fibroblastos estromais no microambiente de carcinomas gástricos promover metástases tumorais através upregulating TAGLN expression

fibroblastos estromais no microambiente de carcinomas gástricos promover metástases tumorais através upregulating expressão TAGLN
Resumo
fundo
fibroblastos desempenham um papel fundamental na tumorigénese, tumores progressão e metástase. No entanto, as suas características moleculares detalhadas e significado clínico ainda são tímidas. TAGLN é uma proteína que se liga à actina que desempenha um importante papel na tumorigénese.
Resultado
Foi investigada a interacção entre as células cancerosas e o microambiente do tumor para determinar a forma como os fibroblastos a partir de carcinoma gástrico humano facilitar a tumorigénese através TAGLN. QRT-PCR e transferência de Western indicou que a expressão TAGLN foi regulada positivamente em fibroblastos associada a carcinoma gástrico (FAC) que promovem a migração de células de cancro gástrico e invasão. Usando pequeno ARN interferente (siRNA), verificou-se que a metástase tumoral FAC reforçada através TAGLN upregulated in vitro e in vivo. A expressão de metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2) foi significativamente mais baixa depois TAGLN knock-down por siRNA. níveis TAGLN foram elevados no estroma câncer gástrico humano do estroma gástrico normal e associada a diferenciação e linfonodo metástase de câncer gástrico.
Conclusão
FAC podem promover a migração de células de câncer gástrico e invasão via upregulating TAGLN e TAGLN induzida MMP-2 produção.
Palavras-chave
TAGLN de fibroblastos microambiente do tumor metástase de carcinoma gástrico fundo
carcinoma gástrico é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, especialmente na Ásia [1, 2]. A maioria dos pacientes com câncer gástrico morreu de recorrência do tumor causado por metástases à distância. A metástase é um processo multi-etapas através do qual as células cancerosas difundir a partir do tumor primário e invadir o tecido circundante e à distância órgãos, envolvendo a motilidade de células de cancro, intravasamento, trânsito no sangue ou linfa e o extravasamento de [3]. Este processo depende fortemente do microambiente circundante e o desenvolvimento de tumores depende de um cross-talk contínua entre células cancerosas e microambiente extracelular [4].
Transgelin (TAGLN, também conhecido como SM22) é uma proteína de reticulação de actina que está envolvido em interações de cálcio e regula propriedades contráteis [5]. Pode desempenhar um papel na diferenciação celular, invasão celular a migração celular e remodelação da matriz por meio da estabilização do citoesqueleto de actina por meio de ligação [6, 7]. A sobre-expressão da proteína TAGLN tem sido observada em carcinomas do estômago, do fígado, e do esófago, ao passo que diminuiu foram observados níveis de ARNm TAGLN em linhas celulares da mama e cancro do cólon e tumores primários [8].
É geralmente aceite que os tumores interacções -stroma desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão do tumor. O estroma é constituído principalmente de matriz extracelular (ECM) e elementos celulares, tais como fibroblastos [9, 10]. Os componentes celulares do estroma são bem reconhecidos como tendo um papel na carcinogénese de suporte [11, 12]. Estes elementos estromais agir de cross-talk sinérgico com células cancerosas dos sítios primários para sustentar o crescimento e metástase [13, 14] câncer. O estroma do tumor, que é referido como um "estroma reactivo" está associado com um número aumentado de fibroblastos, densidade capilar aumentada e a deposição de uma nova ECM rica em tipo-1-colagénio e fibrina [15]. As evidências acumuladas revela que as células do estroma, tais como os fibroblastos têm uma mais profunda influência no desenvolvimento e progressão do carcinoma do que foi anteriormente apreciado [15-17].
Fibroblastos são bem conhecidos por desempenhar papéis na tumorigénese e progressão. Os fibroblastos expressam vimentina, fibronectina, α actina de músculo liso-(α-SMA), proteína de superfície de fibroblastos, bem como marcadores de fibroblásticos. fibroblastos associados a carcinoma (CAFS) fibroblastos são activados, biologicamente diferentes a partir de fibroblastos presentes no microambiente benignos em vários aspectos importantes [17, 18]. FAC não são espectadores passivos em tumorigênese e metástase, mas contribuir activamente para estes processos [19]. O nosso conhecimento sobre o papel dos fibroblastos repouso e activados no câncer ainda está evoluindo. Aqui, vamos nos concentrar sobre a interacção entre as células cancerosas e seus microambientes para estudar como os fibroblastos isolados de carcinomas gástricos humanos facilitar a tumorigênese.
Resultados
A expressão de TAGLN é regulada em fibroblastos associados a carcinoma gástrico
O carcinoma fibroblastos -associated (CAFS), fibroblastos de contrapartida (CPFs) e fibroblastos normais (NFS) foram obtidos a partir de cultura de tecido primário, utilizando tecidos provenientes de regiões associadas a cancro, estroma não-câncer-associados e mucosa normal, respectivamente. Em seguida, verificou-se a pureza das várias populações de fibroblastos por imunocoloração. Estas populações de fibroblastos expressaram altos levls de marcadores fibroblásticas como vimentina, α-SMA e fibronectina. Por outro lado, estas células não expressam marcadores epiteliais, tais como citoqueratina (Figura 1A). Estes dados confirmaram a pureza dos fiborblasts. Estas observações indicam que as células de cultura foram predominantemente fibroblastos foram preparados com contaminação mínima por outras células. Figura 1 A expressão de TAGLN é regulada em fibroblastos associados ao câncer gástrico. A: caracterização de fibroblastos gástricas (ICC). a1: vimentina, positivo. A2: α-SMA, positivo. A3: fibronectina, positivo. a4: citoqueratina, negativo. ampliações originais: × 200. As barras de escala, de 100? M. B: Análise QRT-PCR de TAGLN em CAF, CPF e NF. *, P Art < 0,05, **, P Art < 0,01, em comparação com NF. C: análise de Western blot de TAGLN em CAF, CPF e NF, nível de expressão TAGLN diminuiu sucessivamente. D: Curva de crescimento de fibroblastos foram determinadas por ensaio de CCK-8, FAC cresceu quickier do que os outros. E: CAF tiveram maior capacidade de aumentar a capacidade de migração de MKN-45 de CPF e NF, ***, P Art < 0,001 em comparação com MKN-45. F: CAF tiveram maior capacidade de aumentar a capacidade de invasão de MKN-45 de CPF e NF, *, P Art < 0,05, **, P Art < 0,01, em comparação com MKN-45.
O ARNm e os níveis proteicos de TAGLN foram menores no CPF e NFS em comparação com FAC (Figura 1B e C). Em primeiro lugar, mostrou que FAC cresceu significativamente mais do que as FN CPF e na proliferação celular in vitro (Figura 1D). Em seguida, realizou-se a invasão de células e ensaio de migração para testar se a capacidade de invasão e migração de células de cancro gástrico seria melhorada por fibroblastos. A experiência foi concebida para investigar os efeitos de TAGLN estroma, que foi segregada por fibroblastos, em células de cancro gástrico humano. Os níveis internos de TAGLN em células de cancro gástrico pode interferir no processo experimental. Assim, optou-linha celular MKN-45, porque o seu nível de expressão TAGLN foi o mais baixo em sete linhas celulares de cancro gástrico (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 e SGC-7901; dados não mostrado). Curiosamente, a capacidade de invasão e migração de MKN-45 aumentou em todos os três grupos (CAFS, CPFs e NFS), e aumentou mais no grupo com a CAF (Figura 1E e F). A aquisição da migração e comportamento invasivo é uma das etapas do processo metastático.
FAC promover metástases tumorais através upregulating TAGLN
Para examinar o efeito do TAGLN em fibrobalsts, usamos RNAi para derrubar expressão TAGLN. CAFS, CPFs e NFS foram transfectadas com específicos de TAGLN ou não-silêncio siRNA. ARN e proteínas foram obtidas a 24, 48 ou 72 horas após a transfecção, o ARNm TAGLN e os níveis de proteína foram investigados por qRT-PCR e transferência de Western. ARNm e proteína TAGLN foram significativamente inibidas em células tratadas com siRNA específico TAGLN-(Figura 2A e B). A Figura 2 FAC melhorar a linha de células de tumor MKN-45 migraton e invasão através TAGLN regulada. A: TAGLN expressão por análise de qRT-PCR após siRNA knockdown em fibroblastos. B: Expressão TAGLN por análise de Western blot após siRNA knockdown em fibroblastos. ensaio de migração celular in vitro (fibroblastos com ou sem interferência TAGLN siARN): C. ensaio de células invasão in vitro (fibroblastos com ou sem interferência TAGLN siRNA): D. Os valores representam a média ± DP a partir de pelo menos três experiências separadas, cada uma realizada em triplicado. *, P Art < 0,05, **, P Art < 0,01, ***, P Art < 0.001, através da análise de uma via de variância (ANOVA).
Nós próxima investigou se a capacidade de invasão e migração de células cancerosas gástricas será reforçada pela expressão de TAGLN em fibroblastos, realizou-se a invasão de células e ensaio de migração in vitro . Os fibroblastos e MKN-45 foram co-cultivadas não contactedly. Curiosamente, a capacidade de invasão e migração de MKN-45 diminuiu de imediato no grupo com FAC e diminuiu ligeiramente no grupo com CPFs e NFS. Os resultados mostraram que a capacidade de invasão e migração de MKN-45 pode diminuir-se através de regulação da expressão de TAGLN (Figura 2C e D).
A fim de avaliar a contribuição de FAC-TAGLN a metástase de tumores in vivo, nós emplyed um modelo de xenotransplante. Nós misturamos TAGLN siRNA FAC, FAC não silenciada, CPFs e NFS com MKN-45 células cancerosas gástricas humanas em uma proporção de 2: 1 ou MKN-45 sozinho e inoculados estas células através de cauda injeção intravenosa em ratinhos nus imunodeficientes. Após 6 semanas, MKN-45 misturado com FAC gerou mais nódulos pulmonares metastáticos do que MKN-45 misturado com TAGLN siRNA FAC, CPFs e NFS, semelhante ao MKN-45 misturado com não-silêncio siRNA FAC (Tabela 1). Estes dados sugerem que o FAC mostram um aumento da capacidade de estimular a metástase do tumor (Figura 3A e B). Todas as observações indicaram que, na presença de FAC, os tumores tornaram-se mais agressivo, o que sugere que FAC pode desempenhar um papel na promoção de metástase do cancro gástrico. Figura 3 TAGLN aumenta a metástase do tumor por meio do modelo de xenoenxerto de tumores humanos in vivo. A: ratinhos nus nódulos metastáticos no pulmão. a1: nódulos pulmonares metastáticos de rato Tomur-rolamento. Arrow: nódulo metastático. A2: nenhum nódulo metastático no pulmão. A3: H & E coloração para Nódulo de pulmão metastático sob o microscópio de campo brilhante. As barras de escala, de 200? M. a4: H & E coloração para pulmão sem nódulo metastático sob o microscópio de campo brilhante. As barras de escala, de 200? M. B: quantificação de ratos nu nódulos pulmonares metastáticas a vários grupos através de cauda injecção intravenosa. *, P Art < 0,05, pelo one-way análise de variância (ANOVA).
Tabela 1 ratos Nude nódulos pulmonares metastáticas a vários grupos através cauda injeção intravenosa (Cada grupo continha 6 ratos)
grupos
TAGLN siRNA CAF -MKN45
não-silêncio siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 sozinho
Número de ratos portadores de tumores
2
5
5 Sims 3 Página 2 Página 2
número de nódulos metastáticos
2
10
9
5 Sims 3 Página 2
TAGLN promove a metástase do tumor por upregulating MMP-2
Muitos estudos têm-se centrado sobre o papel das metaloproteinases da matriz (MMP) à invasão de cercar tecido conjuntivo e a metástase de células tumorais a partir da lesão primária para locais distantes em progressão tumoral [20, 21]. No nosso trabalho anterior, examinámos a MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 e MMP-9 níveis após TAGLN knock-down por ARNsi por meio de ELISA, apenas o nível de MMP-2 foi significativamente regulada para baixo, outras MMPs níveis não mostrou nenhuma mudança. Por isso, nós focued sobre MMP-2 neste estudo. Como a Figura 4A mostrou, em comparação com MKN-45 co-coultured com a CAF /neg e CAF /simulada, os níveis de MMP-2 no sobrenadante de MKN-45 co-cultivadas com CAF /siTAGLN foram significativamente suprimida. A seguir, analisou a actividade da MMP-2 utilizando um ensaio de zimografia de gelatina. Encontramos a atividade da MMP-2 foi drasticamente inibida em sobrenadante de MKN-45 co-cultivadas com CAF /siTAGLN do que com CAF /neg e CAF /simulada (Figura 4B). Assim, pode aumentar TAGLN metástase tumoral através das enzimas MMP-2 degradar as membranas basais (por exemplo colagénio. IV). Figura 4 TAGLN aumenta a metástase do tumor por MMP-2 regulada positivamente. A: a expressão de MMP-2 em CAF decresed obviamente depois TAGLN ARNi por ELISA. *, P Art < 0,05 por one-way análise de variância (ANOVA). As barras de erro representam o erro padrão em relação à média. B:. Knockdown TAGLN prejudicada a capacidade da CAF para segredo MMP-2 por zimografia
expressão TAGLN no cancro gástrico humano e sua associação com a diferenciação em pacientes com câncer gástrico
Para avaliar a expressão TAGLN no câncer gástrico, imunocoloração TAGLN 98 foram examinados em tecidos de cancro gástrico primários. expressão TAGLN foi regulada no estroma câncer gástrico humano em comparação com tecido gástrico normal (Figura 5A: tecido gástrico normal; Figura 5B: tecido de câncer gástrico). A correlação de expressão TAGLN com as características clínico-patológicas foi mostrada na Tabela 2. Os níveis TAGLN foram maiores nos tumores indiferenciados (mal adenocarcinomas diferenciados, carcinomas de células em anel de sinete e carcinomas mucinosos) do que nos mais diferenciados (bem e adnocarcinomas moderados) (P
= 0,003). Além disso, os níveis de TAGLN foi correlacionada com metástases em linfonodos (P
= 0,029). Não houve diferenças significativas na expressão TAGLN tumor de acordo com as outras características clinicopatológicas, tais como sexo, idade, tamanho do tumor, classificação Lauren, estágio T, metástase à distância e estágio TNM (P
≥ 0,05). Figura 5 Expressão de TAGLN em tecidos de cancro gástrico humano. A: nível de expressão TAGLN no tecido gástrico normal IHC. As barras de escala, de 100? M. B: TAGLN é abundante no estroma do cancro gástrico humano por IHC. As barras de escala, de 100? M. C: mRNA TAGLN é regulada no cancro gástrico humano analisado por QRT-PCR. D: proteína TAGLN é regulada positivamente em cancro gástrico humano analisados ​​por Western blot. Os valores representam a média ± DP a partir de pelo menos três experiências separadas, cada uma realizada em triplicado. *, P Art < 0,001 por paried-amostras T
teste.
Tabela 2 associações clínicopatológicos de expressão TAGLN no câncer gástrico
Número de casos
TAGLN imunocoloração
P

fraca (+)
forte (++)
Sexo
0,778
Masculino
60
27
33
Feminino
38
16
22
Idade
0,739
≤60y
46
21
25 Restaurant > 60Y
52
22
30 tamanho
Tumor
0,852
≤5 cm
58
25
33 Restaurant > 5 cm
40
18
22
Diferenciação
0,003
Bem + Moderado
46
13
33
Pobre
52
30
22
classificação Lauren
0,059
intestinal
40
13
27
difusa
58
30
28
T estágio
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
metástases linfonodais
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
metástases à distância
0,709
Sem
95
42
53
Com Sims 3
1 | 2
estágio TNM
0,722
I
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
Além disso, usamos QRT-PCR e Western blot para avaliar a expressão de TAGLN em tecidos com câncer gástrico (Figura 5C e D). Estes resultados sugerem que a expressão TAGLN em tecidos de cancro gástrico foi muito maior no cancro gástrico do que em tecidos normais emparelhadas.
Discussão
Acumulando evidência demonstra que a iniciação e progressão do cancro envolvem interacções entre ambos tumor e células estromais. As células tumorais podem recrutar activamente células estromais, tais como as células vasculares, células do músculo liso e de fibroblastos, para dentro do tumor, gerando assim microambiente para promover o crescimento do tumor [16, 22, 23]. Os fibroblastos frequentemente constituem a maioria das células do estroma dentro de um carcinoma gástrico, ainda as contribuições funcionais destas células para a tumorigénese e metástase tumoral permanecem pouco compreendidos.
TAGLN é um dos primeiros marcadores de diferenciação de músculo liso durante a embriogénese [24], e estudos anteriores relacionados com a TAGLN focada principalmente em células do músculo liso [25]. condições patológicas acompanhadas com remodelação de tecidos e fibrogénese, tais como cicatrização de feridas e lesões neoplásicas, caracterizam-se pelo aparecimento de células do estroma com características ultra-estruturais intermediárias entre aquelas de fibroblastos normais e as de células de músculo liso. Esses fibroblastos apresentam características fenotípicas e funcionais de células musculares lisas e miofibroblastos, portanto, são chamados [26], como a FAC. Em nosso estudo, TAGLN superexpressão também foi observada no FAC. É relatado que a proteína TAGLN é sobre-expresso em cancro gástrico quando espectro de cancro gástrico expressão da proteína foi analisada por meio de electroforese em gel bidimensional (2-DE) [27]. Além disso, a proteína TAGLN é um dos dois antigénios associados a tumores que foram identificados no soro de pacientes com carcinoma renal por Klade utilizando 2-DE [28]. Estes relatórios são consistentes com os resultados que temos observado usando PCR em tempo real e Western Blot. Curiosamente, verificou-se que TAGLN foi detectada principalmente em fibroblastos derivados de estroma do tumor, em vez de em células tumorais. Da mesma forma, outros investigadores descobriram que a TAGLN não é expresso nas células malignas, mas nas células mesenquimais do estroma tumoral [27].
Fibroblastos do estroma regulam endotelial ou o comportamento de células epiteliais através de interacções célula-cel1 directos e indirectos. A activação do microambiente hospedeiro estroma1 é pensado para ser um passo crítico no crescimento do tumor e progressão [13, 29]. As proteínas segregadas por células do estroma nos tumores podem afectar positivamente ou negativamente a progressão do tumor. As acções mais proeminentes de TAGLN pode favorecer a motilidade de células tumorais e invasão de [7, 30, 31]. Descobrimos que o TAGLN foi significativamente aumentada no grupo metástases em linfonodos do grupo negativo linfonodo. Para c1arify o papel de TAGLN em fibroblastos do estroma durante tumorigênese câncer gástrico e metástase, que silenciou a expressão TAGLN na FAC humanos. Foi indicado que somente o co-cultivadas com FAC que expressam TAGLN elevado nível MKN-45 exibiram muito maior capacidade de invasão e migração. Fibroblastos que TAGLN tinham sido derrubados não exibir esta função. Tomados em conjunto, sugerimos que TAGLN pode ser responsável para o reforço da metástase da célula cancerosa gástrica através de células do estroma, como FAC. Expressão
TAGLN é aumentado significativamente nos FAC gástricas. FAC com níveis aumentados de expressão TAGLN pode melhorar a invasão de células tumorais e a capacidade de migração que promovem a expressão aumentada de MMP-2. A estimulação da expressão de MMP em fibroblastos, quer após o contacto directo com as células tumorais ou após o contacto com factores solúveis derivadas de células de tumor a partir de tumores originários a partir de células epiteliais tem sido demonstrado em vários estudos [32-35]. Entender os mecanismos subjacentes pode, portanto, atenuar a recorrência de tumores e metástases em pacientes com câncer gástrico.
Conclusões
Em resumo, nosso estudo demonstra que a FAC pode promover a migração de células de câncer gástrico e invasão via aumento da produção de MMP-2 causado por TAGLN upregulation .
Métodos
amostras de tecido
um total de 40 pares de tecidos de câncer e mucosa normal para QRT-PCR e Western blot e 98 cânceres gástricos primários para imunocoloração correspondentes foram coletadas de câncer gástrico removido cirurgicamente diagnosticados no Departamento de Cirurgia, Hospital Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. amostras de mucosa normal foram tomadas a partir da margem de ressecção onde os tumores localizados, pelo menos, ao longo de 6 cm de distância a partir dele. Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética independente de Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. O consentimento informado foi escrito. Todas as amostras foram congeladas rapidamente em azoto líquido durante a noite e mantidas a -80 ° C antes da utilização. 4% secções de tecido fixadas em formaldeído de ambos tumor e na mucosa foram coradas com H & E e examinada e verificada histologicamente por dois patologistas. Cada espécime foi atribuído um diagnóstico e marcou para a classificação de Lauren, diferenciação, estágio pTNM. O tamanho do tumor, localização e outras características patológicas clínicos foram obtidos a partir de registros clínicos com a permissão do paciente As linhas celulares
linhas celulares de cancro gástrico SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., a AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) e KATOIII (ATCC: HTB-103) foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Outras 3 linhas celulares de cancro gástrico, MKN-45, MKN-28 e SGC-7901, foram preservados no nosso instituto. Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). Os anticorpos

anticorpos primários utilizados para a coloração incluída anti-vimentina humana específica (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronectina ( actina Abcam, Cambridge, UK), anti-α-do músculo liso (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA), anti-pan-citoqueratina (Abcam, Cambridge, UK), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) e mouse anti-GAPDH (Kangchen, China).
Isolamento de fibroblastos humanos gástricas
Os fibroblastos foram isolados a partir de regiões câncer e não-associados ao câncer de tecidos gástricos dissecados de pacientes com câncer gástrico durante a ressecção gástrica radical do Departamento de Cirurgia do Hospital Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. As regiões associadas a cancro, foram seleccionados para ser minimamente regiões necróticas da massa tumoral. -Não-cancro associado estroma, que foi isolado a partir de tecido de pelo menos 2 cm distais à margem exterior da massa do cancro. amostras de mucosa normal foram tomadas a partir da margem de ressecção onde os tumores localizados, pelo menos, ao longo de 6 cm de distância a partir dele. Os tecidos foram cortados em fragmentos de Organóides de aproximadamente 1 mm 3 e semeadas em material plástico não revestido em meio RPMI 1640 contendo factor de crescimento de fibroblastos humano de base, 20% de soro fetal de vitelo (FCS) e penicilina e estreptomicina como antibióticos. Estas condições produziu uma população homogénea de células fibroblásticas após 7 dias de cultura. Cada fibroblastos foi então expandiu-se a uma proporção de 1: 3 de tripsina-EDTA em 10 cm placas de petri. Utilizou-se fibroblastos de subculturas até 8 duplicações da população (PDS) para as experiências subsequentes, a fim de minimizar o stress e selecção clonal de cultura que poderiam ocorrer durante a cultura de tecido estendido.
Coloração imuno-histoquímica (IHC)
células ou tecidos foram fixados durante 30 min com 4% de formalina e enxaguada com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Depois de a actividade da peroxidase endógena foi extinta com 0,3% H 2O 2, as células foram bloqueadas com soro normal de não imune durante 30 min antes de serem incubadas com anticorpo primário a 37 ° C durante 2 horas. As células ou tecidos foram então marcadas com o kit de coloração de peroxidase-estreptavidina-biotina de rábano (Dako, Carpinteria, CA, EUA). A presença de peroxidase nas secções foi visualizada por incubação com 3,3 '- diaminobenzidina, DAB + cromogénio substrato e as secções foram contrastadas com hematoxilina. As lâminas de controlo negativos foram realizados por omissão do anticorpo primário.
TAGLN expressão foi avaliado pela intensidade de células coradas, e determinado de duas categorias (fraco positivo forte e positiva). A intensidade da coloração foi classificada de acordo com quatro graus (escores de intensidade): sem coloração (grau 0), coloração castanho-claro (grau 1), de coloração marrom (grau 2), e de coloração marrom escuro (grau 3). Grau 0 e 1 grau foi definido como positivo fraco, grau 2 e grau 3 foi definida como positiva forte.
Quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)
RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. O ADNc foi obtido com 1? g de ARN utilizando um kit de transcrição reversa do sistema (Promega, Madison, WI, EUA) e QRT-PCR foi realizada pelo kit de reagente núcleo SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Warrington, UK). Primers específicos para TAGLN foram os seguintes: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (superior), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (inferior). Glyceral-dehyde-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado como a referência endógena. Suas sequências foram 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (superior), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (inferior). QRT-PCR para a quantificação dos níveis de ARNm de TAGLN foi feito num ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os dados foram analisados ​​usando o método comparativo Ct. A especificidade dos produtos de PCR resultantes foi confirmada por curvas de fusão.
Western blot
As células foram colhidas e submetidas a lise com reagente de extracção de proteínas de mamíferos (Pierce, Rockford, IL, EUA). As concentrações de proteína foram determinadas com um kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EUA). As amostras contendo 50 ug de proteína total foram carregados em cada faixa de gel de acrilamida a 12% num aparelho de mini-gel (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). Após ser incubada com o anticorpo primário (1: 1000) e o anticorpo secundário conjugado com HRP (1: 5000). Respectivamente, complexos imunitários foram detectados por o sistema quimioluminescente melhorado (ECL) (Millipore, Bedford, MA, EUA)
Enzima -Conectado ensaio imunoabsorvente (ELISA)
os níveis de proteína de MMP-2 nos sobrenadantes foi medida por um kit de ELISA (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante crescimento celular
. ensaio
Os diferentes grupos de células (1 x 10 3) foram semeadas em placas de 96 poços em triplicado. O número de células viáveis ​​foi determinado diariamente utilizando o Kit de contagem celular (CCK-8), utilizando um altamente solúvel em água o sal de tetrazólio WST-8 [2- (2-metoxi-4- nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-dissulfofenil) -2H- tetrazólio, sal monossódico] (Dojindo, Japão). Resumidamente, 20 uL de CCQ-8 foi adicionada solução em placas, a absorvância a 450 nm foi medida após 4 h de incubação.
Análise da invasão tumoral e migração
ensaio de invasão tumoral e migração foram realizadas com o kit de invasão QCMTM24 poços (Millipore, Bedford, MA, EUA) e QCMTM24 bem-kit de migração (Millipore, Bedford, MA, EUA) de acordo com o protocolo proporcionado pelo fabricante, respectivamente. Adicionar suspensão preparada célula MKN-45 (2 × 10 5 células /poço) para a câmara superior e adicionar fibroblastos pré-suspensão (5 × 10 4 células /poço em meio RPMI 1640 contendo 20% de FBS) para a câmara inferior. O TAGLN de alguns fibroblastos em câmaras inferiores foi inibida utilizando ARNsi 24 horas mais tarde. MKN-45 e fibroblastos foram co-cultivados não contactedly por 48 horas, em seguida, lysised as células e determinou valores RFU com um leitor de placas de fluorescência usando conjunto de filtros 480/520 nm.
TAGLN siRNA
O software Qiagen foi utilizado para projetar seqüências de RNAi visando TAGLN humana (acesso NM_003186.) e a sequência de siRNA com a maior eficácia putativa (sentido: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antisense: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') foi sintetizado pela Shanghai GeneChem Co, Ltd. siRNA com sequência aleatória (sentido: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', antisense: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') contra nenhum gene (grupo siRNA mexidos) foi transfectado como controle interno. Para as experiências, as células foram transfectadas com o reagente DOTAP de transfecção lipossómica (Roche, Alemanha). As células foram semeadas a 2 x 10 5 células /poço em placas de 6 poços. Após 24 horas, quando as células estavam em fase de crescimento log, 250 uL de Opti-MEM I foi misturado com 5 uL de 20 uM duplex de ARNip, enquanto outro 250 uL de Opti-MEM I foi incubada separadamente com 11,88 ul de DOTAP lipossoma. As duas misturas foram misturadas suavemente e incubadas durante cerca de 30 min à temperatura ambiente. Para a transfecção, a mistura completa foi adicionada a cada poço em 1,5 ml de meio fresco sem antibiótico. A concentração final transfectadas de ARNip foi de 20 nM. As células foram recolhidas para posterior ensaio a 24, 48 e 72 horas após a transfecção.
Gelatina zimografia
Os sobrenadantes de cultura foram colhidas às 24 horas e misturados com um tampão de amostra de gel (0,5 M de Tris-HCl, glicerol, 10% sulfato de dodecilo e sódio [SDS], β-mercaptoetanol e 0,5% de azul de bromofenol). Dez microgramas de proteína foram tomadas pela separação SDS-PAGE; os géis de SDS-PAGE continha 0,1% de gelatina (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA). Após a electroforese, os géis foram lavadas em tampão Tris 50 mM contendo 2,5% de Triton X-100. Os géis foram incubados durante mais 24 horas em fluido de incubação (50 mM de tampão de Tris [pH 7,6], 10 mM de CaCl 2, e NaCl 200 mM). Os géis foram corados com 0,5% azul de Coomassie, bandas brancas (72 kDa) sobre um fundo azul indicado zonas de digestão correspondentes à presença de MMP-2.

Modelo de ratinho BALB /c nu /nu
ratinhos nus, entre 4-5 semanas (Instituto de Zoologia da Academia chinesa de Ciências) pareados por idade, foram alojados em um ambiente específico isento de agentes patogénicos na Unidade de Laboratório animal, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, na China. Fibroblastos e MKN-45 foram misturados na proporção de 1: 4 de 0,1 ml de PBS e injectada na veia lateral da cauda. Seis ratos foram incluídos em cada grupo em todas as experiências e cada experiência foi realizada duas vezes. Os animais foram sacrificados e os nódulos metastáticos do pulmão foram registadas 6 semanas após a implantação de células de tumor. espécimes de tumor foram recolhidas, misturadas em formalina, embebidos em parafina, e submetido a H & E de coloração. P Art < Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• Co-ocorrência de múltiplos infartos cerebrais devido à hipercoagulabilidade associada à malignidade e carcinomatose meníngea como manifestação inicial do câncer gástrico
• Será que a terapia guiada por tonometria gástrica reduzir a mortalidade total em pacientes criticamente enfermos?