El microARN-206 suprime el crecimiento de células de cáncer gástrico y metástasis

El microARN-206 suprime el crecimiento de células de cáncer gástrico y metástasis
Resumen
El cáncer gástrico es una de las principales causas de muerte en todo el mundo el cáncer y conlleva un alto índice de riesgo metastásico. Además de otros oncogenes codificantes de proteínas y genes supresores de tumor, microRNAs juegan un papel importante en el cáncer gástrico progresión tumorigénico. Aquí, se muestra que el miR-206 se expresa en niveles notablemente bajos en una cohorte de tumores gástricos en comparación con sus tejidos normales a juego, y en un número de líneas celulares de cáncer gástrico. El descenso de regulación de miR-206 fue particularmente significativa en los tumores con metástasis linfática, invasión local, y la estadificación TNM avanzada. Encontramos que la expresión forzada de miR-206 suprime la proliferación, de colonias de formación, y la tumorigénesis de xenoinjerto de células SCG-7901, una línea de células de cáncer gástrico. La expresión forzada de miR-206 también suprimió la migración SCG-7901 celular y la invasión, así como metástasis en cultivo celular o modelos de ratones inyectados cola venosa, respectivamente. El efecto anti-metastásico de miR-206 es probablemente mediada por la orientación de metástasis genes reguladores STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, y K-ras, que eran drásticamente reducido regulado por la expresión estable de exógena MIR -206 en las células SCG-7901. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que el miR-206 es un supresor de tumor de cáncer gástrico que actúa en los pasos que regulan la metástasis.
Palabras clave
El cáncer gástrico miR-206 metástasis del tumor supresor de Introducción
cáncer gástrico (CG) clasifica a la cuarto tipo de cáncer más común y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. El pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico avanzado es pobre, a pesar de las recientes mejoras en gastriectomy, quimioterapia y radioterapia [2]. Desde GC es una enfermedad poligénica que surge como el resultado de múltiples desregulaciones de genes, la elucidación de la red de regulación que regula la tumorigénesis GC es imperativo para el desarrollo de terapias novedosas.
La tumorigénesis en el estómago es un proceso de múltiples etapas que implica alteraciones genéticas y epigenéticas de proteínas -coding así como no codificante proto-oncogenes y genes supresores de tumores. Las interacciones entre huésped, del medio ambiente y los factores bacterianos también influyen en el progreso de la enfermedad. Helicobacter pylori gratis (HP), la infección se ha establecido como un importante factor de riesgo de GC; los dos subtipos histológicos de cáncer gástrico, el intestinal y los subtipos difusos, están asociados con la infección por HP, lo que contribuye a más de 80% de los casos [3], especialmente en el cáncer gástrico antral /cuerpo [4]. Mecánicamente, se encontró que la infección por HP para causar un aumento del doble en EGF y EGFR en tejidos de biopsia antrales gástricas, pero su erradicación reduce los niveles de ambos factores a los de los controles [5]. la infección por HP en pacientes con gastritis crónica también se asocia significativamente con la baja regulación de la E-cadherina debido al aumento de la metilación del promotor [6], mientras que la erradicación de HP reduce significativamente los niveles de MMP-9, una metaloproteinasa asocia positivamente con la invasión tumoral y la metástasis [ ,,,0],7], en el antro y la mucosa corpus [8].
Además de la infección HP, hay una multitud de causas que conducen a la expresión génica aberrante en el cáncer gástrico, y el mecanismo de la metástasis del cáncer gástrico es muy complejo, así . La señalización MAPK Ras-dependiente, que finalmente conduce a aumento de la proliferación en el cáncer gástrico y es causado principalmente por las aberraciones de la activación de K-ras, se asocia frecuentemente con el cáncer gástrico de tipo intestinal [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), una glicoproteína secretada con funciones importantes en la homeostasis de calcio y fosfato, se informó que se expresa en altos niveles tejidos cancerosos gástricas, metástasis en los ganglios linfáticos y la invasión venosa [10]. La tasa de supervivencia a 5 años fue significativamente menor en los pacientes con expresión STC2 en comparación con los pacientes sin STC2 expresión [11]. BDNF (derivado del cerebro factor de neurotrófico) expresión se informó para mostrar aumentado significativamente la expresión en tejido de cáncer gástrico en comparación con la mucosa normal adyacente, y altos niveles de BDNF en el frente invasivo se correlacionaron con invasión de vasos, ganglios linfáticos metástasis, diseminación peritoneal, y pobres el pronóstico en pacientes con cáncer gástrico [12]. A pesar de los avances en la identificación de los genes reguladores anteriores, el mecanismo subyacente que causa la metástasis precisa GC aún queda por determinar.
Desregulaciones de microRNAs juegan un papel muy importante en la tumorigénesis. El papel de los microRNAs en la tumorigénesis del cáncer gástrico ha sido bien documentado. Aquí, nos centramos en el miR-206, que junto con sus estrechamente relacionados paralogs MIR-1, 133a, 133b y MIR-, juega un papel muy importante en la diferenciación muscular. Estos cuatro microARN son altamente conservados en secuencia y organización genómica, y se llaman myomiRs porque se encontró que se expresa en altos niveles en los músculos [13]. MiR-1-1 /miR-133a-2, miR-1-2 /miR-133a-1 y miR-206 forman grupos /miR-133b en tres diferentes regiones cromosómicas en el genoma humano 20q13.33, 18q11.2 y 6p12.2, respectivamente. Sin embargo, estos miRNAs pueden actuar como supresores de tumores en varios cánceres humanos [14]; por ejemplo, el miR-1 y miR-133a se encontró que eran frecuentes las reguladas en los cánceres de vejiga, y suprimir el crecimiento tumoral mediante la orientación TAGLN2 [15]. MiR-1 y miR-206 se muestran poseer funciones supresores de tumores similares en rabdomiosarcoma través del bloqueo de c-Met expresión [16]. También se informó de miR-206 para actuar como un supresor de tumores en el cáncer de mama [17], y el cáncer de pulmón [18]. Presentamos aquí que el miR-206 expresión se asocia inversamente con metástasis linfática, invasión local y la estadificación TNM malignidad de GC, y la fuerza de la expresión de miR-206 suprime el crecimiento celular GC, tumorigénesis y metástasis.
Materiales y métodos
las muestras de tejido resecado quirúrgicamente
cáncer gástrico humano y los tejidos no tumorales adyacentes se obtuvieron de 35 pacientes ingresados ​​en el Departamento de Cirugía gastrointestinal, hospital Afiliado de la Universidad médica de Nanjing (hospital del segundo Changzhou personas). El proyecto fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Médica de la Universidad de Nanjing, y un consentimiento por escrito se obtuvo de cada paciente incluido en este estudio. Todas las muestras de tejido fueron procesadas para su almacenamiento en nitrógeno líquido y H &. E tinción para el análisis patológico Líneas celulares y cultivo celular

líneas celulares de cáncer gástrico humano SGC-7901, BGC-823, AGS, las células gástricas no maligno GES-1 de línea y células HEK293T fueron adquiridos de la célula Centro de recursos, Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología celular, la Academia china de Ciencias. Estas células se mantuvieron en una incubadora con humedad a 37 ° C, 5% de CO 2 y SGC-7901, BGC-823, y GES-1 en las células se cultivaron en medio RPMI1640, las células HEK293T en DMEM, y las células AGS en F12K medio, respectivamente. Todos los medios de cultivo se complementaron con suero bovino fetal 10% y antibióticos.
Extracción de ARN y PCR El ARN total
cuantitativa en tiempo real de los tejidos gástricos o líneas celulares se extrajeron usando el reactivo Trizol (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc con el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara). RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo con un kit SYBR Premezcla Ex Taq (Takara) en un sistema de PCR en tiempo real 7500 (ABI) y se analizó con el paquete de software de análisis de SDS (versión 2.0.1, Applied Biosystems). Los cebadores de PCR se obtuvieron de Invitrogen, y la reacción se 95 ° C, 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C 15 segundos y 60 ° C, 1 min. El U6 snRNA se utilizó como control interno. Los resultados se presentaron como factor de cambio, calcula utilizando la 2 -.
△ CT método, y una relación de expresión en los tumores en relación con los tejidos normales a menos de 1,0 se consideró un precio tan bajo vectorial construye
Pri -miR-206 se amplificó a partir de ADN genómico humano normal por PCR usando primers: 206-For 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'y 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. El fragmento de PCR se insertó en el vector MSCV-P2GM para generar P2GM-miR-206. El vector P2GM vacío se utilizó como control. Cell transfección
plásmido transfección de células SGC-7901 se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), y se seleccionaron clones estables que llevan P2GM-miR-206 o el vector vacío para resistencia a puromicina (10 mg /ml). MIR-206 e imita de control negativo se obtuvieron de Ribobio (Guangzhou, China) y la transfección de células imita en SGC-7901 se realizó utilizando Oligofectamine (Invitrogen). Brevemente, las células SGC-7901 se sembraron 1 día antes fueron transfectadas con 100 nm de miR-206 o de control imita a alcanzar el 50% de confluencia. Después de 48 h, se procesaron las células para su posterior análisis. Ensayo de proliferación de la célula

ensayo de MTT se utilizó para estimar la tasa de proliferación de células SGC-7901. Brevemente, las células SGC-7901 se trypsinzed 2 días después de la transfección y se sembraron de nuevo en 2,5 × 10 3 células por pocillo en placas de 96 pocillos. MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil-tetrazoliumbromide) se añadió al medio de cultivo a intervalos especificados para hrs xx, y la absorbancia a 490 nm se midió con un espectrofotómetro. Cada ensayo se realizó por triplicado y se repitió tres veces de forma independiente.
Ensayo de formación de colonias
células SCG-7901 estables que llevan miR-206 o el control de vacío se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en 1 x 10 3 por pocillo en 6 -Bueno placas. Después de 14 días en cultivo en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, las colonias se fijaron con 3,7% de metanol y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. se puntuaron las colonias que contienen al menos 50 células. Cada ensayo se realizó por triplicado.
Citometría de flujo
células SGC-7901 transfectadas con el miR-206 de control sinóptico o negativo se tripsinizaron y se resuspendieron en tampón de unión 1 × 10 × 1 a 6 células /ml. 100 l de esta suspensión de células se incubó con 5 l de FITC-anexina V y yoduro de 5 l propridium (PI) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se terminó con la adición de 400 l 1 x tampón de unión y se analizaron con (FACSCalibur usando el software CellQuest (Becton Dickinson). Anexina FITC células V-positivos y PI-negativo se consideraron como apoptóticos y los experimentos se llevaron a cabo en por triplicado.
migración y la invasión ensayos
herida de la migración celular de curación se evaluó midiendo el movimiento de las células en una zona acelular creado por raspado el césped de células confluentes con una punta de pipeta de 200 l. el cierre de la herida fue fotografiado 48 horas más tarde bajo un microscopio. para transwell ensayos de migración, 5 × 10 se añadieron 4 células en la cámara superior del inserto (BD Ciencia, Sparks, MD, EE.UU.), mientras que 1 × 10 se han usado 5 células de matrigel ensayos de invasión. en estos experimentos, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en medio libre de suero antes de ser sembradas a la cámara superior. el medio de cultivo completo que contiene 10% de FBS se añadió en la cámara inferior. Las células se incubaron en un incubador humidificado a 37 ° C durante 24 h. Las células de la membrana se fijaron, se tiñeron y se contaron. Cada experimento se realizó por triplicado modelo de tumor de xenoinjerto.
Ratones hembra atímicos joven (6 semanas de edad) fueron adquiridos desde el Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad de Nanjing. Aproximadamente 1,5 × 10 se inyectaron 6 células SGC-7901 estables que llevan P2GM-miR-206 o el vector vacío por vía subcutánea en los flancos inferiores de 5 ratones desnudos. Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 días a partir de la sexta inyección días poste en adelante durante 24 días antes de que se sacrificaron los animales. El volumen final y el peso se midieron después de que los tumores se diseccionaron. Los ratones desnudos fueron manipulados y atendidos según las directrices de NIH de Cuidado de Animales y el empleo en el experimento Centro Animal de la Universidad de Medicina de Nanjing (Nanjing, Jiangsu, la provincia, República Popular China).
El análisis estadístico
análisis estadístico se realizó mediante el paquete de software SPSS (SPSS versión 16.0 Estándar, SPSS Inc). Los datos se muestran como la media ± SEM. Las muestras pareadas t-test
se utilizó en el análisis del diferencial de la expresión de miR-206 entre el tumor y los tejidos normales. Para in vitro e in vivo, T para muestras independientes
-test se utilizó para evaluar la significación de la diferencia entre los grupos de tratamiento y control. valor de P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
descenso de regulación de miR-206 se correlaciona con la tumorigénesis humana cáncer gástrico, la invasión y la metástasis
En una amplia encuesta genoma para la expresión de microARN, que previamente identificado varios miembros de myomiR la familia, a saber, el miR-1 /133a y miR-133b /206, cuyos niveles se redujeron en un cáncer neuroectodérmico (resultados no publicados). Estos microRNAs se conocen principalmente para funcionar en la diferenciación miogénica y, en menor grado, la tumorigénesis de cánceres pediátricos. Para explorar si estas myomiRs también pueden tener un papel en la tumorigensis de los cánceres comunes en el adulto, examinamos sus niveles de expresión por tiempo real cuantificación tallo-bucle RT PCR en una cohorte de tumores gástricos recién resecados y su búsqueda de los tejidos normales, y se encontró que la proporción media de miR-206 en relación con U6 snRNA de los 35 tumores fue 4 veces menor que la de los tejidos normales (Figura 1A). comparación por pares indica que más del 85% de los tumores mostraron una reducción mayor de 2 veces de la expresión de miR-206 en comparación con sus controles de concordancia, con sólo dos pares que muestran aumento (Figura 1B). La expresión de miR-206 también se redujo en un número de líneas celulares de cáncer gástrico humano, incluyendo SGC-7901, BGC-823, MGC-803, y las células AGS, en comparación a la de GES-1 en las células gástricas normales (Figura 1C). registros clinicopatológicas de estos tumores mostraron que la reducción de la expresión de miR-206 se asoció significativamente con la metástasis linfática, invasión local, y la malignidad de estadificación TNM, pero no con la edad, el género, el tamaño del tumor o la ubicación (Tabla 1). Estos datos implican que miR-206 normalmente puede ejercer un control inhibidor sobre la tumorigénesis gástrico, la invasión y la metástasis. Figura 1 Reducción de los niveles de expresión de miR-206 en cáncer gástrico tejidos y líneas celulares. (A) Distribución de la expresión de miR-206 en una cohorte de 35 PG y no cancerosos tejidos humanos mediante qRT-PCR. El ARN U6 endógeno se utilizó como control interno. (B) de comparación por parejas de la expresión de miR-206 entre el GC y su adecuación a los tejidos no cancerosos que muestra la expresión de miR-206 se redujo en un 86% (30/35) de los pares de muestras. (C) Expresión relativa de miR-206 en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico y una línea celular gástrica normal (GES-1).
Tabla 1 Características clínico-patológicas de miR-206
Categorías
NO. de los pacientes
La niveles relativos de miR-206 (media ± SEM)
valor P
Sexo Masculino

21
0,49 ± 0,07
0,32
Mujer página 14
0,40 ± 0,06
Edad (años)
≥60 página 19
0,45 ± 0,05 0,93
Hotel < 60
16
0,46 ± 0,09
Diámetro (cm)
≥5 página 13
0,46 ± 0,09 0,90
Hotel < 5
22
0,45 ± 0.05
Ubicación y medio y proximal de terceros 23
0,47 ± 0,06 0,65

distal de terceros 12
0,42 ± 0,07
grado de diferenciación
bien y moderadamente página 12
0,48 ± 0,07 0,70

mal
23
0,44 ± 0,07
invasión local
T1 + T2
10
0,65 0,07 ± 0,01

T3 + T4
25
0,37 ± 0,05
metástasis de ganglios linfáticos
NO página 14
0,57 ± 0,06 0,04

SÍ
21
0,38 ± 0,07
estadio TNM
I + II página 12
0,60 ± 0,07 0,02

III + IV
23
0,38 ± también se encontró 0,06
expresión de miR-133a que las reguladas en los tumores de los criterios anteriores (archivo adicional 1: Figura S1), pero la expresión de miR-1, cuyos genes se agrupan con los de codificación de miR-133a [14], no era (archivo adicional 2: Figura S2). Desde miR-206 está codificada por un gen único, fue elegido para análisis posteriores.
MiR-206 inhibe el crecimiento de células de cáncer gástrico
Para determinar si miR-206 tiene la propensión para suprimir la tumorigénesis cáncer gástrico, introdujimos un doble cadena de miR-206 imitaciones sintéticas, 206mi, que alteran el nivel del total de miR-206 en células de cáncer gástrico SGC-7901, que expresan un bajo nivel de miR-206 en relación con la de 1 GSE células normales de control (Figura 1C) y monitorizar la tasa de crecimiento de las células usando el colorante de tetrazolio, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT). Tallo-bucle PCR confirmó el nivel elevado de miR-206 en las células transfectadas SGC-7901 (Figura 2a), y los resultados del ensayo de MTT indicó que la tasa de crecimiento de estas células se redujo notablemente en comparación con la de las células que reciben la no imita específicas de control, miR-ctrl, durante un período de 5 días (Figura 2B). También generó un plásmido pre-miR-206 que expresan en el vector P2GM, y el análisis (FACS) activada por fluorescencia de células-mostramos el G1-fase prolongada y la fase S acortada en P2GM-206 (P206) transfectadas en comparación con el vector P2GM transfectaron células SGC-7901 (Figura 2C), corroborando así el resultado del experimento 206mi sinóptico anterior. Si se aumenta el nivel total de miR-206 con 206 mi también resultó en un aumento significativo de la apoptosis en 48 horas en células SGC-7901 sobre los imitadores de control de las células transfectadas como se determina por análisis de citometría de flujo de PI y Anexina V doble absorción (Figura 2D y e). Estos datos indican que miR-206 es un regulador antiproliferativo potente de células de cáncer gástrico cultivadas. Figura 2 La expresión forzada de miR-206 suprime la proliferación de células de cáncer gástrico SGC-7901. (A) Los niveles totales de miR-206 en células SGC-7901 transfectadas con el miR-ctrl o las imitaciones sintéticas de miR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) ensayos de MTT para células SGC-7901 transfectadas con miR-206 imita a una concentración final de 100 nM. A partir de las 24 h post-transfección, los ensayos se leyó cada 24 h durante 5 días consecutivos. Los resultados se expresan como medias ± SEM de tres experimentos independientes. (*** P < 0,0001). (C) Una distribución del ciclo celular de las células histograma que representa SGC-7901 transfectadas transitoriamente con P2GM-miR-206 o P2GM-ctrl (100 nm). Los resultados representan la media ± SEM de tres experimentos independientes (* P < 0,05). (D) Las células fueron consideradas positivas para la tinción con anexina V-FITC y negativos para PI a las 48 h post-transfección tener la apoptosis sufrido. (E) tasa de apoptosis promedio de tres experimentos independientes ± SEM se muestra (*** P < 0,0001).
MiR-206 inhibe la formación de crecimiento de células de cáncer y tumor de xenoinjerto gástrica dependiente de anclaje
Para examinar el largo plazo impacto de miR-206 en el crecimiento celular y la formación de colonias, que genera una línea estable de células SGC-7901, P2GM-miR-206, que expresa el miR-206 a partir de un vector de constitutivamente activa, MSCV-P2GM, y una línea de vector vacío -Sacar las células, P2GM-miRctrl. En primer lugar, se analizó el nivel de expresión de miR-206 en estas dos líneas celulares estables y encontramos que el miR-206 fue elevado dramáticamente en P2GM-miR-206 línea celular estable (Figura 3A). A continuación, se analizó el efecto de miR-206 en el crecimiento dependiente de anclaje de las células tratadas con tripsina escasamente SIEMBRA directamente sobre placa de Petri y visualizar las colonias de células por tinción con cristal violeta siguientes 14 días de cultivo. Los resultados mostraron que las células estables de control de vectores de transporte de formaron significativamente más colonias que las células miR-206 que expresan (Figura 3B y C). Se les inyectó aún más estas células estables por vía subcutánea en la espalda baja dos bilaterales de ratones desnudos, y se controló el crecimiento tumoral diaria. Veinte y cuatro días después de la inyección, estos ratones se sacrificaron y los tumores se extirparon y se pesaron (Figura 3D y E). Los resultados mostraron que los volúmenes medios de los tumores de miR-206 que sobreexpresan crecieron a un ritmo mucho más lento que los tumores de control y el peso final fue significativamente menor que la de los controles (Figura 3F y G). Figura 3 miR-206 suprime el crecimiento celular dependiente de anclaje GC y la formación de tumores de xenoinjertos. (A) El nivel de expresión de miR-206 en P2GM-miR-206 línea celular estable y células estables de control de vectores portadores (*** P < 0,0001). (B) Un millar de células SGC-7901 estables de miR-206 y control negativo se sembraron en placas de 6 pocillos y un ensayo de formación de colonias llevó a cabo. Los resultados representativos de la formación de colonias de P2GM-miR-control, P2GM-miR-206. (C) El número de colonias se contó el día 14 después de la siembra. células SGC-7901 estables de miR-206 crecieron a una menor densidad en comparación con NC. Los resultados representan la media ± SEM de tres experimentos independientes (** P < 0,01). (D) células SGC-7901 con la expresión estable de miR-206 o no se inocularon por vía subcutánea en ambos flancos de ratones desnudos (n = 5 por grupo). Se muestran fotografías representativas de ratones desnudos 24 días después de la inoculación. (E) Los ratones fueron sacrificados y los tumores se pesaron 24 días después de la inoculación, los xenoinjertos con sobreexpresión de miR-206 fueron significativamente menores que los xenoinjertos de control. (F) muestra la curva de crecimiento del tumor (* P < 0,05 y ** P < 0,01). (G) Los tumores de cada grupo se pesaron inmediatamente después de la eliminación. El peso medio de los tumores se indica como medias ± SEM (* P < 0,05).
MiR-206 inhibe la invasión de células de cáncer gástrico y la migración
reducción de la expresión de miR-206 en tumores localmente invasivos y metastásicos (Tabla 1) sugiere que este microARN puede regular proceso migratorio celular. Para determinar si este hecho es el caso, se llevó a cabo la curación de heridas y transwell ensayos de migración que utilizan las células SGC-7901 estables miR-206 que expresan. Los resultados mostraron que la sobreexpresión ectópica de miR-206 provocó una supresión de la migración celular en las células SGC-7901 como es evidente en el ensayo de curación de la herida (Figura 4A y B) y el ensayo de migración de células transwell (Figura 4C y D). sobreexpresión ectópica de miR-206 invasión celular SGC-7901 inhibió adicionalmente como se demuestra por el ensayo de invasión de Matrigel (Figura 4E y F). Por lo tanto, el miR-206 muestra una propiedad de supresión en los ensayos de migración e invasión de células cancerosas in vitro. Figura 4 miR-206 suprime la migración celular y la invasión GC in vitro. (A) El ensayo de cicatrización de heridas mostró diferentes movilidades de células en el miR-control, miR-206 células. La expresión ectópica de miR-206, obviamente, inhibe la migración de células SGC-7901. (B) muestra los resultados estadísticos. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. (** P < 0,01). La sobreexpresión de miR-206 habilidades obstáculo significativo para la migración celular (C) y la invasión (E) en el miR-206 que expresan las células SGC-7901 estables en comparación con el control negativo. (D, F) muestra los resultados estadísticos, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MiR-206 inhibe la metástasis de hígado de GC in vivo
Para investigar el efecto de miR-206 en la metástasis in vivo, se llevó a cabo la cola -vein la inyección de las células solas vector P2GM con ratones desnudos P2GM-miR-206 y, 42 días después de la inyección, se cosecha y se fotografió los hígados (Figura 5A, paneles superiores). H & E tinción de las secciones de tejido indicaron un 7 veces menor número de nódulos tumorales metastásicas por unidad de superficie en los hígados inyectados con P2GM-miR-206 células que los inyectados con células de control P2GM (Figura 5A, paneles inferiores y B). Por otra parte, los tamaños de nódulos tumorales en el hígado inyectado células P2GM-miR-206 eran mucho más pequeños que los del grupo de control (Figura 5A). Este resultado sostiene firmemente que miR-206 normalmente puede tener un papel supresor de tumor prevención de la metástasis de células de cáncer gástrico. Figura 5 miR-206 inhibe la metástasis de hígado de GC in vivo. (A) imágenes macroscópicas representativos de hígado de ratón, 42 días después de la inoculación, (La parte superior). fotografías representativas de H & E manchadas metástasis hepáticas espontáneas. Ampliación: 10 × (el más bajo). Los resultados muestran que los nódulos tumorales en el grupo P2GM-miR-206 eran más pequeñas y menos en comparación con el grupo control. (B) El número de loci de hígado metastásico se contaron y compararon entre los ratones portadores de SGC-7901 células de control de vectores y células que expresan SGC-7901 miR-206. Los datos representan la media ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) el nivel de ARNm relativa de los supuestos objetivos de miR-206 entre SGC-7901-miR-P2GM y células-miR-206 SGC-7901. (D) El nivel de ARNm relativa de los supuestos objetivos de miR-206 entre GES-1 y líneas celulares SGC-7901.
Para determinar el mecanismo por el que el miR-206 ejerce su función anti-metastásico, se realizaron búsquedas para un posible miR 206 genes diana utilizando una combinación de herramientas de adquisición de objetivos de microARN en línea, y con referencias cruzadas a los candidatos resultantes a los que se han notificado a desempeñar un papel en la metástasis. En un grupo de 20 de tales genes, encontramos 9 de ellos (archivo adicional 3: Tabla S1), a saber STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, y K-ras, fueron drásticamente las reguladas por el miR-206 en las células estables P2GM-miR-206 en comparación con sus respectivos niveles en las células estables P2GM vector (Figura 5C). Algunos de estos genes diana de miR-206 eran notablemente hasta reguladas en las células tumorales GC SCG-7901 en comparación con los padres GES-1 células gástricas normales (Figura 5D), lo que sugiere un evento causal probable. Por lo tanto, el miR-206 probable que inhibe la metástasis de las células tumorales GC a través de una red de genes reguladores.
Discusión
Aunque la desregulación de miRNAs se informó en varios tipos de cánceres humanos [19], y la expresión aberrante papel potencial de miRNAs en se understudied cánceres gástricos. Aquí, demostramos que el miR-206 es frecuentemente regulado por disminución en los cánceres gástricos humanos y líneas celulares de cáncer. A la luz de la expresión de miR-206 relatada en varios tipos de tumores, nuestros resultados sugieren que la reducción de la expresión de miR-206 es probable que un evento de pre-requisito en la tumorigénesis. Este requisito se hace aún más relevante cuando se encontró que los niveles bajos de miR-206 se asociaron significativamente con la metástasis linfática, invasión local y el estadio TNM. Esta noción fue corroborado por los resultados de la expresión ectópica de miR-206 en línea celular de cáncer GC SCG-7901, que mostró que el miR-206 reprime la proliferación de células de GC, la formación de colonias, la invasión y la migración. Por último, la capacidad de miR-206 para suprimir la metástasis de las células SCG-7901 en el hígado proporciona una explicación clara para la correlación entre los niveles bajos de miR-206 y cánceres gástricos invasivos y metastásicos. Recientemente se identificó STC2 como un marcador predictivo de metástasis en los ganglios linfáticos en el carcinoma de células escamosas de esófago [20]. La expresión de TrkB y BDNF se asocia con un mal pronóstico en pacientes con NSCLC [21]. Varios estudios han informado de que la expresión de IGF1R es elevada en el cáncer de próstata metastásico y resistencia a la hormona progresión [22, 23]. expresión BCL2 en el cáncer de próstata primario es un marcador de mal pronóstico, con un aumento del riesgo de recidiva [24]. Lo que se dice más arriba que sugiere un papel oncogénico común en el cáncer humano. Además hemos identificado STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF y K-ras como objetivos funcionales putativos de miR-206, como parte de ellos se habló anteriormente. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren un papel supresor de tumores de miR-206 en el cáncer gástrico humano
Evidencia de miR-206 como un supresor del crecimiento tumoral se ha informado en varios tipos de cáncer:. MiR-206 se encontró primero en ser regulados a la baja en ERalpha -positivos tejidos de cáncer de mama humano y la introducción de miR-206 en células MCF-7 de cáncer de mama dependientes de estrógeno inhibe el crecimiento celular de la dosis y dependiente del tiempo de manera [25]. Por otra parte, miR-206 podría promover el crecimiento y la diferenciación del tumor bloque myogenic en ratones xenoinjertados mediante la regulación negativa el producto de la MET proto-oncogén: Met tirosina-quinasa del receptor [26]. Yan también encontró que la inhibición de la función de miR-206 podría contribuir a la proliferación celular aberrante y la migración, lo que lleva al desarrollo rabdomiosarcoma por supresión de la C-Met [16]. Mientras tanto miR-206 se podría utilizar para inhibir la migración de células HeLa y se centran mediante la inhibición de la formación de tanto la proteína Notch3 y ARNm [27]. Además, miR-206 se downregulated en el cáncer de pulmón de alta metástasis en comparación con los tumores de metástasis bajas y tejidos pulmonares normales, la sobreexpresión de miR-206 inhibió la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón [18]. MiR-206 expresión disminuyó en los receptores de estrógenos-α (ER) -positivo endometrial adenocarcinoma endometrioide (CEE) y su sobreexpresión inhibe la proliferación ER-dependiente, deterioro de la capacidad de invasión y inducida por la detención del ciclo celular de líneas de la CEE ER-positivos [28]. Todos estos hallazgos indicaron que miR-206 puede jugar un papel supresor de tumores en diversos tipos de cáncer.
Metástasis contribuye a la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer. GC se ubica como la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo debido a su alta tasa de metástasis, incluyendo los ganglios linfáticos, el peritoneo, hígado, etc. Especialmente la tasa de supervivencia a 5 años del tumor gástrico con metástasis hepáticas no supera el 10% y la mediana supervivencia sin tratamiento es de aproximadamente 3 a 5 meses [29]. Múltiples genes juegan un papel fundamental en la metástasis GC: tales como la sobreexpresión de tipo insulina receptor de factor de crecimiento-I (IGF-IR) y la activación de sus vías de señalización tanto juegan papeles críticos en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico. Llamar a la puerta hacia abajo de la expresión Spl por ARN pequeño inhibidor dirigido a la disminución de IGFIR expresión y crecimiento atenuado y la metástasis de células de cáncer gástrico [30], de lo contrario, IGF1R se puede downregulated de miR-7 y la migración celular GC reducido significativamente y la invasión [31]. Adachi encontró que el bloqueo de IGF-IR está implicado en la supresión de la invasión de células de cáncer a través de regulación a la baja de matrilisina [32]. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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