MicroRNA-206 undertrycker magcancer celltillväxt och metastasis

MicroRNA-206 undertrycker magcancer celltillväxt och metastasering Bild Sammanfattning
Gastric cancer är en av de främsta orsakerna till cancerdöd världen och bär en hög grad av metastatisk risk. Utöver andra proteinkodande onkogener och tumörsuppressorgener, mikroRNA spela en viktig roll i gastric cancer tumörframkallande progression. Här visar vi att miR-206 uttrycks vid markant låga nivåer i en kohort av gastriska tumörer jämfört med deras matchande normal vävnad, och i ett antal av gastriska cancercellinjer. Nedreglering av MIR-206 var särskilt signifikant i tumörer med lymfatisk metastas, lokal invasion och avancerad TNM stadieindelning. Vi finner att tvångs uttryck av MIR-206 undertryckte proliferation, kolonibildning och xenograft tumörbildning av SCG-7901 celler, en linje av gastric cancerceller. Tvångs uttryck av MIR-206 undertryckte också SCG-7901 cell migration och invasion, liksom metastaser i cellodling eller svans-ven injiceras musmodeller, respektive. Den antimetastatisk effekt av MIR-206 sannolikt medi genom att rikta metastaser reglerande gener STC2, HDAC4, Klf4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, och K-ras, som var kraftigt nedregleras genom stabilt uttryck av exogen miR -206 i SCG-7901-celler. Tagna tillsammans, våra resultat indikerar att miR-206 är en tumörsuppressor av gastric cancer som agerar vid stegen som reglerar metastas.
Nyckelord
Magcancer miR-206 Metastas Tumör suppressor Inledning
Magcancer (GC) rankar fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen [1]. Prognosen för patienter med avancerad magsäckscancer är dålig, trots den senaste tidens förbättringar i gastriectomy, kemoterapi och strålbehandling [2]. Eftersom GC är en polygen sjukdom som uppstår till följd av flera gen dysregulations, är viktigt för att utveckla nya målinriktade terapier klarlägga reglerande nätverk som styr GC tumörbildning.
Tumörigenes i magen är en flerstegsprocess som innebär genetiska och epigenetiska förändringar av protein kodande samt icke-kodande proto-onkogener och tumörsuppressorgener. Samspelet mellan värd, miljö- och bakteriella faktorer påverkar också de framsteg sjukdomen. Helicobacter pylori
(HP) infektion har etablerats som en viktig riskfaktor för GC; de två histologiska subtyper av magcancer, tarm och diffusa subtyper, är båda förknippade med HP-infektion, vilket bidrar till mer än 80% av fallen [3], särskilt i magcancer antral /body [4]. Mekanistiskt, var HP infektion visade sig orsaka en fördubbling EGF och EGFR i mag antral biopsivävnader, men dess utrotning minskar nivåerna av båda faktorerna till de för kontrollerna [5]. HP-infektion hos patienter med kronisk gastrit är också signifikant associerade med nedreglering av E-cadherin på grund av ökad promotor metylering [6], medan HP utrotning signifikant minskade nivåerna av MMP-9, en metalloproteinas positivt associerade med tumörinvasion och metastas [ ,,,0],7], i antrum och corpus mucosa [8].
Förutom HP-infektion, det finns en mängd orsaker som leder till avvikande genuttryck i magcancer, och mekanismen för magcancer metastaser är mycket komplexa samt . Ras-beroende MAPK signaleringen, som så småningom leder till ökad spridning i magsäckscancer och orsakas främst av avvikelser i K-ras-aktivering, ofta i samband med magcancer tarm-typ [9]. Stanniokalcin 2 (STC2), ett utsöndrat glykoprotein med viktiga funktioner i kalcium och fosfat homeostas, rapporterades uttryckas i höga nivåer cancer gastric vävnader, lymfkörtel metastas, och venös invasion [10]. 5-års överlevnad var signifikant lägre hos patienter med STC2 uttryck jämfört med patienter utan STC2 uttryck [11]. BDNF (Brain-derived neutrophic faktor) uttryck rapporterades visar signifikant ökat uttryck i magcancer vävnad jämfört med intilliggande normal slemhinna, och höga nivåer av BDNF på den invasiva fronten var korrelerad till fartyg invasion, lymfkörtel metastas, peritoneal spridning och dålig prognos i mag cancerpatienter [12]. Trots framstegen i att identifiera de ovannämnda reglerande gener, förblir den exakta underliggande mekanismen som orsakar GC metastaser ännu inte fastställts.
Dysregulations av mikroRNA spelar mycket viktiga roller i tumörbildning. Rollen av mikroRNA i magcancer tumörbildning är väl dokumenterade. Här fokuserar vi på MIR-206, som tillsammans med sina närstående paraloger MIR-1, 133a, och MIR-133b, spelar mycket viktiga roller i muskeldifferentiering. Dessa fyra mikroRNA är mycket konserverade i sekvens och genomisk organisation, och kallas myomiRs eftersom de befanns uttryckas vid höga nivåer i musklerna [13]. MIR-1-1 /MIR-133a-2, MIR-1-2 /MIR-133a-1, och MIR-206 /MIR-133B bildar kluster i tre olika kromosomregioner i det mänskliga genomet 20q13.33, 18q11.2 och 6p12.2, respektive. Emellertid kan dessa miRNA fungera som tumörsuppressorer i olika humana cancerformer [14]; till exempel, var MIR-1 och MIR-133a visat sig vara ofta nedregleras i blåscancer, och undertrycka tumörtillväxt genom att rikta TAGLN2 [15]. MIR-1 och MIR-206 visade sig ha liknande tumör suppressor roller i rabdomyosarkom genom att blockera c-Met uttryck [16]. MIR-206 rapporterades också att fungera som en tumörundertryckare i bröstcancer [17], och lungcancer [18]. Vi rapporterar här att MIR-206 uttryck omvänt samband med lymfatiska metastas, lokal invasion och TNM malignitet iscensättning av GC, och tvinga uttryck av MIR-206 undertrycker GC celltillväxt, tumörbildning och metastas.
Material och metoder
Vävnadsprover prover~~POS=HEADCOMP
Kirurgiskt resekterade human magcancer och angränsande icke-tumörvävnad erhölls från 35 patienter inlagda på avdelningen för Gastrointestinal kirurgi, den Anslutna sjukhuset i Nanjing Medical University (Changzhou Andra folkets sjukhus). Projektet godkändes av forskningsetiska kommittén i Nanjing Medical University, och ett skriftligt godkännande erhölls från varje patient inkluderades i denna studie. Alla vävnadsprover bearbetades för lagring i flytande kväve och H &. E-färgning för patologisk analys
Cellinjer och cellkultur
Human gastriska cancercellinjer SGC-7901, BGC-823, AGS, icke malign gastric cell linje GES-1, och HEK293T celler köptes från cell Resource Center, Shanghai Institute of biokemi och cellbiologi, Chinese Academy of Sciences. Dessa celler upprätthölls i en fuktighetsinkubator vid 37 ° C, 5% CO 2 och SGC-7901, BGC-823, och GES-1-celler odlades i RPMI1640-medium, HEK293T-celler i DMEM, och AGS celler i F12K medium, respektive. Alla odlingsmedia kompletterat med 10% fetalt bovint serum och antibiotika.
RNA-extraktion och kvantitativ realtids-PCR
Totalt RNA från gastriska vävnader eller cellinjer extraherades med användning av Trizol-reagens (TaKaRa) i enlighet med tillverkarens instruktioner. cDNA syntetiserades med PrimeScript RT reagenskit (TaKaRa). Kvantitativ RT-PCR utfördes med en SYBR Förblandning Ex Taq kit (TaKaRa) på en 7500 realtids-PCR-system (ABI) och analyserades med SDS-analys mjukvarupaket (version 2.0.1, Applied Biosystems). PCR-primrar erhölls från Invitrogen, och reaktionen var 95 ° C, 10 min, följt av 40 cykler av 95 ° C 15 sekunder och 60 ° C, 1 min. U6 snRNA användes som en intern kontroll. Resultaten presenterades som faldig förändring, beräknas med hjälp av två - Vector.
△ CT-metoden, och ett förhållande av uttryck i tumörerna i förhållande till normala vävnader mindre än 1,0 ansågs som låg konstruktioner
Pri -miR-206 amplifierades från normalt humant genomiskt DNA genom PCR med användning av primrar: 206-För 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'och 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. PCR-fragmentet infördes i MSCV-P2GM vektor för att generera P2GM-MIR-206. Den tomma P2GM vektorn användes som kontroll.
Cell transfektion
Plasmid transfektion av SGC-7901-celler utfördes med användning av lipofektamin 2000 (Invitrogen), och stabila kloner som bär P2GM-miR-206 eller den tomma vektorn selekterades för puromycin-resistens (10 pg /ml). MIR-206 och negativa kontroll härmar erhölls från Ribobio (Guangzhou, Kina) och transfektion av härmar i SGC-7901 celler gjordes med hjälp Oligofectamine (Invitrogen). Kortfattat, SGC-7901 celler ströks ut en dag tidigare transfekterades med 100 nm av MIR-206 eller styr härmar att nå 50% konfluens. Efter 48 timmar tillsattes cellerna bearbetades för ytterligare analys.
Cellprolifereringsanalys
MTT-analys användes för att uppskatta den proliferativa hastigheten av SGC-7901-celler. I korthet framställdes SGC-7901 celler trypsinzed 2 dagar efter transfektion och såddes vid 2,5 x 10 3 celler per brunn i 96-brunnsplattor. MTT (3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromide) sattes till odlingsmediet vid angivna intervall för xx tim, och absorbansen vid 490 nm mättes med en spektrofotometer. Varje analys utfördes i triplikat och upprepades tre gånger oberoende kolonibildningsanalys.
Stabila SCG-7901 celler som bär miR-206 eller den tomma kontrollen trypsinerades och ströks åter ut på en × 10 3 per brunn i 6 -Jo plattor. Efter 14 dagar i kultur i RPMI1640 kompletterat med 10% FBS ades kolonier fixerades med 3,7% metanol och färgades med 0,1% kristallviolett. Kolonier innehållande minst 50 celler poängsattes. Varje analys utfördes i triplikat.
Flödescytometri
SGC-7901-celler transfekterade med MIR-206 härma eller negativ kontroll trypsinerades och återsuspenderades i 1 x bindningsbuffert vid 1 × 10 6 celler /ml. 100 pl av denna cellsuspension inkuberades med 5 l av FITC-Annexin V och 5 | il propridium jodid (PI) under 15 minuter i mörker. Avslutades reaktionen med tillsats av 400 | j, l 1 x bindningsbuffert och analyserades med (FACSCalibur med hjälp av Cellquest mjukvara (Becton Dickinson). FITC-Annexin V-positiva och PI-negativa celler ansågs som apoptotisk och experimenten utfördes i triplikat.
migration och invasionsanalyser
sårläkningscellmigration bedömdes genom mätning av förflyttning av celler in i ett acellulärt område som skapas genom att skrapa konfluenta cellgräsmattan med en 200 mikroliter pipettspets. den sårtillslutning fotograferades 48 h senare under ett mikroskop. för Transwell migrationsanalyser, 5 x 10 4 celler tillsattes i den övre kammaren av insatsen (BD Science, Sparks, MD, USA), medan 1 x 10 5 celler användes för matrigel invasionsanalyser. i dessa experiment, trypsiniserades cellerna och återsuspenderades i serumfritt medium innan de ympas till den övre kammaren. den fullständiga odlingsmedium innehållande 10% FBS tillsattes i den nedre kammaren. Cellerna inkuberades i en fuktad inkubator vid 37 ° C under 24 h. Cellerna på membranet fixerades, färgades och räknades. Varje experiment utfördes i tre exemplar.
Xenograft tumörmodellen
Ung kvinnlig atymiska nakna möss (6 veckor gamla) köptes från modell Animal Research Center i Nanjing University. Ungefär 1,5 x 10 6 stabila SGC-7901 celler som bär P2GM-MIR-206 eller tom vektor injicerades subkutant i de lägre flankerna 5 nakna möss. Tumörvolymer mättes varje 3 dagar från den sjätte dagen efter injektion och framåt i 24 dagar innan djuren avlivades. Den slutliga volym och vikt mättes efter tumörerna dissekerades. Nakna möss manipuleras och vårdas enligt NIH Animal Care och användning kommittén riktlinjer i Experiment Animal Center medicinska universitetet Nanjing (Nanjing, Jiangsu, provinsen, PR Kina).
Statistisk analys
Statistisk analys utfördes med hjälp av SPSS mjukvarupaketet (SPSS Standard version 16.0, SPSS Inc). Data visades som medelvärde ± SEM. De parade prover t
-test användes vid analysen av differential miR-206 uttryck mellan tumör och normal vävnad. För in vitro och in vivo-experiment, oberoende-prover t
-test användes för att bedöma betydelsen av skillnaden mellan behandlings- och kontrollgrupper. P-värde < 0,05 ansågs som statistiskt signifikant.
Resultat
nedreglering av MIR-206 korrelerar med human magcancer tumörbildning, invasion och metastas
I en genomet bred undersökning för mikroRNA uttryck, vi tidigare identifierat flera medlemmar av den myomiR familjen, nämligen mIR-1 /133a och mIR-133b /206, vars nivåer reducerades i en neuroectodermic cancer (opublicerade resultat). Dessa mikroRNA var främst känd för att fungera i myogenic differentiering och, i mindre grad, tumörgenes av pediatriska cancrar. För att undersöka om dessa myomiRs kan också ha en roll i tumorigensis gemensamma cancer i vuxen har vi granskat deras uttrycksnivåer genom realtids-stam-loop RT PCR kvantifiering i en kohort av nyligen utskurna gastric tumörer och deras matchande normal vävnad, och fann att median förhållandet av mIR-206 i förhållande till U6 snRNA av de 35 tumörerna var 4-faldigt lägre än den för de normala vävnader (Figur 1A). Parvis jämförelse indikerade att mer än 85% av tumörerna visade mer än 2-faldig minskning av MIR-206 uttryck jämfört med deras matchande kontroller med endast två par som visar ökning (Figur 1B). Expression av MIR-206 minskade också i ett antal humana magcancer-cellinjer, inklusive SGC-7901, BGC-823, MGC-803, och AGS celler, jämfört med den i GES-1 normala gastriska celler (Figur 1C). Kliniskt patologiska register över dessa tumörer visade att minskningen av MIR-206 uttryck var signifikant associerad med lymfatiska metastas, lokal invasion och TNM malignitet byggnadsställning, men inte med ålder, kön, tumörens storlek eller lokalisering (tabell 1). Dessa data antyder att MIR-206 normalt kan utöva en hämmande kontroll på gastric tumörbildning, invasion och metastas. Figur 1 sänkta nivåer av MIR-206 uttryck i magcancer vävnader och cellinjer. (A) Fördelning av MIR-206 uttryck i en kohort av 35 humana GC och noncancerous vävnader av QRT-PCR. Den endogena U6-RNA användes som intern kontroll. (B) parvisa jämförelsen av MIR-206 uttryck mellan GC och matchande icke-cancervävnader visar miR-206 uttryck reducerades i 86% (30/35) av provparen. (C) Relativ uttryck av MIR-206 i fyra GC cellinjer och en normal gastric cellinje (GES-1).
Tabell 1 clinicopathologic egenskaperna hos MIR-206
Kategorier
NO. av patienterna
relativa nivåerna av miR-206 (medelvärde ± SEM)
P-värde
Kön
Man
21
0,49 ± 0,07
0,32
Kvinna
14
0,40 ± 0,06
Ålder (år) katalog ≥60
19
0,45 ± 0,05
0,93 Hotel < 60
16
0,46 ± 0,09
Diameter (cm) katalog ≥5
13
0,46 ± 0,09
0,90 Hotel < 5
22
0,45 ± 0,05
plats
USA och proximal tredje
23
0,47 ± 0,06
0,65
Distal tredje
12
0,42 ± 0,07
grad av differentiering
väl och måttligt
12
0,48 ± 0,07
0,70
Dåligt
23
0,44 ± 0,07
lokal invasion
T1 + T2
10
0,65 ± 0,07
0,01
T3 + T4
25
0,37 ± 0,05
Lymfkörtel metastas
NO
14
0,57 ± 0,06
0,04
JA
21
0,38 ± 0,07
TNM stadium
I + II
12
0,60 ± 0,07
0,02
III + IV
23
0,38 ± 0,06
expression av mIR-133a konstaterades också att nedregleras i tumörer genom ovanstående kriterier (Ytterligare fil 1: Figur S1), men uttryck av mIR-1, vars gener är grupperade med de som kodar mIR-133a [14], var inte (Ytterligare fil 2: Figur S2). Sedan miR-206 kodas av en unik gen, var det valdes för ytterligare analys.
MiR-206 inhiberar gastrisk cancercelltillväxt
För att bestämma om miR-206 har benägenheten att undertrycka gastrisk cancer tumorigenes introducerade vi ett syntetiska dubbelsträngade miR-206 härmar, 206mi att förändra nivån av totala miR-206 i SGC-7901 gastric cancerceller, som uttrycker en låg nivå av mIR-206 i förhållande till den i GSE-1 normala kontrollceller (Figur 1C) och övervakas hastigheten av celltillväxt med användning av tetrazoliumfärgämnet, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT). Stam-loop PCR bekräftade förhöjd nivå av MIR-206 i de transfekterade SGC-7901 celler (Figur 2A), och resultaten från MTT-analysen visade att tillväxten av dessa celler minskade markant jämfört med de celler som fick icke- specifika kontroll härmar, mIR-ctrl, över en 5-dagars period (Figur 2B). Vi genererade också en pre-miR-206 uttryckande plasmid i P2GM vektorn, och fluorescens-aktiverad-cell-sortering (FACS) analys visade att långvarig G1-fasen och en förkortad S-fas i P2GM-206 (P206) transfekterad jämfört med den P2GM vektor transfekterade SGC-7901 celler (figur 2C), vilket bekräftar resultatet från ovanstående 206mi härma experiment. Artificiellt öka den totala nivån på MIR-206 med 206 mi resulterade också i en signifikant ökning av apoptos i 48 timmar i SGC-7901 celler under kontroll härmar transfekterade celler bestämt genom flödescytometrisk analys av PI och Annexin V dubbel upptagning (Figur 2D och E). Dessa data indikerar att miR-206 är en potent antiproliferativ regulator av odlade gastriska cancerceller. Figur 2 Tvångs uttryck av MIR-206 hämmar spridningen av SGC-7901 gastric cancerceller. (A) Totala nivåer av MIR-206 i SGC-7901-celler transfekterade med Mir-ctrl eller syntetiska härmar från Mir-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) MTT-analyser för SGC-7901-celler transfekterade med MIR-206 härmar vid en slutlig koncentration av 100 nM. Från och med 24 timmar efter transfektion, var analyserna läsa var 24 timmar för 5 dagar i följd. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM från tre oberoende experiment. (*** P < 0,0001). (C) Ett histogram som visar cellcykelfördelning av SGC-7901-celler transient transfekterade med P2GM-MIR-206 eller P2GM-ctrl (100 nm). Resultaten representerar medelvärdena ± SEM av tre oberoende försök (* P < 0,05). (D) Celler som färgar positivt för Annexin V-FITC och negativa för PI vid 48 h efter transfektion ansågs ha genomgått apoptos. (E) Genomsnittlig apoptotisk hastighet av tre oberoende experiment ± SEM visas (*** P < 0,0001).
MiR-206 inhiberar förankringsberoende gastric cancercellernas tillväxt och xenograft tumörbildning
För att undersöka den långsiktiga effekterna av mIR-206 på celltillväxt och kolonibildning, genererade vi en stabil linje av SGC-7901 celler, P2GM-mIR-206, som uttrycker mIR-206 från en konstitutivt aktiv vektor, MSCV-P2GM, och en rad av tom vektor -carrying celler, P2GM-miRctrl. Först undersökte vi uttrycksnivån för MIR-206 i dessa två stabila cellinjer och fann att MIR-206 dramatiskt upphöjdes i P2GM-MIR-206 stabil cellinje (Figur 3A). Sedan vi analyserat effekten av MIR-206 på förankringsberoende tillväxt genom glest ympning trypsiniserade celler direkt på petriskål och visualisera cellkolonier med kristallviolett färgning efter 14 dagars odling. Resultaten visade att vektorbärande kontroll stabila celler bildas betydligt fler kolonier än Mir-206-uttryckande celler (figur 3B och C). Vi injicerade ytterligare dessa stabila celler subkutant i två bilaterala lägre ryggen på nakna möss, och övervakas tumörtillväxt dagligen. Tjugofyra dagar efter injektionen, var dessa mössen och tumörerna skars ut och vägdes (Figur 3D och E). Resultaten visade att den genomsnittliga volymen av MIR-206-överuttrycker tumörer växte mycket långsammare än kontrolltumörerna och medel slutliga vikten var betydligt mindre än den för kontrollerna (Figur 3F och G). Figur 3 MIR-206 undertrycker förankringsberoende GC celltillväxt och xenograft tumörbildning. (A) expressionsnivån av MIR-206 i P2GM-MIR-206 stabil cellinje och vektorbärande kontroll stabila celler (*** P < 0,0001). (B) Ett tusen stabila SGC-7901 celler av MIR-206 och negativ kontroll ströks ut på 6-brunnars plattor och en kolonibildningsanalys utförs. Representativa resultat av kolonibildning av P2GM-MIR-kontroll, P2GM-MIR-206. (C) Antalet kolonier räknades på den 14: e dagen efter sådd. Stabila SGC-7901 celler av MIR-206 växte till en lägre densitet jämfört med NC. Resultaten representerar medelvärdena ± SEM av tre oberoende försök (** P < 0,01). (D) SGC-7901-celler med stabilt uttryck av MIR-206 eller inte inokulerades subkutant i båda flankerna hos nakna möss (n = 5 per grupp). Representativa fotografier av nakna möss 24 dagar efter ympning visas. (E) Mössen dödades och tumörerna var vägt 24 dagar efter ympning, de xenotransplantat med MIR-206 uttryck var betydligt mindre än kontroll xenotransplantat. (F) visar tumörtillväxtkurvan (* P < 0,05 och ** P < 0,01). (G) Tumörer från varje grupp vägdes omedelbart efter avlägsnande. Den genomsnittliga tumörvikten anges som medelvärde ± SEM (* P < 0,05).
MIR-206 hämmar magcancer cellinvasion och migration
Minskad expression av MIR-206 i lokalt invasiva och metastatiska tumörer (Tabell 1) tyder på att denna mikroRNA kan reglera cellmigrationsprocessen. För att avgöra om detta är fallet, genomförde vi sårläkning och Transwell migrationsanalyser med användning av Mir-206-uttryckande stabila SGC-7901 celler. Resultaten visade att ektopisk överuttryck av MIR-206 orsakade en hämning av cellmigration i SGC-7901 celler som uppenbara i sårläknings analys (figur 4A och B) och analysen transwell cell migration (figur 4C och D). Ektopisk överuttryck av MIR-206 ytterligare hämmade SGC-7901 cellinvasion vilket framgår av Matrigel invasionen analysen (figur 4E och F). Därför, MIR-206 visade en undertryckande fastighet i cancercell migration och invasionsanalyser in vitro. Figur 4 MIR-206 undertrycker GC cellmigration och invasion in vitro. (A) sårläknings analys visade olika cell motilities i MIR-kontroll, MIR-206 celler. Ektopisk expression av MIR-206 inhiberade uppenbarligen migreringen av SGC-7901 celler. (B) visar de statistiska resultaten. Data representerar medelvärdena ± SEM av tre oberoende försök. (** P < 0,01). Överuttryck av MIR-206 signifikant hindras förmågor cellmigration (C) och invasion (E) i MIR-206-uttryckande stabila SGC-7901 celler jämfört med negativ kontroll. (D, F) visar de statistiska resultaten respektive. Data representerar medelvärdena ± SEM av tre oberoende försök. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MIR-206 hämmar levermetastaser av GC in vivo
För att undersöka effekten av MIR-206 på metastaser in vivo, genomförde vi svans -vein injektion av P2GM-mIR-206 och enbart vektor P2GM celler med nakna möss, 42 dagar efter injektion, vi skördas och fotograferade lever (figur 5A, övre paneler). H & E-färgning av vävnadssektioner indikerade en 7-faldigt lägre antal metastatiska tumör noduler per ytenhet i levern som injicerats med P2GM-miR-206-celler än de som injicerats med P2GM kontrollceller (fig 5A, lägre paneler och B). Dessutom de storlekar av tumör knutor i P2GM-miR-206-cell-injicerade levrar var mycket mindre än de i kontrollgruppen (figur 5A). Detta resultat talar starkt att MIR-206 normalt kan ha en tumörsuppressor roll att förebygga metastas av gastric cancerceller. Figur 5 MIR-206 hämmar levermetastaser av GC in vivo. (A) Representativa makroskopiska bilder av muslever, 42 dagar efter ympning, (Den övre). Representativa fotografier av H & E färgade spontana levermetastaser. Förstoring: 10 × (Den lägre). Resultaten visar att tumör knutor i P2GM-miR-206-gruppen var mindre och färre jämfört med kontrollgruppen. (B) Antal levermetastaserande loci räknades och jämfördes mellan möss med SGC-7901 vektorkontrollceller och SGC-7901 celler som uttrycker miR-206. Data representerar medelvärden ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) Relativ mRNA-nivå av förmodade mål för MIR-206 mellan SGC-7901-MIR-P2GM och SGC-7901-MIR-206 celler. (D) Den relativa mRNA-nivå av förmodade mål för MIR-206 mellan GES-1 och SGC-7901 cellinjer.
Att bestämma den mekanism genom vilken MIR-206 utövar sin anti-metastaserande roll, vi sökte möjligt MIR 206 målgener genom att använda en kombination av online microRNA Målfångnings- verktyg och korsreferenser de resulterande kandidater till de som har rapporterats spela en roll i metastas. I en pool av 20 av sådana gener, fann vi nio av dem (Ytterligare fil 3: Tabell S1), nämligen STC2, HDAC4, Klf4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, och K-ras, har drastiskt nedregleras av mIR-206 i P2GM-mIR-206 stabila celler jämfört med deras respektive nivåer i P2GM vektor stabila celler (Figur 5C). Några av dessa MIR-206 målgener var markant uppregleras i föräldra SCG-7901 GC tumörceller jämfört med normala gastric GES-1-celler (Figur 5D), vilket tyder på en sannolik orsaks händelse. Således, MIR-206 hämmar sannolikt metastas GC tumörceller genom ett nätverk av reglerande gener.
Diskussion
Även dysreglering av miRNA rapporterades i olika typer av humana cancerformer [19], avvikande uttryck och potentiella roll miRNA i gastric cancer har understudied. Här visar vi att miR-206 ofta nedregleras i humana gastric cancer och cancercellinjer. I ljuset av den reducerade miR-206 expression rapporterats i flera typer av tumörer, våra resultat tyder på att en minskning av MIR-206 expression är sannolikt en förutsättning händelse i tumörgenes. Detta krav blev ännu mer relevant när vi funnit att låga nivåer av MIR-206 var signifikant associerade med lymfatiska metastas, lokal invasion och TNM stadium. Denna uppfattning bekräftades av resultaten av ektopisk expression av MIR-206 i GC cancer cellinje SCG-7901, som visade att MIR-206 undertryckta GC celltillväxt, kolonibildning, invasion, och migration. Slutligen, förmågan hos MIR-206 för att undertrycka metastas av SCG-7901 celler i levern som en tydlig förklaring till sambandet mellan låga nivåer av MIR-206 och invasiva och magsäckscancer. Nyligen STC2 identifierades som en förutsägande markör för lymfkörtel metastas i esofagus skivepitelcancer [20]. Expression av TrkB och BDNF förknippas med dålig prognos i NSCLC patienter [21]. Flera studier har rapporterat att IGF1R uttryck förhöjd i metastaserande prostatacancer och hormon motstånd progression [22, 23]. BCL2 uttryck i primär prostatacancer är en markör för dålig prognos, med en ökad risk för återfall [24]. Vad som sägs ovan tyder på en gemensam onkogen roll i human cancer. Ytterligare vi identifierat STC2, HDAC4, Klf4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF och K-ras som förmodade funktionella mål för MIR-206, som en del av dem talade ovan. Sammantaget våra resultat tyder på en tumörsuppressor roll miR-206 i human magcancer
Bevis på MIR-206 som en tumörtillväxt dämpare har rapporterats i flera cancerformer. MIR-206 hittades först att nedregleras i ERalpha -positiva humana bröstcancervävnader och införande av mIR-206 i östrogenberoende MCF-7 bröstcancerceller hämmar celltillväxt på ett dos- och tidsberoende sätt [25]. Dessutom miR-206 skulle kunna främja myogenic differentiering och blockera tumörtillväxt hos xenotransplanterat möss genom nedreglering av produkten av MET proto-onkogenen: Met tyrosin-kinasreceptor [26]. Yan fann också att hämning av MIR-206 funktion skulle kunna bidra till avvikande celltillväxt och migration, vilket leder till rabdomyosarkom utveckling genom undertryckande av C-Met [16]. Samtidigt miR-206 kan användas för att hämma HeLa cell migration och fokusera bildning genom att hämma både Notch3 protein och mRNA [27]. Vidare miR-206 nedregleras i hög metastaser lungcancer jämfört med låga metastas tumörer och normala lungvävnader, överuttryck av MIR-206 inhiberade migration och invasion av lungcancerceller [18]. MIR-206 uttryck minskade östrogenreceptor-α (ERa) -positiv endometrial endometrioid adenokarcinom (EEG) och dess överuttryck hämmade ERa-beroende proliferation, nedsatt invasiv och inducerade cellcykelstopp av ERa-positiva EEG cellinjer [28]. Alla dessa fynd antydde att MIR-206 kan spela en tumörsuppressor roll i olika cancerformer.
Metastaser bidrar till de flesta cancerrelaterade dödsfall. GC rankas som den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i hela världen på grund av sin höga metastaser, inklusive lymfkörtlar, bukhinnan, lever etc. Särskilt 5-års överlevnad på gastric tumör med levermetastaser inte överstiger 10% och medianen överlevnad utan behandling är ungefär 3 till 5 månader [29]. Flera gener spelat en central roll i GC metastaser: såsom överuttryck av insulinliknande tillväxtfaktorreceptor-I (IGF-IR) och aktivering av dess signaleringsvägar både spela avgörande roller i utvecklingen och utvecklingen av magcancer. Knackar ner av Spl uttryck genom små hämmande RNA lett till minskad IGFIR uttryck och försvagade tillväxt och metastasering av gastric cancerceller [30], annars kan IGF1R att nedregleras av MIR-7 och minskade signifikant migration GC cell och invasion [31]. Adachi fann att blockad av IGF-IR är involverad i undertryckande av cancercellinvasion genom nedreglering av matrilysin [32]. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Endothelial lipasproteinet lovande urin biomarkör för diagnos av magcancer
• Betydelsen av lockbete receptor 3 (DcR3) och extern signal regleras kinas 1/2 (ERK1 /2) i magcancer