Stroma-Fibroblasten in der Mikroumgebung von Magenkarzinomen fördern Tumormetastasierung über TAGLN expression

Stroma-Fibroblasten in der Mikroumgebung von Magenkarzinomen fördern Tumormetastasierung über upregulating TAGLN Ausdruck
Zusammenfassung
Hintergrund upregulating
Fibroblasten eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung, Tumor spielen Progression und Metastasierung. Doch ihre detaillierten molekularen Eigenschaften und klinische Bedeutung sind nach wie vor schwer zu fassen. TAGLN ist ein Aktin-bindendes Protein, das eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung spielt.
Ergebnisse
wir die Wechselwirkung zwischen Krebszellen und der Tumor-Mikroumgebung untersucht, um zu bestimmen, wie die Fibroblasten aus menschlichen Magenkarzinom Tumorigenese durch TAGLN erleichtern. QRT-PCR und Western-Blot zeigte, dass TAGLN Expression in Magenkarzinom-assoziierten Fibroblasten upregulated wurde (CAFs), die Magenkrebs Zellmigration und Invasion zu fördern. Mit small interfering RNA (siRNA), fanden wir, dass CAFs Tumormetastasierung verstärkt durch upregulated TAGLN in vitro und in vivo. Die Expression von Matrix-Metalloproteinase-2 (MMP-2) war signifikant niedriger, nachdem TAGLN Knock-down von siRNA. TAGLN Spiegel wurden in der menschlichen Magenkrebs Stroma als normale Magen-Stroma erhöht und mit einer Differenzierung und Lymphknotenmetastasen von Magenkrebs in Verbindung gebracht.
Fazit
CAFs Magenkrebs Zellmigration und Invasion fördern kann über upregulating TAGLN und TAGLN induzierte MMP-2 Produktion.
Schlüsselwörter TAGLN Fibroblast Mikromilieu Tumor Metastasen Magenkarzinom hintergrund und Magenkarzinom ist die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt, vor allem in Asien [1, 2]. Die meisten Patienten mit Magenkrebs starb an Rezidiven von Fernmetastasen verursacht. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, durch den Krebszellen von der primären Neubildung verbreiten und das umgebende Gewebe und Organe eindringen Abstand, Krebszellbewegung beteiligt, intravasation, Beförderung in das Blut oder die Lymphe und Extravasation [3]. Dieser Prozess hängt eng an der umgebenden Mikroumgebung und die Tumorentwicklung beruht auf einem kontinuierlichen Übersprechen zwischen Krebszellen und der extrazellulären Mikroumgebung [4].
Transgelin (TAGLN, die auch als SM22 bekannt) ist ein Aktin Vernetzungs Protein, das beteiligt ist, in Calcium- Wechselwirkungen und reguliert kontraktilen Eigenschaften [5]. Es kann durch die Stabilisierung des Zytoskeletts durch Aktin-Bindung [6, 7] eine Rolle bei der Zelldifferenzierung, Zellmigration und Zellinvasion Matrixumbau spielen. Überexpression von TAGLN Protein wurde in Karzinomen des Magens, der Leber und der Speiseröhre beobachtet, während erniedrigte Spiegel von TAGLN mRNA wurden in Brust- und Darmkrebs Zelllinien und primären Tumoren [8] beobachtet.
Es ist allgemein anerkannt, dass Tumor -stroma Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und Progression. Das Stroma besteht hauptsächlich aus der extrazellulären Matrix (ECM) und die zelluläre Elemente, wie Fibroblasten [9, 10]. Die zellulären Bestandteile des Stroma sind gut anerkannt als eine unterstützende Rolle in der Karzinogenese mit [11, 12]. Diese Stromaelemente wirken in synergistischer Cross-Talk mit Krebszellen aus den primären Standorten Krebswachstum und Metastasierung [13, 14] zu erhalten. Der Tumor-Stroma, die als "reaktive Stroma" bezeichnet wird, ist mit einer erhöhten Anzahl an Fibroblasten, verbessert Kapillardichte und Ablagerung eines neuen ECM reich an Typ-1-Kollagen und Fibrin [15] verbunden. mehr deutet zeigt, dass Stromazellen, wie Fibroblasten einen großen Einfluss auf die Entwicklung und Progression von Karzinomen haben, als bisher angenommen wurde [15-17].
Fibroblasten gut bekannt sind Rollen in tumorigenesis und Progression zu spielen. Fibroblasten exprimieren Vimentin, Fibronectin, α-smooth-muscle actin (α-SMA), Fibroblasten-Oberflächenprotein sowie fibroblastic Marker. Karzinom-assoziierten Fibroblasten (CAFs) sind aktivierte Fibroblasten, biologisch verschieden von Fibroblasten in gutartigen Mikroumgebungen in mehreren wichtigen Aspekten [17, 18]. CAFs sind nicht passive Zuschauer bei der Tumorentstehung und Metastasierung, sondern tragen aktiv zu diesen Prozessen [19]. Unser Wissen über die Rolle des ruhenden und aktivierten Fibroblasten in der Krebstherapie ist noch in der Entwicklung. Hier konzentrieren wir uns auf die Interaktion zwischen Krebszellen und deren Mikroumgebungen zu untersuchen, wie die von menschlichen Magenkarzinomen isoliert Fibroblasten tumorigenesis erleichtern.
Ergebnisse | Die Expression von TAGLN ist upregulated in Magenkarzinom-assoziierten Fibroblasten
Das Karzinom assoziierte Fibroblasten (CAFs), Gegenstück Fibroblasten (CPFs) und normalen Fibroblasten (FNs) wurden aus primären Gewebekultur erhalten Gewebe von Krebs-assoziierten Regionen, nicht-Krebs-assoziierten Stroma und normaler Schleimhaut jeweils unter Verwendung. Wir überprüft dann die Reinheit der verschiedenen Fibroblasten-Populationen von Immunfärbung. Diese Fibroblasten-Populationen exprimiert hohe levls von fibroblastic Marker wie Vimentin, α-SMA und Fibronektin. Auf der anderen Seite, exprimieren diese Zellen nicht epithelialen Marker wie Cytokeratin (1A). Diese Daten bestätigten die Reinheit der fiborblasts. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Kulturzellen wurden vorwiegend Fibroblasten wurden hergestellt mit minimaler Kontaminierung durch andere Zellen. Abbildung 1 die Expression von TAGLN wird bei Magenkrebs-assoziierten Fibroblasten upregulated. A: Charakterisierung von Magen-Fibroblasten (ICC). a1: Vimentin positiv. a2: α-SMA, positiv. a3: Fibronektin, positiv. a4: Cytokeratin negativ. Original-Vergrößerungen: × 200. Maßstabsbalken, 100 &mgr; m. B: QRT-PCR-Analyse von TAGLN in CAF, CPF und NF. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, im Vergleich zu NF. C: Western-Blot-Analyse von TAGLN in CAF, CPF und NF, TAGLN Expressionsniveau wurde nacheinander verringert. D: Fibroblasten Wachstumskurve wurden von CCK-8-Test bestimmt, CAFs wuchs quickier als die anderen. E: CAF hatten höhere Fähigkeit MKN-45 der Migrationsfähigkeit als CPF und NF, *** P <
zu verbessern; 0,001 im Vergleich zu MKN-45. F: CAF hatte höhere Fähigkeit MKN-45 Invasion Fähigkeit als CPF und NF, *, P
<zu verbessern; 0,05, **, P
< 0,01, verglichen mit MKN-45.
Die mRNA und Protein-Ebene von TAGLN niedriger waren in CPFs und FNs verglichen mit CAFs (1B und C). Wir zeigten zunächst, dass CAFs wuchs deutlich mehr als CPFs und FNs in-vitro-Zellproliferation (1D). Als nächstes führten wir Zellinvasion und Migration Assays zu testen, ob die Invasion und Migrationsfähigkeit von Magenkrebszellen durch Fibroblasten verbessert werden würde. Das Experiment wurde entwickelt, um die Auswirkungen von Stroma TAGLN zu untersuchen, die von Fibroblasten, auf die menschliche Magenkrebszellen abgesondert wurde. Die internen Ebenen der TAGLN in Magenkrebszellen könnten die experimentellen Prozess stören. Daher wählten wir MKN-45-Zelllinie, weil seine TAGLN Expressionsniveau am niedrigsten in sieben Magenkrebs-Zelllinien (SNU-1, AGS, NCI-N87, KatoIII, MKN-45, MKN-28 und SGC-7901 war, Daten nicht gezeigt). Interessanterweise stieg die Invasion und Migrationsfähigkeit von MKN-45 in allen drei Gruppen (CAFs, CPFs und NFs) und erhöht die meisten in der Gruppe mit CAF (1E und F). Der Erwerb von Migration und invasive Verhalten ist einer der Schritte in dem metastatischen Prozess.
CAFs Tumormetastasierung fördern durch TAGLN
upregulating die Wirkung von TAGLN in fibrobalsts Um zu untersuchen, verwendeten wir RNAi TAGLN Ausdruck zu klopfen. CAFs, CPFs und FNs wurden mit TAGLN spezifische oder nicht-Stille siRNA transfiziert. RNA und Protein bei 24 erhalten wurden, 48 oder 72 Stunden nach der Transfektion TAGLN mRNA und Protein wurden durch qRT-PCR und Western-Blot untersucht. TAGLN mRNA und Protein signifikant in Zellen gehemmt TAGLN-spezifische siRNA (2A und B), behandelt mit. Abbildung 2 CAFs Tumorzelllinie MKN-45 migraton und Invasion durch upregulated TAGLN verbessern. A: TAGLN Ausdruck von QRT-PCR-Analyse nach siRNA Knockdown in Fibroblasten. B: TAGLN Expression durch Western-Blot-Analyse nach siRNA Knockdown in Fibroblasten. C: Zellmigration Test in vitro (Fibroblasten mit oder ohne TAGLN siRNA-Interferenz). D: Zellinvasion Test in vitro (Fibroblasten mit oder ohne TAGLN siRNA-Interferenz). Die Werte stellen den Mittelwert ± SD aus mindestens drei getrennten Experimenten, die jeweils dreifach durchgeführt. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, ***, P
< 0,001, durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA).
Wir untersuchten als nächstes, ob die Invasion und Migrationsfähigkeit von Magenkrebszellen wird durch die Expression von TAGLN in Fibroblasten verstärkt werden, führten wir Zellinvasion und Migrationstest in vitro aus . Die Fibroblasten und MKN-45 waren nicht contactedly co-kultiviert. Interessanterweise verringerte sich die Invasion und Migrationsfähigkeit von MKN-45 sofort in der Gruppe mit CAFs und verringerte sich leicht in der Gruppe mit CPFs und FNs. Die Ergebnisse zeigten, dass die Invasion und Migrationsfähigkeit von MKN-45 kann durch eine Verringerung der Expression von TAGLN (2C und D) nach unten zu regulieren. Um
den Beitrag von CAFs-TAGLN auf Tumormetastasen in vivo zu beurteilen, wir emplyed ein Xenograftmodell. Wir mischten TAGLN siRNA CAFs, nicht zum Schweigen gebracht CAFs, CPFs und FNs mit MKN-45 menschlichen Magenkrebszellen in einem 2: 1-Verhältnis oder MKN-45 allein und geimpft, diese Zellen durch Schwanz intravenöse Injektion in immundefizienten Nacktmäusen. Nach 6 Wochen MKN-45 gemischt mit CAFs erzeugt mehr Lunge Metastasen Knoten als MKN-45 gemischt mit TAGLN siRNA CAFs, CPFs und FNs, ähnlich wie bei MKN-45 gemischt mit nicht-Stille siRNA CAFs (Tabelle 1). Diese Daten legten nahe, dass CAFs zeigen eine erhöhte Fähigkeit, Tumormetastasierung (3A und B) zu stimulieren. Alle Beobachtungen zeigten, dass in Gegenwart von CAFs wurde Tumoren aggressiver, was darauf hindeutet, dass CAFs Rollen spielen könnten Metastasierung bei Magenkrebs bei der Förderung. Abbildung 3 TAGLN verbessert Tumormetastasierung durch menschliche Tumor Xenograftmodell in vivo. A: Nacktmäuse metastatischen Knötchen in der Lunge. a1: Lunge Metastasen Knoten aus Tomur tragenden Maus. Pfeil: metastatischen Knötchen. a2: keine metastatischen Knötchen in der Lunge. a3: H & E-Färbung für Lunge Metastasen Knötchen unter Hellfeld-Mikroskop. Maßstabsbalken, 200 &mgr; m. a4: H & E-Färbung für Lungen ohne metastatischen Knötchen unter Hellfeld-Mikroskop. Maßstabsbalken, 200 &mgr; m. B: Quantifizierung von Nacktmäusen Lunge Metastasen Knoten in verschiedenen Gruppen durch Schwanz intravenöse Injektion. *, P
< 0,05, durch Einwegvarianzanalyse (ANOVA).
Tabelle 1 Nacktmäuse Lunge Metastasen Knoten in verschiedenen Gruppen durch Schwanz intravenöse Injektion (Jede Gruppe enthielt 6 Mäuse)
Gruppen
TAGLN siRNA CAF -MKN45
nicht-Ruhe siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 allein
Anzahl der tumortragenden Mäuse
2 5
5
3
2 2
Anzahl der metastatischen Knötchen
2

10 9
5
3 2
TAGLN fördert Tumormetastasierung durch upregulating MMP-2
Viele Studien konzentrierten sich auf die Rolle der Matrix (MMPs), um die Invasion der umgebenden Bindegewebe und Metastasierung von Tumorzellen von der primären Läsion zu entfernten Stellen in der Tumorprogression [20, 21]. In unserer bisherigen Arbeit, untersuchten wir MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 und MMP-9-Spiegel nach TAGLN Knock-down von siRNA durch ELISA, nur MMP-2-Ebene war signifikant herunterreguliert, andere MMPs Ebenen zeigte keine Veränderung. Daher focued wir auf MMP-2 in dieser Studie. Wie in Abbildung 4A gezeigt, im Vergleich zu MKN-45 Co-coultured mit CAF /neg und CAF /Mock, MMP-2-Spiegel in Überstand von MKN-45 co-kultiviert mit CAF /siTAGLN signifikant unterdrückt wurden. Als nächstes untersuchten wir die Aktivität von MMP-2 Gelatine-Zymographie Assay. Wir fanden MMP-2-Aktivität dramatisch in Überstand gehemmt wurde von MKN-45 co-kultiviert mit CAF /siTAGLN als mit CAF /neg und CAF /Mock (4B). So TAGLN kann Tumormetastasierung durch die MMP-2-Enzyme bauen die Basalmembran (z. B. Kollagen IV) zu verbessern. Abbildung 4 TAGLN verbessert Tumormetastasierung durch upregulated MMP-2. A: MMP-2-Expression in CAF decresed offensichtlich nach TAGLN RNAi durch ELISA. *, P
< 0,05 durch Einwegvarianzanalyse (ANOVA). Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler um den Mittelwert. B:. TAGLN beeinträchtigt Knockdown die Fähigkeit des CAF zu geheimen MMP-2 durch Gelatinzymographie
TAGLN Expression in menschlichen Magenkrebs und seine Verbindung mit der Differenzierung in Magenkrebs-Patienten
Um die TAGLN Expression in Magenkrebs zu bewerten, TAGLN Immunfärbung in 98 primären wurden Magenkrebsgewebe untersucht. (:; 5B normalen Magen-Gewebe: Magenkrebs Gewebe 5A) TAGLN Expression wurde in menschlichen Magenkrebs Stroma im Vergleich zu normalen Magen-Gewebe nach oben reguliert. Die Korrelation von TAGLN Ausdruck mit den klinisch-pathologischen Eigenschaften in Tabelle 2 TAGLN Werte waren höher in undifferenzierten Tumoren (schlecht differenzierten Adenokarzinomen, Siegelring-Karzinome und muzinöse Karzinome) als in differenzierten (gut und moderate adnocarcinomas) (P gezeigt
= 0,003). Darüber hinaus wurde TAGLN Ebenen mit Lymphknotenmetastasen (P
= 0,029) korreliert. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Tumor TAGLN Ausdruck gemäß den anderen klinisch-pathologischen Eigenschaften wie Geschlecht, Alter, Größe des Tumors, Lauren Einstufung, T-Stadium, Fernmetastasen und TNM-Stadium (P
≥ 0,05). Abbildung 5: Expression von TAGLN in menschlichen Magenkrebsgewebe. A: TAGLN Expressionsniveau in normalen Magen-Gewebe durch IHC. Maßstabsbalken, 100 &mgr; m. B: TAGLN ist im Stroma der menschlichen Magenkrebs durch IHC überexprimiert. Maßstabsbalken, 100 &mgr; m. C: TAGLN mRNA in menschlichen Magenkrebs analysiert durch QRT-PCR nach oben reguliert. D: TAGLN Protein in menschlichen Magenkrebs durch Western-Blot analysiert upregulated. Die Werte stellen den Mittelwert ± SD aus mindestens drei getrennten Experimenten, die jeweils dreifach durchgeführt. *, P
< 0.001 von paried-Proben T
Test.
Tabelle 2 Clinicopathological Vereinigungen von TAGLN Expression in Magenkrebs
Anzahl der Fälle
TAGLN immunostaining
P

Schwach (+)
Strong (++)
Geschlecht
0.778
männlich
60
27
33
Weiblich
38
16
22
Alter
0.739
≤60y
46
21
25
> 60y
52
22
30
Tumorgröße
0.852
≤5 cm
58
25
33
> 5 cm
40
18
22
Differenzierung
0,003
Well + Moderate
46
13
33
Schlechte
52
30
22
Lauren Einstufung
0.059
Intestinale
40
13
27
Diffuse 58
30
28
T-Stadium
0.142
T1 + T2

56
21
35
T3 + 42
T4
22
20
Lymphknotenmetastase
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
Fernmetastasen
0.709
Ohne
95
42
53
Mit
3 seite 1 von 2
TNM-Stadium
0.722
I
20
7
13
II
25
11
14
III
30 10
20
IV
23
15
8 Außerdem haben wir QRT-PCR und Western Blot, der die Expression von TAGLN bei Magenkrebs Gewebe (5C und D) zu bewerten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die TAGLN Expression in Magenkrebsgewebe war viel höher bei Magenkrebs als in gepaart normalen Geweben.
Diskussion
mehr deutet zeigt, dass Krebs Initiierung und Progression beinhalten Wechselwirkungen zwischen den beiden Tumor und Stroma-Zellen. Tumorzellen können aktiv stromalen Zellen, wie vaskulären Zellen, glatten Muskelzellen und Fibroblasten, in den Tumor zu rekrutieren, damit Mikro Erzeugen Tumorwachstum zu fördern [16, 22, 23]. Fibroblasten stellen oft die Mehrheit der Stromazellen in einem Magenkarzinom, noch die funktionellen Beiträge dieser Zellen zu Tumorentstehung und Tumormetastasierung noch schwer.
TAGLN ist einer der frühesten Marker der glatten Muskeldifferenzierung während der Embryonalentwicklung [24], und frühere Studien im Zusammenhang mit TAGLN vor allem auf glatten Muskelzellen konzentriert [25]. Pathologischer Zustände begleitet mit Gewebe-Remodellierung und Fibrogenese, wie Wundheilung und neoplastischen Läsionen sind durch das Auftreten von Stromazellen mit ultrastrukturellen Eigenschaften zwischen denen von typischen Fibroblasten und die von glatten Muskelzellen gekennzeichnet ist. Diese Fibroblasten zeigen phänotypischen und funktionellen Eigenschaften von glatten Muskelzellen und damit genannt Myofibroblasten sind [26], wie CAFs. In unserer Studie wurde TAGLN Überexpression auch CAFs beobachtet. Es wird berichtet, dass das Protein in TAGLN Magenkrebs überexprimiert wird, wenn die Proteinexpression Spektrum von Magenkrebs wurde analysiert unter Verwendung von zweidimensionaler Gelelektrophorese (2-DE) [27]. Darüber hinaus ist die TAGLN Protein eine der beiden tumorassoziierte Antigene, die durch Klade in Serum von Nierenkarzinom-Patienten identifiziert wurden unter Verwendung von 2-DE [28]. Diese Berichte stehen im Einklang mit den Ergebnissen, die wir real-time PCR und Western Blot beobachtet werden. Interessanterweise fanden wir, dass TAGLN hauptsächlich in Fibroblasten von Tumorstroma abgeleitet erkannt wurde, anstatt in Tumorzellen. In ähnlicher Weise entdeckt andere Forscher, dass die TAGLN nicht in die malignen Zellen, jedoch in mesenchymalen Zellen des Tumorstroma exprimiert wird [27].
Stromafibroblasten endotheliale oder epitheliale Zellverhalten durch direkte und indirekte zell cel1 Wechselwirkungen regulieren. Aktivierung von Host stroma1 Mikro wird angenommen, ein kritischer Schritt in der Tumorwachstum und Progression [13, 29]. Proteine ​​abgesondert von Stromazellen in den Tumoren positiv oder negativ Tumorprogression auswirken. Die prominentesten Aktionen von TAGLN kann Tumorzellbeweglichkeit und Invasion [7, 30, 31] begünstigen. Wir fanden, dass die TAGLN deutlich in Lymphknotenmetastasen Gruppe negativen Gruppe als Lymphknoten erhöht wurde. Um die Rolle von TAGLN in Stroma-Fibroblasten bei Magenkrebs Tumorentstehung und Metastasierung c1arify, zum Schweigen gebracht wir die TAGLN Expression in menschlichen CAFs. Es wurde darauf hingewiesen, dass nur die MKN-45 co-kultiviert mit CAFs hohen TAGLN ausdrückt zeigten viel höhere Invasion und Migrationsfähigkeit. Fibroblasten, die TAGLN niedergeschlagen worden war, hatte diese Funktion nicht angezeigt werden soll. Zusammengenommen schlagen wir vor, dass TAGLN könnte zur Verbesserung der Magen-Metastasierung von Krebszellen über Stromazellen wie CAFs verantwortlich.
TAGLN Expression signifikant im Magen CAFs erhöht wird. CAFs mit erhöhter TAGLN Expressionsniveaus können Tumorzellinvasion und Migrationsfähigkeit, die eine verstärkte Expression von MMP-2 fördern verbessern. Die Stimulation der MMP-Expression in Fibroblasten entweder nach dem direkten Kontakt mit Tumorzellen oder nach dem Kontakt mit Tumorzellen stammenden löslichen Faktoren, die von Tumoren von Epithelzellen stamm wurde in mehreren Studien gezeigt worden [32-35]. die zugrunde liegenden Mechanismen Klärende kann den Tumor Rezidiv und Metastasierung in Magenkrebs-Patienten daher dämpfen.
Schlussfolgerungen
Zusammengefasst unsere Studie zeigt, dass CAFs Magenkrebs Zellmigration und Invasion durch erhöhte MMP-2-Produktion durch TAGLN upregulation verursacht fördern kann .
Methoden
Gewebeproben insgesamt 40 Paare von Krebsgewebe
und an der Abteilung normalen Schleimhaut für QRT-PCR und Western-Blot und 98 primären Magenkrebs für Immunfärbung wurden diagnostiziert entsprechenden von chirurgisch entfernt Magenkrebs gesammelt für Chirurgie, Ruijin Krankenhaus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normale Schleimhaut-Proben wurden von dem Rand der Resektion genommen, in dem die Tumoren zumindest mehr als 6 cm von ihm entfernt. Das Studienprotokoll wurde von der unabhängigen Ethik-Kommission des Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine zugelassen. Die Einwilligung wurde geschrieben. Alle Proben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren über Nacht und gehalten bei -80 ° C vor dem Gebrauch. 4% Formaldehyd-fixierten Gewebeschnitten sowohl Tumor und Schleimhaut wurden mit H &gefärbt; E und geprüft und histologisch durch zwei Pathologen überprüft. Jede Probe wurde eine Diagnose zugeschrieben und erzielte für Lauren Klassifikation, Differenzierung, pTNM Bühne. Die Tumorgröße, Standort und andere klinische pathologische Merkmale wurden aus klinischen Aufzeichnungen mit Patienten die Erlaubnis erhalten
Zelllinien
Magenkrebszelllinien SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) und KatoIII (ATCC: HTB-103) wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten. Weitere 3 Magenkrebszelllinien, MKN-45, MKN-28 und SGC-7901 wurden in unserem Institut erhalten. Alle Zellinien wurden in RPMI-1640 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, gehalten.
Antikörper
Primäre Antikörper für die Färbung verwendete menschliche spezifische anti-Vimentin enthalten (Abcam, Cambridge, UK), anti-Fibronectin ( Abcam, Cambridge, UK), Anti-α-smooth-Muskel-Aktin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), Anti-pan-Cytokeratin (Abcam, Cambridge, UK), Anti-SM22 (Abcam, Cambridge, UK) und Maus-anti-GAPDH (Kangchen, China).
Isolierung von menschlichen Magen Fibroblasten
Fibroblasten von Krebs- und nicht-Krebs-assoziierten Regionen von Magengewebe von Patienten mit Magenkrebs bei der radikalischen Magenresektion seziert wurden isoliert aus der Abteilung für Chirurgie, Ruijin Krankenhaus, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. Die Krebs-assoziierten Regionen wurden minimal nekrotische Bereiche der Tumormasse zu sein, ausgewählt. Nicht-Krebs-assoziiertes Stroma, die aus Gewebe mindestens 2 cm distal zum äußeren Rand der Krebsmasse isoliert. Normale Schleimhaut-Proben wurden von dem Rand der Resektion genommen, in dem die Tumoren zumindest mehr als 6 cm von ihm entfernt. Gewebe wurden in Organoiden von etwa 1 mm zerhackt 3 und ausgesät auf unbeschichtetem Kunststoff in RPMI-1640-Medium menschlicher basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 20% fötales Kälberserum (FCS) und Penicillin und Streptomycin als Antibiotika enthielt. Diese Bedingungen produzierten eine homogene fibroblastische Zellpopulation nach 7 Tagen Kultur. 3-Verhältnis von Trypsin-EDTA in 10 cm Petrischalen: Jede Fibroblasten wurde dann mit einer 1 erweitert. Wir haben für bis zu 8 Populationsverdopplungen (PDs) für nachfolgende Experimente agierten Fibroblasten, um klonalen Selektion und Kultur Stress zu minimieren, die wurden während der ausgedehnten Gewebekultur.
Immunhistochemische Färbung (IHC)
Zellen oder Gewebe auftreten könnten fixiert für 30 min mit 4% Formalin und mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült. Nach endogene Peroxidase-Aktivität mit 0,3% H 2 O 2 wurden die Zellen mit normalen nicht immunem Serum blockiert für 30 min vor der für 2 Stunden mit primärem Antikörper bei 37 ° C inkubiert gequencht wurde. Zellen oder Gewebe wurden anschließend mit Streptavidin-Biotin-Meerrettich-Peroxidase-Färbekit (Dako, Carpinteria, CA, USA) markiert. Die Anwesenheit von markiertem Peroxidase auf den Abschnitten wurde durch Inkubation sichtbar gemacht mit 3,3 '- Diaminobenzidin, DAB + Substrat Chromogen und die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Negative Kontrollobjektträger wurden durch Weglassen des primären Antikörpers durchgeführt.
TAGLN-Expression wurde durch die Intensität der gefärbten Zellen beurteilt und in zwei Kategorien bestimmt (schwach positiv und stark positiv). Die Färbungsintensität wurde nach vier Klassen (Intensität Scores) klassifiziert: keine Färbung (Grad 0), hellbraune Färbung (Grad 1), Braunfärbung (Grad 2) und dunkelbraune Färbung (Grad 3). Grad 0 und Klasse 1 als schwach definiert wurde als positiv, Klasse 2 und Klasse 3 als stark positiv definiert wurden.
Quantitative real-time PCR (QRT-PCR)
Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Trizolreagenz extrahiert (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. cDNA wurde mit 1 &mgr; g RNA unter Verwendung von Reverse Transkription-System Kit (Promega, Madison, WI, USA) und QRT-PCR wurde durch die SYBR Green PCR Kern Reagenzienkit (Applied Biosystems, Warrington, UK) durchgeführt wurden. Primer spezifisch für TAGLN waren wie folgt: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (oben), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (unten). Glyceral-aldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als endogene Referenz verwendet. Die Sequenzen waren 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (oben), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (unten). QRT-PCR zur Quantifizierung der mRNA-Spiegel von TAGLN wurde auf einem ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Daten wurden unter Verwendung des Vergleichs Ct-Methode analysiert. Spezifität der resultierenden PCR-Produkte durch Schmelzen Kurven bestätigt wurde.
Western blot
Zellen wurden mit Säugerprotein Extraktionsreagens geerntet und lysiert (Pierce, Rockford, IL, USA). Protein-Konzentrationen wurden mit Bicinchoninsäure (BCA) -Protein-Assay-Kits (Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt. Proben 50 &mgr; g Gesamtprotein enthielten, wurden auf jede Spur von 12% Acrylamid-Gel in einem Minigel-Vorrichtung (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) geladen. Die getrennten Proteine ​​wurden auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) überführt. Nachdem mit dem primären Antikörper inkubiert wurden (1: 1000) und HRP-konjugiertem Sekundärantikörper (1: 5000). Bzw. Immunkomplexe von der verstärkten Chemilumineszenz (ECL) System (Millipore, Bedford, MA, USA) nachgewiesen wurden
Enzyme -verknüpften immunosorbent assay (ELISA), die Proteinspiegel von MMP-2 in den Überständen durch einen ELISA-Kit gemessen (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers
Wachstums Cell. Assay
Die verschiedenen Gruppen von Zellen (1 x 10 3) wurden in 96-Well-Platten in dreifacher Ausfertigung ausgesät. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde bestimmt, täglich die Zellzählung Kit (CCK-8) unter Verwendung von durch die Verwendung eines stark wasserlösliches Tetrazoliumsalz WST-8 [2- (2-methoxy-4- nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, Mononatriumsalz] (Dojindo, Japan). Kurz gesagt wurden 20 &mgr; l von CCK-8-Lösung in Platten gegeben, die Absorption bei 450 nm nach 4 Stunden Inkubation gemessen.
Beurteilung der Tumorinvasion und Migration
Tumorinvasion und Migrationstest wurden mit QCMTM24-well invasion-Kits (Millipore, Bedford, MA, USA) und QCMTM24-Well-Migration-Kit (Millipore, Bedford, MA, USA) gemäß dem Protokoll vom Hersteller vorgesehen. Hinzufügen vorbereitet MKN-45-Zellsuspension (2 x 10 5 Zellen /Vertiefung) in die obere Kammer und fügen vorge suspendierte Fibroblasten (5 × 10 4 Zellen /Vertiefung in RPMI 1640-Medium mit 20% FBS) zu die untere Kammer. Die TAGLN einiger Fibroblasten in der unteren Kammer wurde mit gehemmt später siRNA 24 Stunden. MKN-45 und Fibroblasten für 48 Stunden kokultiviert nicht contactedly waren, lysised dann die Zellen und RFU-Werte mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät bestimmt unter Verwendung von 480/520 nm-Filter-Set. TAGLN siRNA
Die Qiagen-Software verwendet wurde, - 'AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', Antisense-5 : RNAi Zielsequenzen menschlichen TAGLN (. Beitritt kein NM_003186) und die siRNA-Sequenz mit der höchsten mutmaßlichen Wirksamkeit (Sinn zu entwerfen 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') wurde von Shanghai GeneChem Co, Ltd. siRNA mit randomisierten Sequenz (Sinn synthetisiert: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', Antisense: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') gegen keine Gen (verschlüsselten siRNA-Gruppe) wurde als interne Kontrolle transfiziert. Für Experimente wurden die Zellen mit dem DOTAP liposomalen Transfektionsreagenz (Roche, Deutschland) transfiziert. Die Zellen wurden bei 2 × 10 5 Zellen /Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät. Nach 24 Stunden waren, wenn die Zellen in der Phase der log-Wachstums, 250 &mgr; l Opti-MEM I mit 5 ul 20 uM siRNA-Duplex gemischt, während eine andere 250 &mgr; l Opti-MEM I separat mit 11,88 &mgr; l DOTAP Liposomen inkubiert. Die beiden Mischungen wurden sanft gemischt und für etwa 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Transfektion wurde die gesamte Mischung in 1,5 ml frisches Medium zu jeder Vertiefung gegeben, ohne Antibiotika. Die endgültige transfizierten Konzentration von siRNA betrug 20 nM. Die Zellen wurden bei 24, für weitere Assays gesammelt 48 und 72 Stunden nach der Transfektion.
Gelatin Zymographie
Die Kulturüberstände nach 24 Stunden geerntet und mit einem Gel-Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl, Glycerin, 10% Natriumdodecylsulfat [SDS], β-Mercaptoethanol und 0,5% Bromphenolblau). Zehn Mikrogramm Protein wurden durch SDS-PAGE Trennung genommen; die SDS-PAGE-Gele enthielten 0,1% Gelatine (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 50 mM Tris-Puffer, enthaltend 2,5% Triton X-100 gewaschen. Die Gele wurden für weitere 24 Stunden in der Inkubation Flüssigkeit (50 mM Tris-Puffer [pH 7,6], 10 mM CaCl 2 und 200 mM NaCl) inkubiert. Die Gele wurden mit 0,5% Coomassie blau, weiße Bänder (72 kDa) auf einem blauen Hintergrund angezeigt Zonen der Verdauung gefärbt, um das Vorhandensein von MMP-2 entspricht.
Mausmodell
Weibliche BALB /c nu /nu
Nacktmäuse, altersangepassten zwischen 4-5 Wochen (Institut für Zoologie der chinesischen Akademie der Wissenschaften), wurden zu einem bestimmten Pathogen-freie Umgebung in der Animal Laboratory Unit Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, China untergebracht. Fibroblasten und MKN-45 wurden in einem Verhältnis von 1: 4 innerhalb von 0,1 ml PBS und in die laterale Schwanzvene injiziert. Sechs Mäuse wurden in jeder Gruppe in allen Experimenten enthalten, und jedes Experiment wurde zweimal durchgeführt. Die Tiere wurden getötet und Lunge Metastasen Knöllchen wurden 6 Wochen nach der Implantation der Tumorzellen aufgenommen. Tumorproben wurden gesammelt, gemischt in Formalin, in Paraffin eingebettet, und einer H & E-Färbung. P
< Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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