MikroRNA-206 undertrykker magekreft cellevekst og metastasis

mikroRNA-206 undertrykker magekreft cellevekst og metastase
Abstract
Magekreft er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis og har en høy grad av metastatisk risiko. I tillegg til andre protein-kodende onkogener og tumorsuppressorgener, microRNAs spiller en viktig rolle i magekreft tumorigen progresjon. Her viser vi at MIR-206 uttrykkes ved markert lave nivåer i en kohort av gastrisk tumorer sammenlignet med deres samsvarende normale vev, og i et antall av magecancercellelinjer. Nedregulering av MIR-206 var spesielt viktig i svulster med lymfatisk metastase, lokal invasjon, og avansert TNM staging. Vi finner at tvang uttrykk for MIR-206 trykt spredning, koloni-formasjon, og xenograft tumorigenesis av SCG-7901 celler, en linje av mage kreftceller. Tvunget ekspresjon av MIR-206 også undertrykkes SCG-7901 cellemigrering og invasjon, så vel som metastaser i cellekultur eller halevene injisert musemodeller, respektivt. Den anti-metastatisk effekt av MIR-206 er sannsynligvis mediert ved å målrette metastase regulatoriske gener STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, og K-ras, som var drastisk nedregulert med stabile uttrykk for eksogene MIR -206 i SCG-7901 celler. Til sammen våre resultater tyder på at MIR-206 er en tumor suppressor av magekreft opptrer på tiltak som regulerer metastase.
Nøkkelord
Magekreft MIR-206 Metastase Tumor suppressor Innledning
Magekreft (GC) rangerer fjerde vanligste kreft og den nest største årsaken til kreft-dødsfall på verdensbasis [1]. Prognosen for pasienter med avansert magekreft er dårlig, til tross for de siste forbedringer i gastriectomy, kjemoterapi og strålebehandling [2]. Siden GC er en polygenic sykdom som oppstår som følge av flere genet dysreguleringer, klarlegging av regulatoriske nettverk styrende GC tumorigenesis er avgjørende for utvikling av nye målrettede behandlingsformer.
Tumorigenesis i magen er en flertrinnsprosess som innebærer genetiske og epigenetiske endringer av protein kodende så vel som ikke-kodende proto-onkogener og tumor-suppressor-gener. Interaksjoner mellom vert, miljø- og bakterielle faktorer påvirker også sykdommen fremgang. Helicobacter pylori product: (HP) infeksjon er etablert som en viktig risikofaktor for GC; de to histologiske subtyper av magekreft, intestinal og diffuse subtyper, er begge forbundet med HP-infeksjon, noe som bidrar til mer enn 80% av tilfellene [3], spesielt i antral /body magekreft [4]. Mekanistisk ble HP infeksjon funnet å forårsake en dobling av EGF og EGFR i gastrisk antrum biopsi vev, men dens utrydding reduserer nivåene av begge faktorer til de av kontrollene [5]. HP-infeksjon hos pasienter med kronisk gastritt er også signifikant assosiert med nedregulering av E-cadherin på grunn av økt promoter metylering [6], mens utrydding HP betydelig redusert nivåene av MMP-9, en metalloproteinase positivt assosiert med tumorinvasjon og metastase [ ,,,0],7], i antrum og corpus mukosa [8].
i tillegg til HP-infeksjon, er det et mangfold av årsaker som fører til avvikende genekspresjon i magekreft, og mekanismen for magekreft metastase er meget komplisert, så vel . Ras-avhengige MAPK signalering, som til slutt fører til økt proliferasjon i magekreft og er hovedsakelig forårsaket av aberrasjoner av K-ras-aktivering, er ofte knyttet til intestinal-type magekreft [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), et utskilt glykoprotein med viktige funksjoner i kalsium- og fosfat homeostase, ble rapportert å bli uttrykt i høye nivåer kreft gastrisk vev, lymfeknutemetastase og invasjon venøs [10]. Den 5-års overlevelse var signifikant lavere hos pasienter med STC2 uttrykk sammenlignet med pasienter uten STC2 uttrykk [11]. BDNF (Brain-avledet neutrophic faktor) ekspresjon ble rapportert å vise signifikant økt ekspresjon i magekreft vev sammenlignet med tilstøtende normal slimhinne, og høye nivåer av BDNF på invasiv fremre ble korrelert til fartøyet invasjon, lymfeknutemetastase, peritoneal formidling, og dårlig prognose i mage kreftpasienter [12]. Til tross for fremskritt i å identifisere de ovennevnte regulatoriske gener, forblir nøyaktige underliggende mekanisme som forårsaker GC metastase fremdeles skal bestemmes.
Dysreguleringer av microRNAs spille viktige roller i tumorgenese. Rollen til microRNAs i magekreft tumorigenesis har vært godt dokumentert. Her fokuserer vi på MIR-206, som sammen med sine nærstående paraloger Mir-1, 133a, og MIR-133b, spiller svært viktige roller i muskel differensiering. Disse fire microRNAs er høyt konservert i sekvens og genomisk organisering, og kalles myomiRs fordi de ble funnet å bli uttrykt i høye nivåer i muskler [13]. MiR-1-1 /MIR-133a-2, MIR-1-2 /MIR-133a-en, og MIR-206 /MIR-133b danner klynger i tre forskjellige kromosomale regioner i det menneskelige genom 20q13.33, 18q11.2 og 6p12.2, respektivt. Imidlertid kan disse mirnas fungere som tumor-suppressorer i forskjellige humane cancere [14]; for eksempel, ble Mir-1 og MIR-133a funnet å være ofte nedregulert i blærekreft, og undertrykke tumorvekst ved å målrette TAGLN2 [15]. MiR-1 og MIR-206 ble vist å ha lignende tumor-suppressor roller i rabdomyosakrom gjennom blokkering c-Met uttrykk [16]. MiR-206 ble også rapportert å virke som en tumor-suppressor ved brystkreft [17], og lungekreft [18]. Vi rapporterer her at Mir-206 uttrykk er omvendt assosiert med lymfatisk metastase, lokal invasjon, og TNM malignitet iscenesettelsen av GC, og tvinge uttrykk for MIR-206 undertrykker GC cellevekst, tumorigenesis, og metastasering.
Materialer og metoder
Vevsprøver
Kirurgisk resected human magekreft og tilstøtende ikke-tumorvev ble oppnådd fra 35 pasienter innlagt ved Institutt for Gastrointestinal kirurgi, det Affiliated Hospital of Nanjing Medical University (Changzhou Second Folkets sykehus). Prosjektet ble godkjent av forskningsetiske komité for Nanjing Medical University, og en skriftlig samtykke ble innhentet fra hver pasient innrullert i denne studien. Alle vevsprøver ble bearbeidet for lagring i flytende nitrogen og H &. E farging for patologisk analyse
Cellelinjer og cellekultur
menneske gastrisk cancer-cellelinjer SGC-7901, BGC-823, AGS, ikke-ondartet celle gastrisk linje GES-en, og HEK293T celler ble kjøpt fra Cell Resource Center, Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Disse cellene ble holdt i et fuktighetsinkubator ved 37 ° C, 5% CO 2 og SGC-7901, BGC-823, og GES-1 celler ble dyrket i RPMI1640 medium, HEK293T celler i DMEM, og AGS celler i F12K medium, respektivt. Alle dyrkningsmedier ble supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika.
RNA-ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR
Total RNA fra gastrisk vev eller cellelinjer ble ekstrahert ved bruk av Trizol reagens (Takara) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert med PrimeScript RT reagenssett (Takara). Kvantitativ RT-PCR ble utført med en SYBR Premiks Ex Taq sett (Takara) på en 7500 sanntids-PCR-system (ABI) og analysert med SDS-analyse programvarepakken (versjon 2.0.1, Applied Biosystems). PCR-primere ble oppnådd fra Invitrogen, og reaksjonen var 95 ° C, 10 min, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C, 1 min. U6 snRNA ble anvendt som en intern kontroll. Resultatene ble presentert som fold endring, beregnes ved hjelp av to -. △ CT-metoden, og et forhold mellom uttrykk i svulstene i forhold til normalt vev mindre enn 1.0 ble ansett som lav
Vector konstruerer
Pri -miR-206 ble amplifisert fra normalt humant genomisk DNA ved PCR ved bruk av primerne: 206-For 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'og 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. PCR-fragmentet ble satt inn i MSCV-P2GM vektor for å danne P2GM-MIR-206. Den tomme P2GM vektor ble anvendt som kontroll.
Cell transfeksjon
Plasmid transfeksjon av SGC-7901-celler ble utført ved anvendelse av lipofektamin 2000 (Invitrogen), og stabile kloner som bærer P2GM-MIR-206 eller den tomme vektoren ble utvalgt for puromycin motstand (10 ug /ml). MiR-206 og negative kontrollligner ble hentet fra Ribobio (Guangzhou, Kina) og transfeksjon av ligner i SGC-7901-celler ble gjort ved hjelp av Oligofectamine (Invitrogen). Kort, SGC-7901 celler sådd ut en dag tidligere ble transfektert med 100 nm fra Mir-206 eller kontrollligner på å nå 50% samløpet. Etter 48 timer ble cellene behandlet for videre analyse.
Celleproliferasjonsanalyse
MTT-analysen ble brukt til å estimere den proliferative hastighet på SGC-7901-celler. Kort sagt ble SGC-7901-celler trypsinzed 2 dager etter transfeksjon og reseeded ved 2,5 x 10 3-celler per brønn i 96-brønners plater. MTT (3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromide) ble tilsatt til kulturmediet ved angitte intervaller for xx timer, og absorbansen ved 490 nm ble målt med et spektrofotometer. Hver analyse ble utført i tre paralleller og gjentatt tre ganger uavhengig Colony formasjon analysen.
Stabile SCG-7901 celler som bærer MIR-206 eller den tomme kontroll ble trypsinert og replated på 1 × 10 3 per brønn i 6 -vel platene. Etter 14 dager i kultur i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, ble kolonier fiksert med 3,7% metanol og farget med 0,1% krystallfiolett. Kolonier som inneholder minst 50 celler ble scoret. Hver analyse ble utført i triplikater.
Strømningscytometri
SGC-7901-celler transfektert med MIR-206 etterligne eller negativ kontroll ble trypsinisert og resuspendert i 1 x bindingsbuffer ved 1 x 10 6 celler /ml. 100 ul av denne cellesuspensjon ble inkubert med 5 l av FITC-Annexin V og 5 ul propridium jodid (PI) i 15 minutter i mørket. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 400 pl 1 x bindingsbuffer og analysert med (FACSCalibur ved hjelp av Cellquest-programvare (Becton Dickinson). FITC-annexin-V-positive og PI-negative celler ble betraktet som apoptotiske og eksperimentene ble utført i triplicates.
migrasjon og invasjon analyser
sårtilheling cellemigrasjon ble vurdert ved å måle bevegelse av celler i en acellulær område opprettet av skraping konfluent celle plenen med en 200 mL pipette. såret lukking ble fotografert 48 timer senere under et mikroskop. for Transwell migrasjon analyser, 5 × 10 4 celler ble lagt inn i det øvre kammer av innsatsen (BD Science, Sparks, MD, USA), mens 1 × 10 5 celler ble brukt for matrigel invasjons analyser. i disse eksperimentene ble cellene trypsinisert og resuspendert i serumfritt medium før de ble sådd i det øvre kammer. det fullstendige kulturmedium inneholdende 10% FBS ble tilsatt i det nedre kammeret. Cellene ble inkubert i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 24 timer. Cellene på membranen ble fiksert, farget og tellet. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller.
Xenotransplantat tumormodell
Young kvinnelige atymiske nakne mus (6 uker gammel) ble kjøpt fra Model Animal Research Center of Nanjing University. Omtrent 1,5 × 10 6 stabile SGC-7901 celler som bærer P2GM-MIR-206 eller tom vektor ble injisert subkutant i de lavere flankene av 5 nakne mus. Tumorvolumene ble målt etter 3 dager fra den sjette dag etter injeksjonen videre i 24 dager før dyrene ble avlivet. Det endelige volumet og vekten ble målt etter tumorene ble dissekert. Nude mus ble manipulert og omsorg i henhold til NIH Animal Care og bruk komité retningslinjer i Experiment Animal Center ved Nanjing Medical University (Nanjing, Jiangsu, provinsen, Kina).
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS programvarepakken (SPSS Standard versjon 16.0, SPSS Inc). Data ble vist som gjennomsnitt ± SEM. Sammenkoblede-samples t
-test ble brukt i analysen av differensial Mir-206 uttrykk mellom tumor og normalt vev. For in vitro og in vivo forsøk, uavhengig prøver t
-test ble anvendt for å vurdere betydningen av forskjellen mellom behandlings- og kontrollgruppene. P-verdi < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
nedregulering av MIR-206 korrelerer med menneskelig magekreft tumorigenesis, invasjon og metastase
I et genom bred undersøkelse for mikroRNA uttrykk, vi tidligere identifisert flere medlemmer av den myomiR familien, nemlig MIR-1 /133a og MIR-133b /206, som ble redusert i en neuroectodermic kreft (upubliserte resultater). Disse microRNAs ble først og fremst er kjent for å fungere i myogenic differensiering og, i mindre grad, den tumorigenesis av pediatriske kreft. For å undersøke om disse myomiRs kan også ha en rolle i tumorigensis av vanligste kreftformene i den voksne, vi undersøkte deres uttrykk nivåer av sanntids stem-loop RT PCR kvantifisering i en kohort av fersk resected mage svulster og deres matchende normalt vev, og funnet at median forholdet mellom MIR-206 i forhold til U6 snRNA av de 35 svulstene var fire ganger lavere enn for de normale vev (figur 1A). Parvis sammenligning viste at over 85% av tumorer viste mer enn to gangers reduksjon av MIR-206 uttrykk i forhold til sine samsvarende kontroller, med bare to par som viser økning (figur 1B). Uttrykk av MIR-206 ble også redusert i en rekke menneskelige mage kreft cellelinjer, inkludert SGC-7901, BGC-823, MGC-803, og AGS celler, sammenlignet med i GES-1 normale mage celler (figur 1C). Clinicopathological registreringer av disse svulstene viste at reduksjonen av MIR-206 uttrykk var signifikant assosiert med lymfatisk metastase, lokal invasjon, og TNM malignitet staging, men ikke med alder, kjønn, tumor størrelse eller plassering (tabell 1). Disse dataene antyder at MIR-206 normalt kan utøve en hemmende kontroll på mage tumorigenesis, invasjon og metastasering. Figur 1 Redusert nivåer av Mir-206 uttrykk i mage kreft vev og cellelinjer. (A) Fordeling av Mir-206 uttrykk i en kohort av 35 menneske GC og noncancerous vev ved QRT-PCR. Den endogene U6 RNA ble benyttet som intern kontroll. (B) parvise sammenligningen av Mir-206 uttrykk mellom GC og matchende ikke-kreft vev viser Mir-206 uttrykk ble redusert i 86% (30/35) av prøve parene. (C) Relativ ekspresjon av MIR-206 i fire GC cellelinjer og en normal gastrisk cellelinje (GES-1).
Tabell 1 Clinicopathologic egenskapene til MIR-206
kategorier
NR. av pasientene
relative nivåer av MIR-206 (gjennomsnitt ± SEM)
P-verdi
Kjønn
Mann fra 21
0,49 ± 0,07
0,32
Kvinne
14
0,40 ± 0,06
Alder (år)
≥60
19
0,45 ± 0,05
0,93
< 60
16
0,46 ± 0,09
Diameter (cm)
≥5
13
0,46 ± 0,09
0,90
< 5
22
0,45 ± 0,05
beliggenhet
Middle og proksimale tredjedel
23
0,47 ± 0,06
0,65
Distal tredje
12
0,42 ± 0,07
grad av differensiering
godt og moderat
12
0,48 ± 0,07
0,70
Dårlig
23
0,44 ± 0,07
Lokal invasjon
T1 + T2
10
0,65 ± 0,07
0,01
T3 + T4
25
0,37 ± 0,05
lymfeknutemetastaser
NO
14
0,57 ± 0,06
0,04
JA
21
0,38 ± 0,07
TNM stadium
I + II
12
0,60 ± 0,07
0,02
III + IV
23
0,38 ± 0,06
Expression of Mir-133a ble også funnet å være nedregulert i svulster ved de ovennevnte kriteriene (Tilleggs fil 1: Figur S1), men uttrykk for MIR-en, hvis gener er gruppert med de koding MIR-133a [14], var ikke (tilleggsfiler 2: Figur S2). Siden MIR-206 er kodet av et unikt gen, ble det valgt for videre analyse.
MiR-206 hemmer magekreft cellevekst
å finne ut om MIR-206 har tilbøyelighet til å undertrykke magekreft tumorigenesis, vi innført en syntetiske dobbelt-trådede MIR-206 etterligner, 206mi, for å endre nivået av total MIR-206 i SGC-7901 gastrisk kreft celler, som uttrykker et lavt nivå av MIR-206 i forhold til den av GSE-1 normale kontrollceller (figur 1C) og overvåkes hastigheten av celleveksten ved hjelp av tetrazolium fargestoff, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT). Stilk-sløyfe PCR bekreftet forhøyet nivå av MIR-206 i de transfekterte SGC-7901-celler (figur 2A), og resultatene fra MTT-analysen indikerte at veksten av disse cellene ble redusert vesentlig sammenlignet med de celler som fikk ikke- spesifikke kontrolletterligner, MIR-ctrl, over en 5-dagers periode (figur 2B). Vi har også genereres en forhånds MIR-206 uttrykkende plasmid på P2GM vektoren, og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse viste at forlenget G1-fase og den forkortede S-fase i P2GM-206 (P206) transfektert sammenlignet den P2GM vektor transfektert SGC-7901 celler (Figur 2C), og dermed som bekrefter resultatet fra de ovennevnte 206mi ligne eksperiment. Kunstig å øke det totale nivå av MIR-206 med 206 mi også resultert i en betydelig økning av apoptose i 48 timer i SGC-7901-celler i løpet av kontrolletterligner transfekterte celler, som bestemt ved strømningscytometrisk analyse av PI og Annexin V dobbeltopptak (figur 2D og E). Disse data indikerer at MIR-206 er et potent anti-proliferativ regulator av dyrkede magekreftceller. Figur 2 Tvunget uttrykk for MIR-206 undertrykker spredning av SGC-7901 magekreftceller. (A) Totalt nivåer av MIR-206 i SGC-7901 celler transfektert med MIR-ctrl eller syntetiske etterligner av MIR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) MTT-analyser for SGC-7901-celler transfektert med MIR-206 etterligner ved en sluttkonsentrasjon på 100 nM. Starter fra 24 timer etter transfeksjon, ble analysene lese hver 24. time i 5 påfølgende dager. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. (*** P < 0,0001). (C) Et histogram som viser cellesyklus distribusjon av SGC-7901 celler transient transfektert med P2GM-MIR-206 eller P2GM-ctrl (100 Nm). Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter (* P < 0,05). (D) Celler farging positiv for Annexin V-FITC og negative for PI i 48 timer etter transfeksjon ble ansett å ha gjennomgått apoptose. (E) Gjennomsnittlig apoptotisk frekvensen av tre uavhengige eksperimenter ± SEM vises (*** P < 0,0001).
MiR-206 hemmer forankringsavhengig magekreft cellevekst og xenograft tumordannelse
å undersøke på lang sikt virkningen av MIR-206 på cellevekst og kolonidannelse, vi generert en stabil linje med SGC-7901 celler, P2GM-MIR-206, som uttrykker Mir-206 fra en konstitutivt aktiv vektor, MSCV-P2GM, og en linje av tom vektor -carrying celler, P2GM-miRctrl. Først undersøkte vi ekspresjonsnivået av MIR-206 i disse to stabile cellelinjer, og fant at MIR-206 ble dramatisk forhøyet i P2GM-MIR-206 stabil cellelinje (figur 3A). Deretter analyserte vi effekten av MIR-206 på forankringsavhengig vekst av tynt Frøleggingen trypsinert celler direkte på petriskål og visualisere cellekolonier av krystallfiolett-farging etter 14 dagers dyrking. Resultatene viste at vektorførende styre stabile celler dannet signifikant flere kolonier enn de MIR-206-uttrykkende celler (figur 3B og C). Vi ytterligere injisert disse stabile celler subkutant i to bilaterale lavere ryggen av nakne mus, og overvåkes tumorvekst daglig. Tjue-fire dager etter injeksjonen ble musene avlivet og tumorene skåret ut og veiet (figur 3D og E). Resultatene viste at den gjennomsnittlige volumer av MIR-206-tumorer som overuttrykker vokste ved en mye langsommere tempo enn kontroll svulster og den midlere sluttvekten var betydelig mindre enn for kontrollene (figur 3F og G). Figur 3 MiR-206 undertrykker forankringsavhengige GC cellevekst og xenograft tumordannelse. (A) Ekspresjonsnivået av MIR-206 i P2GM-MIR-206 stabil cellelinje og vektor-bærende styre stabile celler (*** P < 0,0001). (B) Ett tusen stabile SGC-7901 celler av MIR-206 og negativ kontroll ble platet på seks-brønns plater og en koloni formasjon analyse utført. Representative resultatene av kolonidannelse av P2GM-MIR-kontroll, P2GM-MIR-206. (C) Antall kolonier ble tellet på den 14. dag etter poding. Stabile SGC-7901 celler av MIR-206 vokste til en lavere tetthet i forhold til NC. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter (** P 0,01). (D) SGC-7901 celler med stabil uttrykk for MIR-206 eller ikke ble inokulert subkutant i begge flankene av hårløse mus (n = 5 per gruppe). Representative fotografier av nakne mus 24 dager etter vaksinasjonen vises. (E) Musene ble drept og tumorene ble vektet 24 dager etter inokulering, at xenotransplantater med MIR-206 overekspresjon var betydelig mindre enn kontroll xenotransplantater. (F) viser tumorvekstkurve (* P < 0,05 og ** P 0,01). (G) tumorer fra hver gruppe ble veid umiddelbart etter fjerning. Den gjennomsnittlige tumorvekt er angitt som middelverdier ± SEM (* P < 0,05).
MiR-206 inhiberer gastrisk kreft celle invasjon og migrering
redusert ekspresjon av MIR-206 i lokalt invasive og metastatiske tumorer (tabell 1) tyder på at dette mikroRNA kan regulere celle vandrende prosess. For å finne ut om dette faktisk er tilfelle, gjennomførte vi sårhelende og Transwell migrasjon analyser ved hjelp av MIR-206-uttrykker stabile SGC-7901 celler. Resultatene viste at ektopisk overekspresjon av MIR-206 forårsaket en undertrykkelse av cellemigrering i SGC-7901-celler som tydelig i sårhelende analysen (figur 4A og B) og transwellcellemigrering analysen (figur 4C og D). Ektopisk overekspresjon av MIR-206 ytterligere hemmet SGC-7901 celle invasjon som demonstrert av Matrigel invasjonen analysen (Figur 4E og F). Derfor MIR-206 vises en undertrykkende eiendom i kreft celle migrasjon og invasjon analyser in vitro. Figur 4 MiR-206 undertrykker GC celle migrasjon og invasjon in vitro. (A) sårhelende analysen viste forskjellige celle motilities i MIR-kontroll, MIR-206 celler. Ektopisk uttrykk for MIR-206 åpenbart hemmet migrering av SGC-7901 celler. (B) viser de statistiske resultater. Data representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. (** P < 0,01). Over-uttrykk for MIR-206 betydelig hindret evner av cellemigrasjon (C) og invasjon (E) i MIR-206-uttrykke stabile SGC-7901 celler sammenlignet med negativ kontroll. (D, F) viser de statistiske resultater respektivt. Data representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MIR-206 hemmer levermetastaser fra GC in vivo
For å undersøke effekten av MIR-206 på metastasering in vivo, gjennomførte vi hale -vein injeksjon av P2GM-MIR-206 og vektor alene P2GM celler med nakne mus, 42 dager etter injeksjon, vi høstet og fotografert leveren (figur 5A, øvre paneler). H & E farging av vevssnitt indikerte et 7-fold lavere antall metastatiske tumorknuter per arealenhet i leveren injisert med P2GM-MIR-206-celler enn de injisert med P2GM kontrollceller (Figur 5A, nedre paneler og B). Videre er størrelsene av tumorknuter i P2GM-MIR-206 celle-injisert lever var mye mindre enn de i kontrollgruppen (Figur 5A). Dette resultatet sterkt hevder at MIR-206 normalt kan ha en tumor suppressor rolle forhindre metastasering av mage kreftceller. Figur 5 MiR-206 hemmer levermetastaser av GC in vivo. (A) Representative makroskopiske bilder av muselever, 42 dager etter vaksinasjonen, (Den øvre). Representative bilder av H & E farget spontane levermetastaser. Forstørrelse: 10 × (Den nederste). Resultatene viser at tumorknuter i P2GM-MIR-206 gruppe var mindre og mindre sammenlignet med kontrollgruppen. (B) Tall for levermetastatisk loci ble talt opp og sammenlignet mellom mus med SGC-7901 vektor kontrollceller og SGC-7901 celler uttrykker Mir-206. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (*** P < 0,0001). (C) Relativ mRNA nivå av mulige mål for Mir-206 mellom SGC-7901-MIR-P2GM og SGC-7901-MIR-206 celler. (D) Den relative mRNA nivået av mulige mål for Mir-206 mellom GES-1 og SGC-7901 cellelinjer.
Å bestemme mekanismen som MIR-206 utøver sin anti-metastatisk rolle, vi søkte etter mulig speil 206 målgener ved hjelp av en kombinasjon av elektroniske mikroRNA target Acquisition verktøy og kryss-referert de resulterende kandidater til de som har blitt rapportert å spille en rolle i metastasering. I en pool av 20 slike gener, fant vi ni av dem (tilleggsfiler 3: Tabell S1), nemlig STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, og K-ras, ble drastisk nedregulert av MIR-206 i P2GM-MIR-206 stabile celler i forhold til sine respektive nivåer i P2GM vektor stabile celler (figur 5C). Noen av disse MIR-206 målgener ble markert oppregulert i foreldre SCG-7901 GC tumorceller sammenlignet med vanlige mage GES-1 celler (figur 5D), tyder på en sannsynlig årsaks hendelse. Dermed MIR-206 hemmer sannsynlig metastase av GC kreftceller gjennom et nettverk av regulatoriske gener.
Diskusjon
Selv om feilregulering av miRNAs ble rapportert i ulike typer kreft hos mennesker [19], avvikende uttrykk og potensielle rolle miRNAs i mage kreft ble studerte. Her viser vi at MIR-206 er ofte nedregulert i menneskelige mage kreft og kreftcellelinjer. I lys av den reduserte MIR-206 uttrykk rapportert i flere typer av tumorer, våre resultater tyder på at en reduksjon MIR-206 uttrykk er sannsynligvis en forutsetning hendelse i tumorgenese. Dette kravet ble gjort enda mer relevant når vi fant ut at lave nivåer av MIR-206 var signifikant assosiert med lymfatisk metastase, lokal invasjon, og TNM stadium. Denne oppfatningen ble bekreftet av resultatene av ektopisk uttrykk for MIR-206 i GC kreftcellelinje SCG-7901, som viste at MIR-206 trykt GC celleproliferasjon, kolonidannelse, invasjon, og migrasjon. Til slutt, evne til MIR-206 for å undertrykke metastase av SCG-7901-celler i leveren gitt en entydig forklaring på korrelasjonen mellom lave nivåer av MIR-206 og invasive og metastatiske gastrisk kreft. Nylig STC2 ble identifisert som en prediktiv markør for lymfeknutemetastaser i esophageal plateepitelkreft [20]. Uttrykk for TrkB og BDNF er assosiert med dårlig prognose hos NSCLC pasienter [21]. Flere studier har rapportert at IGF1R uttrykk er forhøyet i metastatisk prostatakreft og hormon motstand progresjon [22, 23]. BCL2 uttrykk i primær prostatakreft er en markør for dårlig prognose, med økt risiko for tilbakefall [24]. Det som er sagt ovenfor, noe som tyder på et felles onkogen rolle i human cancer. Videre identifiserte vi STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF og K-ras som antatte funksjonelle mål av MIR-206, som en del av dem ble snakket over. Til sammen våre funn tyder på en tumor suppressor rolle MIR-206 i human magekreft
Bevis på MIR-206 som en svulst vekst suppressor har blitt rapportert i flere kreftformer. MIR-206 ble først funnet å være nedregulert i ERalpha -positive humane brystcancer vev og innføring av MIR-206 inn i østrogenavhengige MCF-7 brystkreftceller hemmer cellevekst i et dose- og tidsavhengig måte [25]. Videre kan MIR-206 markeds myogenisk differensiering og blokkere tumorvekst hos mus ved xenopodet downregulating produktet fra MTT-proto-onkogenet: Met tyrosin-kinase-reseptor [26]. Yan har også funnet at inhibering av MIR-206 funksjon vil kunne bidra til avvikende celleproliferasjon og migrasjon, som fører til rhabdomyosarcoma utvikling av undertrykkelse av c-Met [16]. I mellomtiden MIR-206 kan brukes til å inhibere HeLa cellemigrering og fokus formasjon ved å hemme både Notch3 protein og mRNA [27]. Videre ble MIR-206 nedregulert i høy metastase lungekreft sammenlignet med lave metastase svulster og normal lunge vev, overekspresjon av MIR-206 hemmet migrasjon og invasjon av lungekreft celler [18]. MiR-206 uttrykk redusert i østrogen reseptor-α (ERα) -positivt endometrial endometrioid adenokarsinom (EEC) og dens overekspresjon hemmet ERα avhengig spredning, svekket invasivitet og indusert cellesyklus arrest av ERα-positive EEC cellelinjer [28]. Alle disse funnene indikerte at MIR-206 kan spille en tumor suppressor rolle i ulike kreftformer.
Metastaser bidrar til de fleste kreftrelaterte dødsfall. GC er rangert som den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall verden over på grunn av sin høye frekvensen av metastaser, inkludert lymfeknute, bukhinne, lever etc. Spesielt den 5-års overlevelse av mage tumor med levermetastaser ikke overstiger 10% og median overlevelse uten behandling er ca 3 til 5 måneder [29]. Flere gener spilte en viktig rolle i GC metastase: for eksempel overekspresjon av insulinlignende vekstfaktor-reseptor-I (IGF-IR) og aktivering av dens signalveier begge spiller avgjørende roller i utvikling og progresjon av magekreft. Banket ned av Spl uttrykk ved liten hemmende RNA førte til redusert IGFIR uttrykk og svekket vekst og metastasering av magekreftceller [30], ellers kan IGF1R bli nedregulert av MIR-7 og betydelig redusert GC celle migrasjon og invasjon [31]. Adachi funnet at blokade av IGF-IR er involvert i undertrykkelse av kreftcellen invasjon gjennom nedregulering av matrilysin [32]. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Den endothelial lipase protein er lovende urin biomarkør for diagnostisering av magekreft
• Betydningen av lokkefugl receptor 3 (Dcr3) og ekstern signalregulert kinase 1/2 (ERK1 /2) i magekreft