MicroRNA-206 undertrykker gastrisk vækst cancercellen og metastase

MicroRNA-206 undertrykker gastrisk vækst kræftcelle og metastase
Abstract
mavekræft er en af ​​de førende årsager til kræft død verden og bærer en høj grad af metastatisk risiko. Ud over andre proteinkodende onkogener og tumorsuppressorgener, microRNA spille en vigtig rolle i gastrisk cancer tumorigene progression. Her viser vi, at MIR-206 udtrykkes ved markant lave niveauer i en kohorte af gastriske tumorer i forhold til deres matchende normalt væv, og i en række af gastriske cancercellelinier. Nedregulering af miR-206 var særlig betydelig i tumorer med lymfatisk metastase, lokal invasion, og avanceret TNM mellemstationer. Vi finder, at tvungen udtryk for miR-206 undertrykte spredning, koloni-dannelse, og xenograft tumorigenesis af SCG-7901 celler, en linje af gastriske kræftceller. Tvungen ekspression af MIR-206 undertrykte også SCG-7901 cellemigration og invasion samt metastase i cellekultur eller hale-vene injiceret musemodeller hhv. Den anti-metastatisk effekt af MIR-206 er sandsynligvis medieret af målretning metastase regulerende gener STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, Bcl2, BDNF, og K-ras, som var drastisk nedreguleres ved stabil ekspression af exogen miR -206 i SCG-7901 celler. Tilsammen vores resultater viser, at miR-206 er en tumor suppressor af mavekræft handler på trin, der regulerer metastaser.
Nøgleord
mavekræft miR-206 Metastase Tumor suppressor Introduktion
mavekræft (GC) rangerer fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Prognosen for patienter med fremskreden mavekræft er dårlig, trods de seneste forbedringer i gastriectomy, kemoterapi og strålebehandling [2]. Da GC er en polygenisk sygdom opstår som følge af flere gen dysregulations, er afgørende for at udvikle nye målrettede behandlinger belysning af de lovgivningsmæssige netværk styrende GC tumorigenese.
Tumorigenese i maven er en flertrins proces, der indebærer genetiske og epigenetiske ændringer af protein kodende såvel som ikke-kodende proto-onkogener og tumor-suppressor gener. Interaktioner mellem vært, miljømæssige og bakterielle faktorer påvirker også de fremskridt sygdom. Helicobacter pylori
(HP) infektion er etableret som en væsentlig risikofaktor for GC; de to histologiske undertyper af mavekræft, tarmens og diffuse undertyper, er begge forbundet med HP-infektion, hvilket bidrager til mere end 80% af tilfældene [3], især i antral /krop mavekræft [4]. Mekanistisk, blev HP infektion sig at forårsage en fordobling i EGF og EGFR i gastrisk antrale biopsi væv, men dens udryddelse reducerer niveauerne af begge faktorer til de af de [5] kontroller. HP-infektion hos patienter med kronisk gastritis er også signifikant associeret med nedregulering af E-cadherin på grund af øget promotor methylering [6], hvorimod udryddelse HP reducerede signifikant niveauerne af MMP-9, en metalloproteinase positivt associeret med tumorinvasion og metastase [ ,,,0],7], i antrum og corpus mucosa [8].
Foruden HP-infektion, er der et væld af årsager, der fører til afvigende genekspression i gastrisk cancer, og mekanismen af ​​gastrisk cancer metastase er meget kompleks samt . Ras-afhængige MAPK signalering, som i sidste ende fører til øget proliferation i gastrisk cancer og er primært forårsaget af aberrationer af K-ras-aktivering, er ofte forbundet med den intestinale-typen gastrisk cancer [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), et udskilt glycoprotein med vigtige funktioner i calcium og fosfat homeostase, blev rapporteret til at blive udtrykt i høje niveauer kræft gastrisk væv, lymfeknude metastase, og venøs invasion [10]. Den 5-årige overlevelsesrate var signifikant lavere hos patienter med STC2 udtryk i forhold til patienter uden STC2 udtryk [11]. BDNF (Brain-afledt neutrophic faktor) ekspression blev rapporteret at vise signifikant forøget ekspression i gastrisk cancer væv sammenlignet med tilstødende normal slimhinde, og høje niveauer af BDNF på den invasive fronten var korreleret til beholder invasion, lymfeknudemetastase, peritoneal udbredelse, og dårlig prognose i mavecancerpatienter [12]. På trods af fremskridt med at identificere de ovennævnte regulatoriske gener, stadig den præcise underliggende mekanisme forårsager GC metastase skal fastlægges.
Dysregulations af microRNA spille meget vigtige roller i tumorigenese. Rolle microRNA i mavekræft tumorigenese er veldokumenteret. Her fokuserer vi på miR-206, som sammen med sine nært beslægtede paraloger miR-1, 133a, og miR-133b, spiller meget vigtige roller i muskel differentiering. Disse fire microRNA er stærkt konserverede i sekvens og genomisk organisation, og kaldes myomiRs fordi de viste sig at blive udtrykt i høje niveauer i musklerne [13]. MIR-1-1 /MIR-133a-2, MIR-1-2 /MIR-133a-1, og MIR-206 /MIR-133b danner klynger i tre forskellige kromosomale regioner i det humane genom 20q13.33, 18q11.2 og 6p12.2 hhv. Imidlertid kan disse miRNA fungere som tumorsuppressorer i forskellige humane cancere [14]; for eksempel, blev MIR-1 og MIR-133a fundet at være hyppigt nedreguleret i blære kræft, og undertrykke tumorvækst ved at målrette TAGLN2 [15]. MIR-1 og MIR-206 viste sig at have lignende tumor-suppressor roller i rhabdomyosarcom gennem blokering c-Met-ekspression [16]. MIR-206 blev også rapporteret at virke som en tumor-suppressor i brystcancer [17], og lungecancer [18]. Vi rapporterer her, at miR-206-ekspression er omvendt forbundet med lymfatisk metastase, lokal invasion, og TNM malignitet iscenesættelse af GC, og tvinge udtryk for miR-206 undertrykker GC cellevækst, tumorgenese, og metastase.
Materialer og metoder
Vævsprøver
kirurgisk resektion menneskelige mavekræft og tilstødende ikke-tumorvæv blev opnået fra 35 patienter indlagt på Institut for Gastrointestinal Surgery, at Tilknyttede Hospital i Nanjing Medical University (Changzhou Second Folkets Hospital). Projektet blev godkendt af Research Ethics Committee of Nanjing Medical University, og en skriftlig tilladelse blev opnået fra hver patient tilmeldt i denne undersøgelse. Alle vævsprøver blev behandlet til opbevaring i flydende nitrogen og H &. E farvning for patologisk analyse
cellelinjer og cellekultur
Humane gastriske kræftceller SGC-7901, BGC-823, AGS, ikke-malign gastrisk celle line GES-1, og HEK293T celler blev købt fra Cell Resource center, Shanghai Institute for Biokemi og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Disse celler blev holdt i et fugtigt inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2 og SGC-7901, BGC-823, og GES-1-celler blev dyrket i RPMI1640-medium, HEK293T celler i DMEM, og AGS celler i F12K medium, henholdsvis. Alle dyrkningsmedier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika.
RNA-ekstraktion og kvantitativ realtids-PCR
Total RNA fra gastriske væv eller cellelinier blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol-reagens (Takara) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret med PrimeScript RT reagenskittet (Takara). Kvantitativ RT-PCR blev udført med en SYBR Premix Ex Taq (Takara) på en 7500 real time PCR-system (ABI) og analyseret med SDS softwarepakke (version 2.0.1, Applied Biosystems). PCR-primere blev opnået fra Invitrogen, og reaktionen var 95 ° C, 10 min, efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C 15 sekunder og 60 ° C, 1 min. Den U6 snRNA blev anvendt som en intern kontrol. Resultaterne blev præsenteret som gange ændring, beregnet ved anvendelse af 2 -. △ CT metode, og et forhold mellem ekspression i tumorerne i forhold til de normale væv under 1,0 blev betragtet som lav
vektorkonstruktioner
Pri -miR-206 blev amplificeret fra normal human genomisk DNA ved PCR under anvendelse af primere: 206-For 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'og 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. PCR-fragmentet blev indsat i MSCV-P2GM vektoren til frembringelse P2GM-MIR-206. Den tomme P2GM vektor blev anvendt som kontrol.
Cell transfektion
Plasmid transfektion af SGC-7901-celler blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen), og stabile kloner, der bærer P2GM-MIR-206 eller tom vektor blev udvalgt for puromycin modstand (10 ug /ml). MIR-206 og negative kontrol efterligner blev opnået fra Ribobio (Guangzhou, Kina) og transfektion af efterligner i SGC-7901 celler blev gjort ved hjælp Oligofectamine (Invitrogen). Kort fortalt SGC-7901 celler belagte out 1 dag tidligere blev transficeret med 100 nm af miR-206 eller kontrol efterligner på at nå 50% sammenflydning. Efter 48 timer blev cellerne behandlet til yderligere analyse.
Celleproliferationsassay
MTT assay blev anvendt til at estimere den proliferative hastighed på SGC-7901 celler. Kort fortalt blev SGC-7901 celler trypsinzed 2 dage efter transfektion og podet ved 2,5 x 10 3 celler per brønd i 96-brønds plader. MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromide) blev tilsat til dyrkningsmediet på bestemte tidspunkter for xx timer, og absorbansen ved 490 nm blev målt med et spektrofotometer. Hvert assay blev udført i tre eksemplarer og gentaget tre gange uafhængigt af hinanden.
Kolonidannelse assay
Stabile SCG-7901 celler, der bærer MIR-206 eller det tomme kontrol blev trypsiniseret og genudpladet på 1 × 10 3 per brønd i 6 Tja plader. Efter 14 dages dyrkning i RPMI1640 suppleret med 10% FBS blev kolonier fikseret med 3,7% methanol og farvet med 0,1% krystalviolet. Kolonier indeholdende mindst 50 celler blev scoret. Hvert assay blev udført i triplikater.
Flowcytometri
SGC-7901 celler transficeret med MIR-206 mimic eller negativ kontrol blev trypsinbehandlet og resuspenderet i 1 × bindingsbuffer på 1 × 10 6 celler /ml. 100 pi af denne cellesuspension blev inkuberet med 5 liter FITC-Annexin V og 5 pi propridium iodid (PI) i 15 minutter i mørke. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 400 pi 1 × bindingsbuffer og analyseret med (FACSCalibur hjælp af CellQuest software (Becton Dickinson). FITC-Annexin V-positive og PI-negative celler blev betragtet som apoptotiske og forsøgene blev udført i tre eksemplarer.
migration og invasion analyser
sårheling cellemigration blev vurderet ved at måle bevægelsen af ​​celler i en acellulær område skabt ved at skrabe græsplæne den sammenflydende celle med en 200 pi pipettespids. såret lukningen blev fotograferet 48 timer senere under et mikroskop. for Transwell migration analyser, 5 × 10 4 celler blev sat ind i det øverste kammer af indsatsen (BD Science, Sparks, MD, USA), mens 1 × 10 5 celler blev anvendt til matrigel invasion assays. i disse eksperimenter blev cellerne trypsinbehandlet og resuspenderet i serum-frit medium, inden de podet til det øvre kammer. den fulde dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS blev tilsat i det nederste kammer. Cellerne blev inkuberet i en fugtig inkubator ved 37 ° C i 24 timer. Cellerne på membranen blev fikseret, farvet og talt. Hvert forsøg blev udført i triplikater.
Xenograft tumor model
Unge kvindelige athymiske nøgne mus (6 uger gamle) blev erhvervet fra Model Animal Research Center i Nanjing Universitet. Ca. 1,5 × 10 6 stabile SGC-7901 celler, der bærer P2GM-MIR-206 eller det tomme vektor blev injiceret subkutant i de nedre flanker på 5 nøgne mus. Tumorvolumener blev målt hver 3 dage fra den sjette dag efter injektion videre i 24 dage, før dyrene blev ofret. Det endelige volumen og vægt blev målt efter tumorerne blev dissekeret. Nøgne mus blev manipuleret og plejet efter NIH Animal Care og brug Udvalg retningslinjer i Experiment Animal center af Nanjing Medical University (Nanjing, Jiangsu, provinsen, PR Kina).
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS softwarepakke (SPSS Standardudførelse 16,0, SPSS Inc.). Data blev vist som gennemsnit ± SEM. De parvise-prøver t
-test blev anvendt i analysen af ​​forskellen miR-206 udtryk mellem tumor og normalt væv. Til in vitro og in vivo forsøg, uafhængige-prøver t
-test blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​forskellen mellem behandlings- og kontrolgrupper. P-værdi < 0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater
nedregulering af miR-206 korrelerer med human gastrisk cancer tumorigenese, invasion, og metastase
I et genom bred undersøgelse for microRNA ekspression, vi tidligere identificeret flere medlemmer af den myomiR familien, nemlig miR-1 /133a og miR-133b /206, hvis niveauet blev nedsat i en neuroectodermic kræft (upublicerede resultater). Disse microRNA var primært kendt for at virke i myogene differentiering og, i mindre grad, den tumorigenese af pædiatriske cancere. At udforske hvis disse myomiRs også kan have en rolle i tumorigensis af almindelige kræftformer i den voksne, vi undersøgte deres ekspressionsniveauerne af real-time stem-loop RT-PCR kvantificering i en kohorte af frisk resektion gastriske tumorer og deres matchende normale væv, og fandt, at den mediane forhold mellem mIR-206 i forhold til U6 snRNA af de 35 tumorer var 4-fold lavere end de normale væv (figur 1A). Parvis sammenligning viste, at over 85% af tumorer viste større end 2 gange reduktion af MIR-206-ekspression sammenlignet med deres matchende kontrol, med kun to par viser stigning (figur 1B). Ekspression af MIR-206 blev også reduceret i et antal humane gastriske cancer cellelinjer, herunder SGC-7901, BGC-823, MGC-803, og AGS celler, sammenlignet med den i GES-1 normale gastriske celler (figur 1C). Klinisk-patologisk registreringer af disse tumorer viste, at reduktionen af ​​miR-206-ekspression signifikant associeret med lymfatisk metastase, lokal invasion, og TNM malignitet iscenesættelsen, men ikke med alder, køn, tumorstørrelse eller placering (tabel 1). Disse data indebærer, at MIR-206 normalt kan udøve en inhiberende kontrol på gastrisk tumorigenese, invasion og metastase. Figur 1 reducerede niveauer af miR-206-ekspression i gastrisk cancer væv og cellelinier. (A) Fordeling af miR-206-ekspression i en kohorte af 35 menneskelige GC og noncancerous væv ved QRT-PCR. Den endogene U6 RNA blev anvendt som intern kontrol. (B) parvise sammenligning af MIR-206-ekspression mellem GC- og matchende ikke-cancervæv viser MIR-206-ekspression blev reduceret i 86% (30/35) af prøven par. (C) Relativ udtryk for miR-206 i fire GC cellelinjer og en normal gastrisk cellelinje (GES-1).
Tabel 1 Clinicopathologic karakteristika miR-206
Kategorier
NO. af patienterne
relative niveauer af miR-206 (gennemsnit ± SEM)
P-værdi
Køn
Mand
21
0,49 ± 0,07
0,32
Female
14
0,40 ± 0,06
Alder (år)
≥60
19
0,45 ± 0,05
0,93
< 60
16
0,46 ± 0,09
Diameter (cm)
≥5
13
0,46 ± 0,09
0,90
< 5
22
0,45 ± 0.05
Beliggenhed
Mellemøsten og proksimal tredje
23
0,47 ± 0,06
0,65
Distal tredje
12
0,42 ± 0,07
grad af differentiering
godt og moderat
12
0,48 ± 0,07
0,70
Dårligt
23
0,44 ± 0,07
Lokal invasion
T1 + T2
10
0,65 ± 0,07
0.01
T3 + T4
25
0,37 ± 0,05
lymfeknudemetastase
NO
14
0,57 ± 0,06
0,04
JA
21
0,38 ± 0,07
TNM stadie
I + II
12
0,60 ± 0,07
0.02
III + IV
23
0,38 ± 0,06
ekspression af miR-133a viste sig også at blive nedreguleret i tumorer ved ovennævnte kriterier (Yderligere fil 1: Figur S1), men udtryk for miR-1, hvis gener er grupperet med dem, der koder miR-133a [14], var ikke (Yderligere fil 2: Figur S2). Da MIR-206 kodes af et unikt gen, blev det valgt til yderligere analyse.
MIR-206 inhiberer gastrisk cancercellevækst
at bestemme om MIR-206 har tilbøjelighed til at undertrykke mavekræft tumorigenese indførte vi en syntetiske dobbeltstrengede mIR-206 efterligner, 206mi, at ændre niveauet af samlede mIR-206 i SGC-7901 gastrisk cancerceller, som udtrykker et lavt niveau af mIR-206 i forhold til den for GSE-1 normale kontrolceller (figur 1C) , og overvåges hastigheden af ​​cellevækst ved hjælp tetrazoliumfarvestoffet, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT). Hårnåle-PCR bekræftede forhøjet niveau af MIR-206 i de transficerede SGC-7901 celler (figur 2A), og resultaterne fra MTT-assayet viste, at væksten i disse celler blev reduceret markant sammenlignet med den af ​​cellerne, der modtager ikke- særlige kontrolforanstaltninger efterligner, miR-ctrl, over en periode på 5 dage (figur 2B). Vi genererede også en pre-MIR-206 udtrykkende plasmid i P2GM vektoren, og fluorescens-aktiveret-celle-sortering (FACS) analyse viste den langvarige G1-fasen og den forkortede S-fase i P2GM-206 (P206) transficeret i forhold til den P2GM vektor transficerede SGC-7901 celler (Figur 2C), hvilket underbygger resultatet fra ovenstående 206mi mimic eksperiment. Kunstigt øge det samlede niveau for miR-206 med 206 mi resulterede også i en betydelig forøgelse af apoptose i 48 timer i SGC-7901 celler over kontrol efterligner transfekterede celler som bestemt ved flow cytometri af PI og Annexin V dobbelt optagelse (figur 2D og E). Disse data indikerer, at MIR-206 er et potent anti-proliferative regulator af dyrkede gastriske cancerceller. Figur 2 Tvunget udtryk for miR-206 undertrykker proliferation af SGC-7901 gastrisk kræftceller. (A) Total niveauer af MIR-206 i SGC-7901 celler transficeret med MIR-ctrl eller de syntetiske efterligninger af MIR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) MTT assays for SGC-7901 celler transficeret med MIR-206 efterligner ved en slutkoncentration på 100 nM. Startende fra 24 timer efter transfektion, blev analyserne læst hver 24 timer til 5 dage i træk. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. (*** P < 0,0001). (C) Et histogram, der afbilder cellecyklusfordeling af SGC-7901 celler transient transficeret med P2GM-MIR-206 eller P2GM-ctrl (100 nM). Resultaterne repræsenterer de midler ± SEM for tre uafhængige forsøg (* P < 0,05). (D) Celler farves positive for Annexin V-FITC og negativ for PI ved 48 timer efter transfektion blev anset for at have undergået apoptose. (E) Gennemsnitlig apoptotiske sats af tre uafhængige eksperimenter ± SEM er vist (*** P < 0,0001).
MIR-206 inhiberer forankringsafhængige gastrisk vækst cancercellen og xenograft tumordannelse
Til undersøgelse på lang sigt virkningen af ​​mIR-206 på cellevækst og kolonidannelse, genereret vi en stabil linje af SGC-7901 celler, P2GM-mIR-206, som udtrykker mIR-206 fra et konstitutivt aktiv vektor, MSCV-P2GM, og en linje af tom vektor -carrying celler, P2GM-miRctrl. Først undersøgte vi ekspressionsniveauet af MIR-206 i disse to stabile cellelinjer og fandt, at MIR-206 dramatisk var forhøjet i P2GM-MIR-206 stabil cellelinie (figur 3A). Derefter analyseret vi effekten af ​​MIR-206 på forankringsafhængige vækst ved tyndt podning trypsinerede celler direkte på petriskål og visualisere cellekolonier efter krystalviolet farvning følgende 14 dages dyrkning. Resultaterne viste, at vektoren bærende kontrol stabile celler dannet signifikant flere kolonier end de MIR-206-udtrykkende celler (figur 3B og C). Vi yderligere injiceret disse stabile celler subkutant i to bilaterale lavere ryggen af ​​nøgne mus, og overvåges tumorvækst dagligt. Fireogtyve dage efter injektion blev disse mus aflivet, og tumorerne blev udskåret og vejet (figur 3D og E). Resultaterne viste, at de gennemsnitlige mængder af MIR-206-overudtrykker tumorer voksede meget langsommere tempo end kontrol- tumorer og den gennemsnitlige slutvægt var signifikant mindre end for kontrollerne (figur 3F og G). Figur 3 MIR-206 undertrykker forankringsafhængige vækst GC celle og xenotransplantat tumordannelse. (A) Ekspressionsniveauet af MIR-206 i P2GM-MIR-206 stabil cellelinie og vektor-bærende kontrol stabile celler (*** P < 0,0001). (B) Et tusinde stabile SGC-7901 celler af MIR-206 og negativ kontrol blev udpladet på plader med 6 brønde og en kolonidannelse assayet udføres. Repræsentative resultater af koloni dannelse af P2GM-miR-kontrol, P2GM-miR-206. (C) Antallet af kolonier blev talt på den 14. dag efter podning. Stabile SGC-7901 celler af MIR-206 voksede til en lavere densitet end NC. Resultaterne repræsenterer de midler ± SEM for tre uafhængige forsøg (** P < 0,01). (D) SGC-7901 celler med stabil ekspression af MIR-206 eller ikke blev inokuleret subkutant i begge flanker af nøgne mus (n = 5 pr gruppe). Repræsentative fotografier af nøgne mus 24 dage efter inokulering er vist. (E) Musene blev aflivet, og tumorerne blev vejede 24 dage efter inokulering, xenotransplantaterne med MIR-206 overekspression var signifikant mindre end kontrol- xenotransplantater. (F) viser tumorvækst kurve (* P < 0,05 og ** P < 0,01). (G) Tumorer fra hver gruppe blev vejet umiddelbart efter fjernelse. Den gennemsnitlige tumorvægt er angivet som middelværdi ± SEM (* P < 0,05).
MIR-206 inhiberer gastrisk cancercelleinvasion og migration
Reduceret ekspression af MIR-206 i lokalt invasive og metastatiske tumorer (tabel 1) foreslår, at dette microRNA kan regulere celle vandrende proces. At afgøre, om dette faktisk er tilfældet, vi udført sårheling og Transwell migration analyser ved hjælp af miR-206-udtrykkende stabile SGC-7901 celler. Resultaterne viste, at ektopisk overekspression af MIR-206 forårsagede en undertrykkelse af cellemigrering i SGC-7901 celler som er tydelige i sårhelende assay (figur 4A og B) og transwell cellemigrationsassay (figur 4C og D). Ektopisk overekspression af MIR-206 yderligere inhiberede SGC-7901 celleinvasion som påvist af Matrigel invasion assay (figur 4E og F). Derfor MIR-206 vises en suppressiv ejendom i cancer cellemigration og invasion assays in vitro. Figur 4 MIR-206 undertrykker GC cellemigration og invasion in vitro. (A) sårhelende assay viste forskellige celle motilities i miR-kontrol, miR-206 celler. Den ektopiske udtryk for miR-206 hæmmede naturligvis migrationen af ​​SGC-7901 celler. (B) viser de statistiske resultater. Data repræsenterer middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg. (** P < 0,01). Over-ekspressionen af ​​miR-206 hæmmet betydeligt evner celle migration (C) og invasion (E) i miR-206-udtrykkende stabile SGC-7901 celler i forhold til negativ kontrol. (D, F) viser de statistiske resultater hhv. Data repræsenterer middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MiR-206 hæmmer levermetastaser af GC in vivo
For at undersøge effekten af ​​miR-206 om metastaser in vivo, vi udført hale -vein injektion af P2GM-miR-206 og vektoren alene P2GM celler med nøgne mus, 42 dage efter injektion, vi høstet og fotograferet leverne (figur 5A, øvre paneler). H &E farvning af vævssnit viste en 7-fold lavere antal metastatiske tumorknuder per arealenhed i leverne injiceret med P2GM-MIR-206-celler end dem injiceret med P2GM kontrolceller (figur 5A, nedre paneler og B). Desuden størrelserne af tumorknuder i P2GM-MIR-206 celle-injicerede lever var meget mindre end dem af kontrolgruppen (figur 5A). Dette resultat kraftigt hævder, at miR-206 normalt kan have en tumor suppressor rolle forhindrer metastase af gastriske kræftceller. Figur 5 MIR-206 inhiberer levermetastaser fra GC in vivo. (A) Repræsentative makroskopiske billeder af mus lever, 42 dage efter podning, (Den øverste). Repræsentative fotografier af H &E farvet spontane levermetastaser. Forstørrelse: 10 × (lavere). Resultaterne viser, at tumorknuder i P2GM-MIR-206 gruppe var mindre og mindre i sammenligning med kontrolgruppen. (B) Antal lever metastatisk loci blev talt og sammenlignet mellem mus med SGC-7901 vektor kontrol celler og SGC-7901 celler, der udtrykker miR-206. Data viser middel ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) Relativ mRNA niveau af formodede mål for miR-206 mellem SGC-7901-miR-P2GM og SGC-7901-miR-206 celler. (D) Den relative mRNA niveau af formodede mål for miR-206 mellem GES-1 og SGC-7901 cellelinjer.
At bestemme den mekanisme, hvormed miR-206 udøver sin anti-metastatisk rolle, søgte vi efter muligt miR- 206 målgener ved at kombinere onlinekonverteringskampagner microRNA target værktøjer og krydsreferencer de resulterende kandidater til dem, der er blevet rapporteret at spille en rolle i metastase. I en pulje på 20 af sådanne gener, fandt vi ni af dem (Yderligere fil 3: Tabel S1), nemlig STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, og K-ras, blev drastisk nedreguleret af miR-206 i P2GM-miR-206 stabile celler i forhold til deres respektive niveauer i P2GM vektor stabile celler (Figur 5C). Nogle af disse miR-206 målgener markant opreguleret i forældrenes SCG-7901 GC tumorceller sammenlignet med normale gastrisk GES-1 celler (figur 5D), hvilket tyder på en sandsynlig årsagssammenhæng begivenhed. Således miR-206 sandsynligvis hæmmer metastase af GC tumorceller gennem et netværk af regulatoriske gener.
Diskussion
Selvom dysregulering af miRNA blev rapporteret i forskellige typer af humane kræftformer [19], afvigende udtryk og potentielle rolle miRNA i gastrisk kræft blev dublerede. Her viser vi, at MIR-206 ofte nedreguleres i humane gastriske cancere og cancercellelinjer. I lyset af det reducerede MIR-206-ekspression rapporteret i flere typer af tumorer, vores resultater tyder på, at reduktion af MIR-206-ekspression sandsynligvis en forudsætning begivenhed i tumorgenese. Dette krav blev gjort endnu mere relevant, da vi fandt, at lave niveauer af miR-206 signifikant var forbundet med lymfatisk metastase, lokal invasion, og TNM stadie. Dette blev bekræftet af resultaterne af ektopisk udtryk for miR-206 i GC kræft cellelinje SCG-7901, som viste, at miR-206 undertrykt GC celleproliferation, kolonidannelse, invasion, og migration. Endelig evne MIR-206 til at undertrykke metastase af SCG-7901 celler i leveren givet en klar forklaring på sammenhængen mellem lave niveauer af MIR-206 og invasive og metastatiske gastriske cancere. Senest STC2 blev identificeret som en prædiktiv markør for lymfeknudemetastaser i esophageal pladecellekræft [20]. Ekspression af TrkB og BDNF er forbundet med dårlig prognose hos patienter med NSCLC [21]. Flere undersøgelser har rapporteret, at IGF1R udtryk er forhøjet i metastatisk prostatacancer og hormon modstand progression [22, 23]. BCL2 ekspression i primær prostatacancer er en markør for dårlig prognose, med en øget risiko for fornyet [24]. Hvad der er sagt ovenfor antyder en fælles onkogen rolle i human cancer. Yderligere vi identificeret STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF og K-ras som formodede funktionelle mål for miR-206, som en del af dem blev talt ovenfor. Tilsammen vores resultater tyder på en tumor suppressor rolle MIR-206 i human gastrisk cancer
Bevis for MIR-206 som en tumorvækst suppressor er blevet rapporteret i flere kræftformer:. MIR-206 blev først fundet at være nedreguleret i ERalpha -positive human brystcancer væv og indførelse af mIR-206 i østrogenafhængige MCF-7 brystcancerceller inhiberer cellevækst på en dosis- og tidsafhængig måde [25]. Desuden kunne MIR-206 fremmer myogene differentiering og blokere tumorvækst i xenotransplanterede mus ved nedregulering produktet af met-protoonkogen: Met tyrosin-kinase receptor [26]. Yan fandt også, at inhibering af MIR-206 funktion kan bidrage til afvigende celleproliferation og migration, hvilket fører til rhabdomyosarcom udvikling ved suppression af C-Met [16]. Imens MIR-206 kan anvendes til at inhibere HeLa cellemigrering og fokus ved at hæmme både Notch3 protein og mRNA [27]. Endvidere blev MIR-206 nedreguleret i høj metastase lungekræft sammenlignet med lave metastase tumorer og normale lungevæv, overekspression af MIR-206 inhiberede migration og invasion af lungecancerceller [18]. MIR-206 udtryk faldt i østrogen-receptor-α (ERa) -positiv endometrie endometrioide adenocarcinom (EØF) og dens overekspression hæmmede ERa-afhængig proliferation, nedsat invasionsevne og induceret cellecyklusstop af ERa-positive EØF cellelinjer [28]. Alle disse resultater viste, at MIR-206 kan spille en tumor suppressor rolle i forskellige cancerformer.
Metastase bidrager til de fleste cancer dødsfald. GC rangerer som den næststørste årsag til kræft dødsfald på verdensplan, fordi dens høje metastase, herunder lymfeknude, bughinden, lever etc. Især 5-års overlevelse på gastrisk tumor med levermetastaser ikke overstiger 10%, og den mediane overlevelse uden behandling er ca. 3 til 5 måneder [29]. Multiple gener spillet en central rolle i GC metastase: såsom overekspressionen af ​​insulin-lignende vækstfaktor-receptor-I (IGF-IR) og aktiveringen af ​​dens signalveje begge spiller en kritisk rolle i udviklingen og progressionen af ​​gastrisk cancer. Banke-down af Spl ekspression ved små inhibitoriske RNA førte til reduceret IGFIR ekspression og svækkede vækst og metastase af gastriske cancerceller [30], ellers kan IGF1R nedreguleres af MIR-7 og væsentligt reduceret GC cellemigration og invasion [31]. Adachi fandt, at blokade af IGF-IR er involveret i undertrykkelsen af ​​cancercelleinvasion gennem nedregulering af matrilysin [32]. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Den endotel lipase protein er lovende urin biomarkør til diagnosticering af gastrisk cancer
• Betydningen af ​​attrap-receptor 3 (DcR3) og eksterne signal reguleret kinase 1/2 (Erk1 /2) i gastrisk cancer