto a quanto in precedenza apprezzato [15-17].
I fibroblasti sono ben noti a svolgere ruoli nella tumorigenesi e nella progressione. I fibroblasti esprimono vimentina, fibronectina, actina α-muscolo liscio (α-SMA), proteina di superficie dei fibroblasti, così come marcatori fibroblastic. fibroblasti Carcinoma-associata (CAF) fibroblasti sono attivate, biologicamente differenti da fibroblasti presenti in microambienti benigni in diversi aspetti importanti [17, 18]. CAF non sono spettatori passivi nella tumorigenesi e delle metastasi, ma contribuire attivamente a questi processi [19]. Le nostre conoscenze sul ruolo dei fibroblasti di riposo e attivati ​​nel cancro è ancora in evoluzione. Qui, ci concentriamo su l'interazione tra le cellule tumorali e le loro microambienti per studiare come i fibroblasti isolati da carcinomi gastrici umani facilitano tumorigenesi.
Risultati
L'espressione di TAGLN è upregulated in gastrici fibroblasti carcinoma associata
Il carcinoma fibroblasti -associated (CAF), fibroblasti contropartita (CPF) e fibroblasti normali (NFS) sono stati ottenuti da coltura tissutale primario utilizzando tessuti provenienti da regioni cancro-associata, stroma non cancro-associata e mucosa normale, rispettivamente. Abbiamo poi verificato la purezza delle varie popolazioni di fibroblasti mediante immunocolorazione. Queste popolazioni di fibroblasti espresso alti levls di marcatori fibroblastic quali vimentina, α-SMA e fibronectina. D'altra parte, queste cellule non esprimono marcatori epiteliali come citocheratina (Figura 1A). Questi dati hanno confermato la purezza dei fiborblasts. Queste osservazioni indicano che le cellule di coltura erano prevalentemente fibroblasti sono stati preparati con la contaminazione minima da altre cellule. Figura 1 L'espressione di TAGLN è upregulated in gastrici fibroblasti cancro-associata. A: caratterizzazione dei fibroblasti gastrico (ICC). A1: vimentina, positivo. a2: α-SMA, positivo. A3: fibronectina, positivo. A4: citocheratina, negativo. ingrandimenti originale: × 200. Barre di scala, 100 micron. B: Analisi QRT-PCR di TAGLN in CAF, CPF e NF. *, P
< 0.05, **, P
< 0,01, rispetto a NF. C: Analisi Western Blot di TAGLN in CAF, CPF e NF, livello di espressione TAGLN era diminuita successivamente. D: fibroblasti curva di crescita sono stati determinati da CCK-8 test, CAF cresciuto quickier rispetto agli altri. E: CAF aveva più elevata capacità di migliorare la capacità di migrazione di MKN-45 di CPF e NF, ***, P
< 0.001 rispetto a MKN-45. F: CAF aveva più elevata capacità di migliorare la capacità invasione MKN-45 di CPF e NF, *, P
< 0.05, **, P
< 0,01, rispetto a MKN-45.
Il mRNA e di proteina di TAGLN erano inferiori in CPF e NFS rispetto CAF (Figura 1B e C). In primo luogo abbiamo dimostrato che CAF è cresciuto significativamente più di CPF e NFS nella proliferazione cellulare in vitro (Figura 1D). Successivamente, abbiamo effettuato l'invasione delle cellule e la migrazione saggio per verificare se la capacità di invasione e la migrazione delle cellule di cancro gastrico sarebbe rafforzato da parte dei fibroblasti. L'esperimento è stato progettato per studiare gli effetti di stroma TAGLN, che è stata secreta dai fibroblasti, su cellule di cancro gastrico umano. I livelli interni di TAGLN in cellule di cancro gastrico potrebbero interferire il processo sperimentale. Quindi, abbiamo scelto la linea di cellule MKN-45, perché il suo livello di espressione TAGLN era il più basso in sette linee di cellule di cancro gastrico (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 e SGC-7901; dati non mostrato). È interessante notare che l'invasione e la migrazione capacità di MKN-45 è aumentato in tutti i tre gruppi (CAF, CPF e NFS), ed ha aumentato la maggior parte nel gruppo con CAF (Figura 1E e F). L'acquisizione di migrazione e comportamento invasivo è una delle fasi del processo metastatico.
CAF promuovere metastasi tumorali attraverso upregulating TAGLN
Per esaminare l'effetto di TAGLN in fibrobalsts, abbiamo usato RNAi per abbattere l'espressione TAGLN. CAF, CPF e NFS sono state trasfettate con specifiche TAGLN o non il silenzio siRNA. RNA e proteine ​​sono stati ottenuti a 24, 48 o 72 ore dopo la trasfezione, TAGLN mRNA e livelli di proteina sono stati studiati da QRT-PCR e Western Blot. TAGLN mRNA e proteine ​​erano significativamente inibiti in cellule trattate con siRNA specifici TAGLN (Figura 2A e B). Figura 2 CAF migliorare linea di cellule tumorali MKN-45 migraton e l'invasione attraverso TAGLN upregulated. A: espressione TAGLN da qRT-PCR dopo siRNA atterramento in fibroblasti. B: espressione TAGLN mediante analisi Western Blot dopo siRNA atterramento in fibroblasti. test di cellule migrazione in vitro (fibroblasti con o senza interferenze TAGLN siRNA): C. saggio di cellule invasione in vitro (fibroblasti con o senza interferenze TAGLN siRNA): D. I valori rappresentano la media ± SD di tre esperimenti separati, ognuno condotto in triplicato. *, P
< 0.05, **, P
< 0,01, ***, P
< 0.001, con analisi della varianza ad una via (ANOVA).
Abbiamo poi esaminato se la capacità di invasione e la migrazione delle cellule di cancro gastrico sarà rafforzata con l'espressione di TAGLN nei fibroblasti, abbiamo condotto l'invasione delle cellule e test di migrazione in vitro . I fibroblasti e MKN-45 erano non-contactedly co-coltura. È interessante notare che l'invasione e la migrazione capacità di MKN-45 è diminuito immediatamente nel gruppo con CAF e leggermente diminuita nel gruppo con CPF e NFS. I risultati hanno mostrato che l'invasione e la migrazione capacità di MKN-45 può diminuire attraverso la down-regolazione dell'espressione di TAGLN (Figura 2C e D).
Per valutare il contributo di CAF-TAGLN di metastasi tumorali in vivo, abbiamo emplyed un modello di xenotrapianto. Abbiamo mescolato TAGLN siRNA CAF, CAF non tacere, CPF e NFS con MKN-45 cellule di cancro gastrico umano in un rapporto 2: 1 o MKN-45 da solo e inoculato queste cellule attraverso coda iniezione endovenosa in topi nudi immunodeficienti. Dopo 6 settimane, MKN-45 mescolato con CAF generato più di polmone noduli metastatici rispetto MKN-45 misto con TAGLN siRNA CAF, CPF e NFS, simile a MKN-45 misto con i non-silenzio siRNA CAF (Tabella 1). Questi dati suggeriscono che CAF mostrano una maggiore capacità di stimolare le metastasi del tumore (Figura 3A e B). Tutte le osservazioni hanno indicato che, in presenza di CAF, i tumori sono diventati più aggressivi, suggerendo che CAF potrebbe svolgere un ruolo nel promuovere la metastasi nel cancro gastrico. Figura 3 TAGLN migliora metastasi tumorali attraverso modello di tumore xenotrapianto umano in vivo. A: topi nudi noduli metastatici nel polmone. A1: polmone noduli metastatici da topo tomur-cuscinetto. Freccia: nodulo metastatico. a2: nessun nodulo metastatico nel polmone. A3: H & E colorazione per polmone nodulo metastatico in campo chiaro microscopio. Barre di scala, 200 micron. A4: H & E colorazione per il polmone senza nodulo metastatico in campo chiaro microscopio. Barre di scala, 200 micron. B: quantificazione dei topi nudi polmone noduli metastatici nei vari gruppi tramite iniezione endovenosa coda. *, P
< 0,05, per una via l'analisi della varianza (ANOVA).
Tabella 1 topi nudi polmone noduli metastatici in diversi gruppi attraverso l'iniezione endovenosa di coda (Ogni gruppo conteneva 6 topi)
gruppi
TAGLN siRNA CAF -MKN45
non silenzio siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 da solo
numero di topi portatori di tumore 2
5
5 3
2 2
numero di noduli metastatici 2
10
9
5 3
2
TAGLN promuove metastasi tumorali da upregulating MMP-2
Molti studi si sono concentrati sul ruolo delle metalloproteinasi della matrice (MMP) per l'invasione della circostante del tessuto connettivo e le metastasi delle cellule tumorali dalla lesione primaria in sedi lontane nella progressione tumorale [20, 21]. Nel nostro lavoro precedente, abbiamo esaminato MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 e MMP-9 livelli dopo TAGLN knock-down da siRNA tramite ELISA, solo a livello di MMP-2 è stata significativamente down-regolato, altre MMP livelli hanno mostrato alcun cambiamento. Quindi, abbiamo focued on MMP-2 in questo studio. Come mostra la Figura 4A ha mostrato, rispetto a MKN-45 co-coultured con CAF /neg e CAF /finto, MMP-2 livelli di surnatante da MKN-45 co-coltura con CAF /siTAGLN erano significativamente soppressi. Abbiamo poi esaminato l'attività di MMP-2 con saggio di gelatina zimografia. Abbiamo trovato l'attività MMP-2 è stato notevolmente inibita nel surnatante da MKN-45 co-coltura con CAF /siTAGLN che con CAF /neg e CAF /finto (Figura 4B). Così, TAGLN può aumentare metastasi tumorali attraverso gli enzimi MMP-2 degradano le membrane basali (ad es. Collagene IV). Figura 4 TAGLN migliora metastasi tumorali da upregulated MMP-2. A: MMP-2 in CAF decresed ovviamente dopo TAGLN RNAi con ELISA. *, P
< 0.05 da unidirezionale analisi della varianza (ANOVA). Le barre di errore rappresentano l'errore standard intorno alla media. B:. Atterramento TAGLN compromessa la capacità di CAF di segreto MMP-2 da parte di gelatina zimografia
espressione TAGLN nel cancro gastrico umano e la sua associazione con la differenziazione nei pazienti affetti da cancro gastrico
per valutare l'espressione TAGLN nel carcinoma gastrico, immunostaining TAGLN in 98 sono stati esaminati i tessuti di cancro gastrico primarie. espressione TAGLN stato upregulated in stroma cancro gastrico umano rispetto al tessuto gastrico normale (Figura 5A: tessuto gastrico normale; Figura 5B: tessuto del cancro gastrico). La correlazione di espressione TAGLN con le caratteristiche clinico-patologici è stato mostrato nella tabella 2. livelli TAGLN erano più elevati nei tumori indifferenziati (scarsamente differenziate adenocarcinomi, carcinomi a cellule ad anello con castone e carcinomi mucinosi) rispetto a quella in quelle differenziate (oltre e adnocarcinomas moderata) (p
= 0,003). Inoltre, i livelli di TAGLN è stata correlata con metastasi linfonodali (P = 0,029
). Non ci sono state differenze significative nell'espressione del tumore TAGLN in base alle altre caratteristiche clinico-patologici come il sesso, l'età, le dimensioni del tumore, la classificazione Lauren, stadio T, la distanza metastasi e stadio TNM (P
≥ 0,05). Figura 5 L'espressione di TAGLN nei tessuti di cancro gastrico umano. A: livello di espressione TAGLN nel tessuto gastrico normale IHC. Barre di scala, 100 micron. B: TAGLN è sovraespresso nello stroma del cancro gastrico umano mediante IHC. Barre di scala, 100 micron. C: TAGLN mRNA è upregulated in cancro gastrico umano analizzato da QRT-PCR. D: proteina TAGLN è upregulated in cancro gastrico umano analizzato da Western Blot. I valori rappresentano la media ± SD di tre esperimenti separati, ognuno condotto in triplicato. *, P
< 0.001 da paried-campioni T
test.
Tabella 2 associazioni clinico-patologiche di espressione TAGLN nel carcinoma gastrico
Numero di casi
TAGLN immunocolorazione
P

debole (+)
Strong (++)
genere
0.778
Maschio
60
27
33
Femminile
38
16
22
Età
0,739
≤60y
46
21
25
> 60y
52
22
30 dimensioni del tumore

0.852
≤5 cm
58
25
33
> 5 cm
40
18
22
Differenziazione
0.003
Bene + Moderato
46
13
33
Poor
52
30
22
Lauren classificazione
0,059
intestinale
40
13
27
Diffuse
58
30
28
T fase
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
metastasi linfonodali
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26 7
19
N3
13
10
3
Distant metastasi
0,709
senza
95
42
53
Con 3
1 2
stadio TNM
0,722
I
20 7
13
II
25
11
14
III
30 10
20
IV
23
15 Pagina 8
Inoltre, abbiamo usato QRT-PCR e Western blot per valutare l'espressione di TAGLN nei tessuti di cancro gastrico (Figura 5C e D). Questi risultati suggeriscono che l'espressione TAGLN nei tessuti di cancro gastrico era molto più alto di cancro gastrico da quello in tessuti normali appaiati.
Discussione
Accumulando prove dimostra che l'iniziazione e la progressione del cancro coinvolgono le interazioni tra tumore e sia cellule stromali. Le cellule tumorali possono reclutare attivamente cellule stromali, come le cellule vascolari, cellule muscolari lisce e fibroblasti, nel tumore, generando così microambiente per favorire la crescita del tumore [16, 22, 23]. I fibroblasti costituiscono spesso la maggior parte delle cellule stromali all'interno di un carcinoma gastrico, ma i contributi funzionali di queste cellule di tumori e metastasi tumorali sono ancora poco chiare.
TAGLN è uno dei primi marcatori di differenziazione muscolo liscio durante l'embriogenesi [24], e studi precedenti relativi alla TAGLN focalizzata principalmente sulle cellule muscolari lisce [25]. condizioni patologiche accompagnate con rimodellamento tissutale e fibrogenesi, come la guarigione delle ferite e delle lesioni neoplastiche, sono caratterizzate dalla comparsa di cellule stromali con caratteristiche ultrastrutturali intermedie tra quelle dei fibroblasti tipici e quelli delle cellule muscolari lisce. Questi fibroblasti presentano caratteristiche fenotipiche e funzionali delle cellule muscolari lisce e miofibroblasti quindi sono di nome [26], come CAF. Nel nostro studio, TAGLN sovraespressione è stata osservata anche nei CAFS. È stato riferito che la proteina TAGLN è sovraespresso nel cancro gastrico quando spettro espressione della proteina del cancro gastrico è stato analizzato mediante elettroforesi bidimensionale (2-DE) [27]. Inoltre, la proteina TAGLN è uno dei due antigeni tumore-associati che sono stati identificati nel siero di pazienti con carcinoma renale da Klade utilizzando 2-DE [28]. Questi rapporti sono coerenti con i risultati che abbiamo osservato con real-time PCR e Western Blot. È interessante notare, abbiamo trovato che TAGLN stato rilevato principalmente in fibroblasti derivati ​​da stroma del tumore, piuttosto che in cellule tumorali. Allo stesso modo, altri ricercatori hanno scoperto che il TAGLN non è espresso nelle cellule maligne, ma in cellule mesenchimali dello stroma tumorale [27].
Fibroblasti stromali regolano endoteliali o il comportamento delle cellule epiteliali attraverso interazioni dirette e indirette delle cellule-CEL1. L'attivazione di stroma1 ospite microambiente è pensato per essere un passo fondamentale nella crescita del tumore e la progressione [13, 29]. Le proteine ​​secrete dalle cellule stromali nei tumori possono influire positivamente o negativamente la progressione del tumore. Le azioni più importanti di TAGLN possono favorire la motilità delle cellule tumorali e l'invasione [7, 30, 31]. Abbiamo trovato che il TAGLN era significativamente aumentata nei linfonodi gruppo di metastasi di linfonodi gruppo negativo. Per c1arify il ruolo di TAGLN nei fibroblasti stromali durante gastrica tumorigenesi del cancro e delle metastasi, abbiamo silenziato l'espressione TAGLN in CAF umani. E 'stato indicato che solo il MKN-45 co-coltura con CAF che esprimono alto livello TAGLN esposto molto più alta capacità di invasione e la migrazione. I fibroblasti che TAGLN era stato abbattuto non visualizzano questa funzione. Nel loro insieme, suggeriamo che TAGLN potrebbe essere responsabile per il miglioramento della gastrica metastasi delle cellule tumorali tramite cellule stromali come la CAF. Espressione
TAGLN è aumentata in modo significativo in CAF gastrici. CAF con un aumento dei livelli di espressione TAGLN possono aumentare l'invasione delle cellule tumorali e la migrazione capacità che promuovono una maggiore espressione di MMP-2. La stimolazione dell'espressione MMP in fibroblasti o dopo il contatto diretto con le cellule tumorali o dopo il contatto con fattori solubili cellule tumorali derivate da tumori originano da cellule epiteliali è stato dimostrato in diversi studi [32-35]. Chiarire i meccanismi alla base può quindi attenuare la recidiva del tumore e metastasi in pazienti affetti da cancro gastrico.
Conclusioni
In sintesi, il nostro studio dimostra che CAF può favorire la migrazione delle cellule di cancro gastrico e l'invasione via aumento della produzione di MMP-2 causata da TAGLN upregulation .
Metodi
campioni di tessuto
Un totale di 40 coppie di tessuti tumorali e corrispondenti mucosa normale per QRT-PCR e Western blot e 98 tumori gastrici primarie per immunostaining sono stati raccolti da cancro gastrico rimosso chirurgicamente diagnosticati presso il Dipartimento di Chirurgia, Ruijin ospedale, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. campioni mucosa normale sono stati prelevati dal margine di resezione in cui i tumori situati almeno in 6 cm di distanza da esso. Questo protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico indipendente di Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Il consenso informato è stato scritto. Tutti i campioni sono stati a scatto congelati in azoto liquido durante la notte e conservati a -80 ° C prima dell'uso. 4% sezioni di tessuto Formaldeide-fisso sia del tumore e della mucosa sono state colorate con H & E e esaminate e verificate istopatologico da due patologi. Ogni campione è stato attribuito una diagnosi e ha segnato per la classificazione Lauren, la differenziazione, fase pTNM. Le dimensioni del tumore, la posizione e le altre caratteristiche cliniche patologiche sono stati ottenuti da cartelle cliniche con il permesso del paziente
linee cellulari
linee di cellule di cancro gastrico SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) e KATOIII (ATCC: HTB-103) sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Altri 3 linee di cellule di cancro gastrico, MKN-45, MKN-28 e SGC-7901, sono stati conservati presso il nostro istituto. Tutte le linee cellulari sono state mantenute in RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS)
. Anticorpi
anticorpi primari utilizzati per la colorazione inclusi umano specifico anti-vimentina (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronectina ( actina Abcam, Cambridge, UK), anti-α-muscolo liscio (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), anti-pan-citocheratina (Abcam, Cambridge, UK), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, UK) e topo anti-GAPDH (Kangchen, Cina).
Isolamento di fibroblasti umani gastrici
I fibroblasti sono stati isolati dalle regioni cancro e non-cancro-associata dei tessuti gastrici sezionati da pazienti con cancro gastrico durante la resezione gastrica radicale il Dipartimento di Chirurgia, Ruijin ospedale, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. Le regioni cancro-associata sono stati selezionati come regioni minimamente necrotiche della massa tumorale. Non-cancro-associata stroma, che è stato isolato dal tessuto ad almeno 2 cm distalmente al margine esterno della massa cancro. campioni mucosa normale sono stati prelevati dal margine di resezione in cui i tumori situati almeno in 6 cm di distanza da esso. I tessuti sono stati tritati in organoidi di circa 1 mm 3 e seminate su materiale plastico non rivestito in RPMI 1640 medium contenente il fattore umano fondamentale di crescita dei fibroblasti, il 20% di siero fetale bovino (FCS) e la penicillina e la streptomicina come gli antibiotici. Queste condizioni hanno prodotto una popolazione cellulare fibroblastica omogenea dopo 7 giorni di coltura. Ogni fibroblasti fu poi espansa in un rapporto 1: 3 con tripsina-EDTA in 10 cm piatti Petri. Abbiamo usato fibroblasti diversi passaggi per un massimo di 8 raddoppi di popolazione (PDS) per esperimenti successivi, al fine di minimizzare selezione clonale e lo stress della cultura che potrebbero verificarsi durante la coltura dei tessuti prolungato.
Colorazione immunoistochimica (IHC)
cellule o tessuti sono state fissate per 30 minuti con 4% di formalina e risciacquati con tampone fosfato (PBS). Dopo l'attività perossidasica endogena è stata spenta con 0,3% H 2O 2, le cellule sono state bloccate con siero normale non immune per 30 minuti prima di essere incubate con l'anticorpo primario a 37 ° C per 2 ore. Le cellule o tessuti sono stati poi etichettati con kit perossidasi colorazione streptavidina-biotina-rafano (Dako, Carpinteria, CA, USA). La presenza di perossidasi marcato sulle sezioni è stato visualizzato mediante incubazione con 3,3 '- diaminobenzidina, DAB + cromogeno substrato e le sezioni sono state contrastate con ematossilina. vetrini di controllo negativo sono stati eseguiti per omissione dell'anticorpo primario.
espressione TAGLN stata valutata l'intensità di cellule marcate e determinata in due categorie (debolmente positivo e fortemente positivo). L'intensità della colorazione è stato classificato secondo quattro gradi (colonne sonore di intensità): nessuna colorazione (grado 0), marrone chiaro colorazione (grado 1), di colorazione marrone (grado 2), e di colorazione marrone scuro (grado 3). Grado 0 e grado 1 è stato definito come debolmente positivo, grado 2 e grado 3 sono stati definiti come fortemente positivo.
Quantitativa real-time PCR (QRT-PCR)
RNA totale è stato estratto usando il reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) seguendo le istruzioni del produttore. cDNA è stato ottenuto con 1 mg di RNA utilizzando kit di trascrizione inversa System (Promega, Madison, WI, USA) e QRT-PCR è stata effettuata dal kit di base dei reagenti SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Warrington, UK). Primer specifici per TAGLN sono stati i seguenti: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (in alto), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (in basso). Glyceral-deide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stato utilizzato come riferimento endogena. Le sue sequenze sono state 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (in alto), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (in basso). QRT-PCR per la quantificazione dei livelli di mRNA di TAGLN è stato fatto su un ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). I dati sono stati analizzati utilizzando il metodo Ct comparativo. Specificità dei risultanti prodotti di PCR è stata confermata dalla fusione curve.
Western Blot
cellule sono state raccolte e lisate con mammiferi reagente di estrazione di proteine ​​(Pierce, Rockford, IL, USA). concentrazioni di proteine ​​sono stati determinati con un acido bicinconinico (BCA) kit di analisi delle proteine ​​(Pierce, Rockford, IL, USA). I campioni contenenti 50 mg di proteine ​​totali sono stati caricati su ogni corsia di gel di acrilammide al 12% in un apparato minigel (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Le proteine ​​separate sono stati trasferiti in un polivinilidene (PVDF) membrana (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Dopo essere incubate con anticorpo primario (1: 1.000) e l'anticorpo HRP-coniugato secondario (1: 5.000). Sistema, rispettivamente, immunocomplessi sono stati rilevati dal chemiluminescente potenziato (ECL) (Millipore, Bedford, MA, USA)
Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
I livelli di proteina di MMP-2 in supernatanti sono stati misurati da un kit ELISA (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) secondo le istruzioni del produttore
crescita cellulare. saggio
I diversi gruppi di cellule (1 × 10 3) sono state seminate in piastre da 96 pozzetti in triplice copia. Il numero di cellule vitali è stata determinata utilizzando il kit giornaliero cellulare Counting (CCK-8) utilizzando un altamente idrosolubile sale di tetrazolio WST-8 [2- (2-metossi-4- nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolio, sale monosodico] (Dojindo, Giappone). In breve, 20 l di CCK-8 soluzione è stata aggiunta in lastre, assorbanza a 450 nm è stata misurata dopo 4 ore di incubazione.
Valutazione di invasione del tumore e la migrazione
saggio di tumore invasione e la migrazione sono stati eseguiti con il kit invasione QCMTM24-bene (Millipore, Bedford, MA, USA) e il kit di migrazione QCMTM24-bene (Millipore, Bedford, MA, USA) secondo il protocollo fornito dal produttore, rispettivamente. Aggiungere preparati sospensione cellulare MKN-45 (2 × 10 5 cellule /pozzetto) alla camera superiore e aggiungere fibroblasti pre-sospensione (5 × 10 4 cellule /pozzetto in terreno RPMI 1640 contenente 20% FBS) per la camera inferiore. Il TAGLN di alcuni fibroblasti in camere inferiori è stata inibita mediante siRNA 24 ore più tardi. MKN-45 e fibroblasti sono stati co-coltura non contactedly per 48 ore, poi lysised le cellule e determinati valori RFU con un lettore di fluorescenza utilizzando set di filtri 480/520 nm.
TAGLN siRNA
Il software è stato utilizzato Qiagen per la progettazione di sequenze RNAi di targeting TAGLN umana (adesione senza NM_003186.), e la sequenza siRNA con la più alta efficacia putativo (senso: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antisenso: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') è stato sintetizzato da Shanghai GeneChem Co, Ltd. siRNA con la sequenza casuale (senso: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', antisenso: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') contro nessun gene (siRNA gruppo strapazzate) è stato trasfettato come controllo interno. Per gli esperimenti, le cellule sono state trasfettate con il DOTAP liposomiale trasfezione reagente (Roche, Germany). Le cellule sono state seminate a 2 × 10 5 cellule /pozzetto in 6 pozzetti. Dopo 24 ore quando le cellule erano in fase di crescita di registro, 250 ml Opti-MEM mi è stato mescolato con 5 ml di 20 micron siRNA duplex, mentre altri 250 ml Opti-MEM mi è stato separatamente incubato con 11,88 ml di DOTAP liposomi. Le due miscele sono state mescolate delicatamente, e incubate per circa 30 min a temperatura ambiente. Per la trasfezione, l'intera miscela è stata aggiunta a ciascun pozzetto in 1,5 ml di terreno fresco senza antibiotici. La concentrazione finale transfettate di siRNA era 20 nm. Le cellule sono state raccolte per ulteriori test a 24, 48 e 72 ore dopo la trasfezione
. Zimografia Gelatina
I supernatanti di coltura sono state raccolte a 24 ore e mescolato con un tampone di gel (0,5 M Tris-HCl, glicerolo, 10% dodecil solfato di sodio [SDS], β-mercaptoetanolo, e 0,5% blu di bromofenolo). Dieci microgrammi di proteine ​​sono state scattate da separazione SDS-PAGE; i gel SDS-PAGE contenevano 0,1% di gelatina (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Dopo l'elettroforesi, i gel sono stati lavati in 50 mM Tris tampone contenente 2,5% Triton X-100. I gel sono state incubate per altre 24 ore a fluido incubazione (50 mM tampone Tris [pH 7,6], 10 mM CaCl 2, e 200 mM NaCl). I gel sono stati colorati con 0,5% Coomassie blue, bande bianche (72 kDa), su uno sfondo blu indicavano zone della digestione corrispondenti alla presenza di MMP-2.
Modello murino
femmina BALB /c nu /nu
topi nudi, di pari età tra 4-5 settimane (Istituto di Zoologia dell'Accademia cinese delle scienze), sono stati alloggiati in un determinato ambiente privo di agenti patogeni nel reparto di animali da laboratorio, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, in Cina. Fibroblasti e MKN-45 sono stati mescolati nel rapporto di 1: 4 entro 0,1 ml di PBS e iniettati nella vena della coda laterale. Sei topi sono stati inclusi in ciascun gruppo in tutti gli esperimenti, e ogni esperimento è stata eseguita due volte. Gli animali sono stati sacrificati e noduli metastatici polmonari sono stati registrati 6 settimane dopo l'impianto delle cellule tumorali. campioni tumorali sono stati raccolti, mescolato in formalina, inclusi in paraffina, e sottoposti a H & E colorazione. P
< Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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