MicroRNA-206 unterdrückt Magenkrebs Zellwachstum und metastasis

MicroRNA-206 Magenkrebs-Zellwachstum und Metastasierung
Zusammenfassung
Magenkrebs unterdrückt ist eine der führenden Ursachen für Tod durch Krebs weltweit und trägt eine hohe Rate von metastasierendem Risiko. Zusätzlich zu anderen Protein-kodierenden Onkogene und Tumorsuppressorgene, spielen microRNAs eine wichtige Rolle bei Magenkrebs tumorigenen Progression. Hier zeigen wir, dass miR-206 bei deutlich niedrigen Niveau in einer Kohorte von Magentumoren im Vergleich zu ihren passenden normalen Geweben exprimiert wird, und in einer Reihe von Magenkrebs-Zelllinien. Die Herunterregulierung von miR-206 war besonders signifikant in Tumoren mit lymphatischen Metastasierung, lokale Invasion und erweiterte TNM. Wir finden, dass gezwungen Expression von miR-206 unterdrückt die Proliferation, Koloniebildung und Xenotransplantat tumorigenesis von SCG-7901-Zellen, eine Linie von Magenkrebszellen. Forced Expression von miR-206 unterdrückt auch SCG-7901 Zellmigration und Invasion sowie Metastasen in der Zellkultur oder Schwanz-Vene injiziert Mausmodelle sind. Die anti-metastatischen Wirkung von miR-206 ist wahrscheinlich durch gezielte Metastasierung regulatorische Gene STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF und K-ras vermittelt, die drastisch waren herunterreguliert durch stabile Expression von exogenen miR -206 in SCG-7901-Zellen. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass miR-206 ein Tumorsuppressor von Magenkrebs ist in den Schritten handeln, die Metastasierung regulieren.
Schlüsselwörter Magenkrebs miR-206 Metastasierung Tumorsuppressor Einführung
Magenkrebs (GC) zählt die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache für Krebs-Todesfälle weltweit [1]. Die Prognose für Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs ist schlecht, trotz der jüngsten Verbesserungen in gastriectomy, Chemotherapie und Strahlentherapie [2]. Da GC eine polygene Erkrankung entstehen als Folge von mehreren Gen Dysregulation ist, Aufklärung des regulatorischen Netzwerkes GC tumorigenesis regeln für die Entwicklung neuer gezielter Therapien unerlässlich ist. Tumorigenesis im Magen
ist ein mehrstufiger Prozess, der genetischen und epigenetischen Veränderungen des Proteins zur Folge -kodierenden sowie nicht-codierende proto-Onkogenen und Tumor-Suppressor-Gene. Wechselwirkungen zwischen Wirt, Umwelt- und bakterielle Faktoren beeinflussen auch die Krankheit Fortschritt. Helicobacter pylori
(HP) Infektion als Hauptrisikofaktor wurde für die GC etabliert; die beiden histologischen Subtypen von Magenkrebs, Darm- und den diffusen Subtypen, beide sind mit HP-Infektion, die zu mehr als 80% der Fälle [3], vor allem in antral /Körper Magenkrebs beiträgt [4]. Mechanistisch wurde HP-Infektion eine zweifache Erhöhung der EGF und EGFR in GAVE Biopsiegewebe zu verursachen, aber ihre Beseitigung reduziert die Pegel beider Faktoren zu denen der Kontrollen [5]. HP-Infektion bei Patienten mit chronischer Gastritis auch signifikant mit der Herunterregulierung der E-Cadherin durch erhöhte Promotormethylierung [6] verbunden ist, während Eradikation HP signifikant den Gehalt an MMP-9 reduziert, eine Metalloproteinase positiv mit der Tumorinvasion und Metastasierung assoziiert [ ,,,0],7], in der Kieferhöhle und der Corpusmukosa [8].
Neben HP-Infektion, gibt es eine Vielzahl von Ursachen auf anomale Genexpression bei Magenkrebs führt, und der Mechanismus der Metastasierung von Magenkrebs ist sehr komplex und . Das Ras-abhängige MAPK-Signalisierung, die schließlich zu einer erhöhten Proliferation bei Magenkrebs führt und wird hauptsächlich durch Veränderung von K-ras-Aktivierung verursacht wird, wird häufig mit dem Darm-Typ Magenkrebs assoziiert [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), ein sezerniertes Glycoprotein mit wichtigen Funktionen in Calcium- und Phosphat-Homöostase, wurde berichtet in hohen Niveaus kanzerösen Magengewebe, Lymphknoten-Metastasen exprimiert zu werden, und venöse Invasion [10]. Die 5-Jahres-Überlebensrate war signifikant niedriger bei Patienten mit STC2 Expression im Vergleich zu Patienten ohne STC2 Ausdruck [11]. BDNF (brain-derived neutrophic Faktor) Ausdruck berichtet wurde signifikant erhöhte Expression im Magenkrebsgewebe zu zeigen, im Vergleich zu angrenzenden normalen Schleimhaut und ein hohes Maß an BDNF an der invasiven Front wurden Gefäßinvasion korreliert, Lymphknotenmetastasen, Peritonealdialyse Verbreitung und schlechte Prognose bei Patienten mit Magenkrebs [12]. Trotz der Fortschritte, die oben genannten regulatorischen Gene zu identifizieren, die genaue zugrunde liegende Mechanismus verursacht GC Metastasierung bleibt noch bestimmt werden.
Dysregulation von microRNAs sehr wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielen. Die Rolle von microRNAs in tumorigenesis Magenkrebs ist gut dokumentiert. Hier konzentrieren wir uns auf miR-206, der zusammen mit seinen eng verwandten Paraloge miR-1, 133a und miR-133b, spielt sehr wichtige Rolle bei der Muskeldifferenzierung. Diese vier Mikro-RNAs sind in Sequenz und genomische Organisation hoch konserviert und werden als myomiRs weil sie gefunden wurden, in den Muskeln [13] auf einem hohen Niveau exprimiert werden. MiR-1-1 /miR-133a-2, miR-1-2 /miR-133a-1 und miR-206 /miR-133b bilden Cluster in drei verschiedenen chromosomalen Regionen im menschlichen Genom 20q13.33, 18q11.2 und 6p12.2, respectively. Allerdings können diese miRNAs als Tumorsuppressoren in verschiedenen menschlichen Krebsarten wirken [14]; beispielsweise miR-1 und miR-133a wurden häufig herabreguliert in Blasenkrebs festgestellt, und das Tumorwachstum unterdrücken, indem Targeting TAGLN2 [15]. MiR-1 und miR-206 wurde gezeigt, daß ähnliche Tumor-Suppressor-Rollen in Rhabdomyosarkom besitzen, durch blockierende c-Met Ausdruck [16]. MiR-206 wurde auch als Tumor-Suppressor in Brustkrebs [17], und Lungenkrebs [18] handeln berichtet. Wir berichten hier, dass miR-206 Expression invers mit lymphatischen Metastasierung, lokale Invasion assoziiert ist, und der TNM Bösartigkeit Inszenierung von GC, und zwingen die Expression von miR-206 GC unterdrückt das Zellwachstum, Tumorentstehung und Metastasierung.
Materialien und Methoden
Gewebeproben
Chirurgisch menschlichen Magenkrebs und benachbarten nicht-Tumorgewebe reseziert wurden von 35 Patienten in der Abteilung für Magen-Darm-Chirurgie, der Affiliated Hospital der Nanjing Medical University (Changzhou Zweite Volkskrankenhaus) zugelassen erhalten. Das Projekt wurde von der Forschungsethikkommission der Nanjing Medical University genehmigt, und eine schriftliche Zustimmung wurde von jedem Patienten in die Studie eingeschlossen erhalten. Alle Gewebeproben wurden für die Lagerung in flüssigem Stickstoff verarbeitet und H &. E-Färbung für die pathologische Analyse
Zelllinien und Zellkultur
menschlichen Magenkrebszelllinien SGC-7901, BGC-823, AGS, nicht-bösartigen Magenzelle Linie GES-1, und HEK293T-Zellen wurden aus der Zelle Resource Center, Shanghai Institut für Biochemie und Zellbiologie, die chinesische Akademie der Wissenschaften erworben. Diese Zellen wurden in einer feuchten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 und SGC-7901 gehalten, BGC-823 und GES-1-Zellen wurden in RPMI1640-Medium, HEK293T-Zellen in DMEM und AGS-Zellen in F12K Medium, respectively. Alle Kulturmedien wurden mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika.
RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-PCR
Gesamt-RNA aus Magengewebe oder Zelllinien wurden unter Verwendung von Trizol-Reagenz extrahiert (Takara) gemäß den Anweisungen des Herstellers. cDNA wurde mit dem RT PrimeScript Reagenzienkit (Takara) synthetisiert. Quantitative RT-PCR wurde mit einem SYBR Premix Ex Taq Kit (TaKaRa) auf einer 7500 in Echtzeit PCR-System (ABI) analysiert und mit der SDS-Analyse-Software-Paket (Version 2.0.1, Applied Biosystems) durchgeführt. PCR Primer wurden von Invitrogen erhalten, und die Reaktion war 95 ° C, 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C 15 Sekunden und 60 ° C, 1 min. Die U6 snRNA wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse wurden als Fold-Change vorgestellt, berechnet unter Verwendung der 2 -. △ CT-Verfahren und einem Verhältnis von Ausdruck in den relativen Tumoren zu den normalen Geweben weniger als 1,0 als gering angesehen wurde
Vektor-Konstrukte
Pri -miR-206 wurde aus normalen menschlichen genomischen DNA durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert: 206-For 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'und 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. Das PCR-Fragment wurde in den MSCV-Vektor insertiert P2GM P2GM-miR-206 zu erzeugen. Der leere P2GM Vektor wurde als Kontrolle.
Zelltransfektion
Plasmid Transfektion von SGC-7901-Zellen wurden durchgeführt unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) verwendet und stabile Klone P2GM-miR-206 oder den leeren Vektor tragen, wurden ausgewählt für Puromycin-Resistenz (10 ug /ml). MiR-206 und negative Kontrolle ahmt wurden erhalten von Ribobio (Guangzhou, China) und Transfektion von ahmt in SGC-7901-Zellen wurde unter Verwendung von Oligofectamine (Invitrogen) durchgeführt. Kurz gesagt, SGC-7901-Zellen früher 1 Tag plattiert wurden bei Erreichen von 50% Konfluenz mit 100 nm von miR-206 oder Kontrolle ahmt transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen zur weiteren Analyse weiterverarbeitet.
Zellproliferationsassay
MTT-Assay die proliferative Rate von SGC-7901-Zellen abzuschätzen, wurde verwendet. Kurz gesagt, wurden SGC-7901-Zellen 2 Tage nach der Transfektion trypsinzed und bei 2,5 x 10 3 Zellen pro Vertiefung in 96-Well-Platten reseeded. MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromide) wurde für xx hrs in bestimmten Intervallen zu dem Kulturmedium zugegeben, und die Extinktion bei 490 nm wurde mit einem Spektrophotometer gemessen. Jeder Test wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt und wiederholt dreimal unabhängig.
Koloniebildungstest
Stabile SCG-7901 Zellen, die miR-206 oder die leere Kontrolle wurden trypsinisiert und umplattiert bei 1 × 10 3 pro Well in 6 -well Platten. Nach 14 Tagen in Kultur in RPMI 1640 mit 10% FBS ergänzt wurden die Kolonien mit 3,7% Methanol fixiert und mit 0,1% Kristallviolett gefärbt. Kolonien mindestens 50 Zellen enthielten, wurden erzielt. Jeder Assay wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt.
Durchflusszytometrie
SGC-7901-Zellen transfiziert mit miR-206 mimic oder negative Kontrolle wurden in 1 × Bindungspuffer bei 1 × 10 6 Zellen /ml Trypsin behandelt und erneut suspendiert. 100 ul dieser Zellsuspension wurde mit 5 l FITC-Annexin V und 5 ul propridium Iodid (PI) für 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde mit der Zugabe von 400 &mgr; l 1 × Bindungspuffer beendet und analysiert mit (FACSCalibur der Cellquest Software (Becton Dickinson). FITC-Annexin V-positive und PI-negativen Zellen als apoptotisch und die Experimente angesehen wurden, wurden durchgeführt in Triplikaten.
Migration und Invasion Assays
Heilungszellmigration Wunde wurde durch Messen der Bewegung von Zellen in einem azellulären Bereich durch Abschaben der konfluenten Zellrasen mit einer 200 &mgr; l-Pipettenspitze. der Wundverschluß wurde 48 Stunden erstellt beurteilt später photographiert unter dem Mikroskop. für Transwell Migrationsassays, 5 x 10 4-Zellen wurden in die obere Kammer des Einsatzes hinzugefügt (BD Wissenschaft, Sparks, MD, USA), während 1 x 10 5 Zellen für matrigel verwendet wurden Invasionsassays. in diesen Experimenten wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und in serumfreiem Medium resuspendiert, bevor in die obere Kammer ausgesät zu werden. die vollständige Kulturmedium, das 10% FBS in der unteren Kammer aufgenommen. Die Zellen wurden für 24 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen auf der Membran wurden fixiert, gefärbt und gezählt. Jedes Experiment wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt.
Xenograft-Tumormodell
Junge weibliche athymische Nacktmäuse (6 Wochen alt) aus dem Modell Tier Research Center der Universität Nanjing erworben wurden. Etwa 1,5 x 10 6 stabile SGC-7901-Zellen P2GM-miR-206 oder der Leervektor tragen, wurden subkutan in die unteren Flanken von 5 Nacktmäusen injiziert. Die Tumorvolumina wurden weiter alle 3 Tage ab dem sechsten Tag nach der Injektion gemessen für 24 Tage, bevor die Tiere getötet wurden. Das endgültige Volumen und das Gewicht wurden gemessen, nachdem die Tumoren präpariert wurden. Nacktmäuse wurden manipuliert und gepflegt nach NIH Animal Care und Use Committee Richtlinien im Experiment Tierzentrum der Nanjing Medical University (Nanjing, Jiangsu, Provinz, VR China).
Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von die SPSS-Software-Paket (SPSS Standard-Version 16.0, SPSS Inc.). Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die paarigen-Proben t
-Test wurde bei der Analyse der differentiellen miR-206-Expression zwischen Tumor und normalem Gewebe verwendet. Für die in vitro und in-vivo-Experimenten, bei unabhängigen Stichproben t
-Test wurde für die Beurteilung der Bedeutung der Differenz zwischen den Behandlungs- und Kontrollgruppen verwendet. P-Wert < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wurde.
Ergebnisse | Down-Regulation der miR-206 mit menschlichen Magenkrebs tumorigenesis korreliert, Invasion und Metastasierung
In einer genomweiten Umfrage für microRNA Ausdruck, wir zuvor mehrere Mitglieder identifiziert die myomiR Familie, nämlich miR-1 /133a und miR-133b /206, dessen Spiegel wurden in einem neuroectodermic Krebs (unveroffentlicht) reduziert. Diese Mikro-RNAs wurden in erster Linie bekannt in myogene Differenzierung zu funktionieren und, in geringerem Maße, der Tumorentstehung von pädiatrischen Krebserkrankungen. Um zu untersuchen, ob diese myomiRs auch eine Rolle bei der tumorigensis von häufigen Krebserkrankungen bei Erwachsenen haben könnte, untersuchten wir die Expressionsniveaus von Echtzeit-Stem-Loop-RT-PCR-Quantifizierung in einer Kohorte von frisch Magentumoren reseziert und ihre normale Gewebe passend, und der Median-Verhältnis von miR-206 im Verhältnis von 35 Tumoren U6 snRNA gefunden, daß war 4-fach niedriger als die der normalen Geweben (1A). Paarweisen Vergleich zeigte, dass über 85% der Tumoren zeigten mehr als 2-fache Reduktion von miR-206-Expression im Vergleich zu ihren passenden Kontrollen mit nur zwei Paaren zeigt Erhöhung (1B). Expression von miR-206 verringert wurde auch in einer Anzahl von menschlichen Linien Magenkrebszellen, einschließlich SGC-7901, BGC-823, MGC-803 und AGS-Zellen, im Vergleich zu derjenigen in GES-1 normal Magenzellen (Abbildung 1C). Clinicopathological Aufzeichnungen dieser Tumoren zeigten, dass die Reduktion von miR-206 Expression signifikant mit lymphatischen Metastasierung, lokale Invasion assoziiert war, und der TNM Bösartigkeit Inszenierung, aber nicht mit dem Alter, Geschlecht, Größe des Tumors oder Ort (Tabelle 1). Diese Daten implizieren, dass miR-206 kann in der Regel eine hemmende Kontrolle auf die Magen tumorigenesis, Invasion und Metastasierung ausüben. Abbildung 1 Geringere Mengen von miR-206 Expression in Magenkrebs Geweben und Zelllinien. (A) Verteilung der miR-206 Expression in einer Kohorte von 35 menschlichen GC und noncancerous Gewebe durch qRT-PCR. Die endogene U6-RNA wurde als interne Kontrolle verwendet. (B) paarweisen Vergleich der miR-206 Expression zwischen GC und passender nicht kanzerösen Gewebe zeigt miR-206 Expression in 86% reduziert wurde (30/35) der Probenpaare. (C) Relative Expression von miR-206 in vier GC-Zelllinien und eine normale Magen-Zelllinie (GES-1).
Tabelle 1 Clinicopathologic Eigenschaften von miR-206
Kategorien
NO. der Patienten Relative Ebenen von miR-206
(Mittelwert ± SEM)
P-Wert
Geschlecht
männlich
21
0,49 ± 0,07
0.32
Weiblich
14
0,40 ± 0,06
Alter (Jahre)
≥60
19
0,45 ± 0,05
0,93
< 60
16
0,46 ± 0,09
Durchmesser (cm)
≥5
13
0,46 ± 0,09
0,90
< 5
22
0,45 ± 0,05
Lage
Mitte und proximalen Drittel
23
0,47 ± 0,06
0,65
Distal dritte
12
0,42 ± 0,07
Differenzierungsgrad
gut und mäßig
12
0,48 ± 0,07
0,70
Poorly
23
0,44 ± 0,07
lokale Invasion
T1 + T2 10
0,65 ± 0,07
0,01
T3 + T4
25
0,37 ± 0,05
Lymphknotenmetastase
NO
14
0,57 ± 0,06
0,04
JA
21
0,38 ± 0,07
TNM-Stadium
I + II
12
0,60 ± 0,07
0,02
III + IV
23
0,38 ± , aber die Expression von miR-1, deren Gene sind geclustert mit denen Codierung miR-133a: 0,06
Expression von miR-133a wurde auch von den oben genannten Kriterien (Abbildung S1 Weitere Datei 1) in den Tumoren werden herunterreguliert gefunden [14], war nicht (Weitere Datei 2: Abbildung S2). Da miR-206 durch ein einzigartiges Gen kodiert wird, ist es für die weitere Analyse ausgewählt wurde.
MiR-206 Magenkrebs-Zellwachstum hemmt
Um festzustellen, ob miR-206 die Neigung Magenkrebs tumorigenesis zu unterdrücken hat, haben wir ein synthetischen doppelsträngigen miR-206 imitiert, 206mi, das Niveau der Gesamt miR-206 in SGC-7901 Magenkrebszellen zu ändern, die der von GSE-1 normalen Kontrollzellen (1C) ein niedriges Niveau von miR-206 relativ zum Ausdruck bringen und überwacht, um die Rate des Zellwachstums mit dem Tetrazolium-Farbstoff, 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid (MTT). Stem-loop PCR bestätigte die erhöhten Spiegel von miR-206 in den transfizierten SGC-7901-Zellen (2A), und die Ergebnisse des MTT-Tests zeigten, dass die Wachstumsrate dieser Zellen deutlich im Vergleich zu derjenigen der Zellen verringert war Empfangs nicht spezifische Kontrolle ahmt, miR-Abfrage, die über einen Zeitraum von 5 Tagen (2B). Wir erzeugten auch eine pre-miR-206 exprimierenden Plasmids in dem P2GM Vektor und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) -Analyse zeigte, dass das verlängerte G1-Phase und die verkürzte S-Phase in P2GM-206 (P206) transfiziert Vergleich zu die P2GM Vektor transfiziert SGC-7901-Zellen (2C), wodurch das Ergebnis aus dem obigen Experiment 206mi mimic bestätigende. Erhöhen Sie auch die Gesamthöhe der miR-206 mit 206 mi in einem deutlichen Anstieg der Apoptose in 48 Stunden in SGC-7901-Zellen über die Kontrolle ahmt geführt wie bestimmt transfizierten Zellen durch Durchflusszytometrie-Analyse von PI und Annexin V Doppelaufnahme (2D und E). Diese Daten zeigen, dass miR-206 ist ein potenter anti-proliferative Regulator der kultivierten Magenkrebszellen. Abbildung 2 Forced Expression von miR-206 unterdrückt die Vermehrung von SGC-7901 Magenkrebszellen. (A) Gesamtniveaus von miR-206 in SGC-7901 mit der miR-ctrl-transfizierten Zellen oder den synthetischen Mimetika von miR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) MTT-Assays für SGC-7901-Zellen transfiziert mit miR-206 ahmt in einer Endkonzentration von 100 nM. Ausgehend von 24 h nach der Transfektion wurden die Assays alle 24 h für 5 aufeinanderfolgende Tage lesen. Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. (*** P < 0,0001). (C) Ein Histogramm zeigt die Zellzyklusverteilung von SGC-7901-Zellen transient mit P2GM-miR-206 oder P2GM-ctrl (100 nM). Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten (* P < 0,05). (D) Zellen Färbung positiv für Annexin V-FITC und negativ für PI bei 48 h nach der Transfektion wurden als unterzogen Apoptose zu haben. (E) Durchschnittliche Apoptoserate von drei unabhängigen Experimenten ± SEM gezeigt (*** P < 0,0001).
MiR-206 adhärenten Magenkrebs Zellwachstum und Xenograft Tumorbildung hemmt
langfristig zu untersuchen Auswirkungen von miR-206 auf das Zellwachstum und Koloniebildung erzielten wir eine stabile Linie von SGC-7901-Zellen, P2GM-miR-206, die miR-206 von einem konstitutiv aktiven Vektor, MSCV-P2GM, und eine Reihe von leeren Vektor exprimiert -tragende Zellen, P2GM-miRctrl. Zunächst untersuchten wir die Expression von miR-206 in diesen beiden stabilen Zelllinien und fand heraus, dass miR-206 dramatisch in P2GM-miR-206 stabile Zelllinie (3A) erhöht wurde. Dann untersuchten wir die Wirkung von miR-206 auf verankerungsabhängige Wachstum von dünn direkt auf Petrischale mit Trypsin behandelt Zellen Säen und die Zellkolonien durch Kristallviolett-Färbung visualisiert folgenden 14 Tage der Kultur. Die Ergebnisse zeigten, dass die Vektor-tragenden Steuer stabile Zellen deutlich mehr Kolonien gebildet als die miR-206-exprimierenden Zellen (3B und C). Wir injiziert weiter diese stabilen Zellen subkutan in zwei bilateralen unteren Rücken von Nacktmäusen, und überwacht täglich das Tumorwachstum. Vierundzwanzig Tage nach der Injektion wurden die Mäuse getötet und die Tumore wurden herausgeschnitten und gewogen (3D und E). Die Ergebnisse zeigten, dass die durchschnittlichen Volumina von miR-206-überexprimierenden Tumoren wesentlich langsamer als die Kontrolltumore und der mittleren Endgewicht wuchsen war signifikant geringer als bei den Kontrollen (Figur 3F und G). Abbildung 3 MiR-206 unterdrückt adhärenten GC Zellwachstum und Xenograft Tumorbildung. (A) Die Expression von miR-206 in P2GM-miR-206 stabile Zelllinie und Vektor-tragenden Steuer stabile Zellen (*** P < 0,0001). (B) Eintausend stabile SGC-7901-Zellen von miR-206 und Negativkontrolle wurden auf 6-well-Platten ausplattiert und eine Koloniebildungstest durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse der Koloniebildung von P2GM-miR-Steuerung, P2GM-miR-206. (C) Die Anzahl der Kolonien wurde am 14. Tag nach dem Aussäen gezählt. Stabile SGC-7901-Zellen von miR-206 wurde auf eine niedrigere Dichte im Vergleich zu NC. Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten (** P < 0,01). (D) SGC-7901-Zellen mit stabiler Expression von miR-206 oder nicht subkutan in beide Flanken von Nacktmäusen beimpft (n = 5 pro Gruppe). Repräsentative Fotografien von nackten Mäusen 24 Tage nach der Impfung gezeigt. (E) Die Mäuse wurden getötet und die Tumore wurden gewichtet, 24 Tage nach der Inokulation wurden die Xenotransplantate mit miR-206-Überexpression signifikant kleiner als die Kontroll Xenotransplantaten. (F) zeigt Tumorwachstumskurve (* P < 0,05 und ** P < 0,01). (G) Tumoren aus jeder Gruppe wurden unmittelbar nach der Entnahme gewogen. Die durchschnittliche Tumorgewicht angegeben als Mittelwert ± SEM (* P < 0,05).
MiR-206 Magenkrebszellinvasion und Migration hemmt
verminderte Expression von miR-206 in lokal invasive und metastatische Tumoren (Tabelle 1) schlägt vor, dass diese microRNA Migrationsprozess Zelle regulieren kann. Um festzustellen, ob dies tatsächlich der Fall ist, führten wir die Wundheilung und Transwell-Migrationsassays, die miR-206-exprimierenden stabilen SGC-7901 Zellen. Die Ergebnisse zeigten, dass ektopische Überexpression von miR-206 eine Unterdrückung der Zellmigration in SGC-7901-Zellen verursacht, wie deutlich in der Wundheilungstest (4A und B) und die Transwell-Zellmigrationsassay (4C und D). Ektopische Überexpression von miR-206 weiter verhindert SGC-7901 Zellinvasion wie durch das Matrigel Invasionsassay nachgewiesen (Abbildung 4E und F). Daher angezeigt miR-206 eine unterdrückende Eigenschaft in der Krebszellmigration und Invasion Assays in vitro. Abbildung 4 MiR-206 unterdrückt GC Zellmigration und Invasion in vitro. (A) Die Wundheilungstest zeigte verschiedene Zell Motilitäten in miR-Steuerung, miR-206-Zellen. Die ektopische Expression von miR-206 gehemmt offensichtlich die Migration von SGC-7901-Zellen. (B) zeigt die statistischen Ergebnisse. Daten stellen das Mittel ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. (** P < 0,01). Überexpression von miR-206 erheblich behindert Fähigkeiten der Zellmigration (C) und Invasion (E) in miR-206-exprimierenden stabilen SGC-7901-Zellen im Vergleich zu Negativkontrolle. (D, F) zeigt die statistischen Ergebnisse sind. Daten stellen das Mittel ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MiR-206 Lebermetastasen von GC in vivo
hemmt die Wirkung von miR-206 auf Metastasen in vivo zu untersuchen, führten wir tail out -vein Injektion von P2GM-miR-206 und den Vektor allein P2GM Zellen mit Nacktmäusen, 42 Tage nach der Injektion, wir geerntet und fotografierte die Leber (5A, obere Felder). H & E-Färbung der Gewebeschnitte zeigte eine 7-fach geringere Anzahl von metastatischen Tumorknötchen pro Flächeneinheit in den injizierten Lebern mit P2GM-miR-206-Zellen als jene injiziert P2GM Kontrollzellen (5A, untere Felder, und B). Darüber hinaus wurden die Größen von Tumorknoten in den P2GM-miR-206 Zellen injiziert Lebern viel kleiner als die der Kontrollgruppe (5A). Dieses Ergebnis stark argumentiert, dass miR-206 normalerweise ein Tumor-Suppressor-Rolle kann die Metastasierung von Magenkrebszellen zu verhindern. Abbildung 5 MiR-206 hemmt Lebermetastasen von GC in vivo. (A) Repräsentative makroskopische Bilder von Mäuseleber, 42 Tage nach der Inokulation (obere). Repräsentative Aufnahmen von H & E-gefärbten spontane Lebermetastasen. Vergrößerung: 10 x (Je niedriger). Die Ergebnisse zeigen, dass Tumorknoten in P2GM-miR-206 Gruppe kleiner und weniger waren als in der Kontrollgruppe verglichen. (B) Die Zahl der Leber metastasiertem Loci wurden gezählt und verglichen zwischen Mäusen mit SGC-7901 Vektor-Kontrollzellen und SGC-7901-Zellen, die miR-206. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) Relative mRNA-Ebene von mutmaßlichen Ziele von miR-206 zwischen SGC-7901-miR-P2GM und SGC-7901-miR-206-Zellen. (D) Die relative mRNA-Ebene von mutmaßlichen Ziele von miR-206 zwischen GES-1 und SGC-7901-Zelllinien.
Den Mechanismus zu bestimmen, durch die miR-206 anti-metastatischen Rolle ausübt, suchten wir nach möglichen Mir- 206 Zielgene eine Kombination von Online-mikroRNA Zielerfassungswerkzeugen, und die daraus resultierenden Kandidaten jenen Querverweise, die eine Rolle bei der Metastasierung berichtet. In einem Pool von 20 solcher Gene, fanden wir, von denen 9 (Zusätzliche Datei 3: Tabelle S1), nämlich STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF und K-ras wurden drastisch herunterreguliert von miR-206 in den P2GM-miR-206 stabil Zellen im Vergleich zu ihren jeweiligen Ebenen in den P2GM Vektor stabilen Zellen (5C). Einige dieser miR-206 Zielgene waren stark hochreguliert in den parentalen SCG-7901 GC Tumorzellen im Vergleich zu normalen Magen GES-1-Zellen (Figur 5D), eine wahrscheinliche kausale Ereignis hindeutet. So hemmt miR-206 wahrscheinlich Metastasierung von Tumorzellen GC über ein Netzwerk von regulatorischen Genen.
Discussion
Obwohl Dysregulation der miRNAs wurde in verschiedenen Arten von menschlichen Krebsarten berichtet [19], aberrante Expression und mögliche Rolle von miRNAs in Magenkrebs wurden under. Hier zeigen wir, dass miR-206 häufig in menschlichen Magenkrebs und Krebszelllinien nach unten reguliert wird. Angesichts der Expression reduziert miR-206 in verschiedenen Arten von Tumoren berichtet Unsere Ergebnisse legen nahe, dass miR-206-Expression zu reduzieren, ist wahrscheinlich eine Voraussetzung Ereignis in der Tumorgenese. Diese Forderung wurde noch relevanter gemacht, wenn wir, dass geringe Mengen von miR-206 gefunden wurden, mit lymphatischen Metastasierung signifikant assoziiert, lokale Invasion und TNM-Stadium. Dieser Begriff wurde von den Ergebnissen der ektopische Expression von miR-206 in GC-Krebszelllinie SCG-7901 bestätigt, die zeigten, dass miR-206 GC Zell-Proliferation unterdrückt, die Koloniebildung, Invasion und Migration. Schließlich ist die Fähigkeit von miR-206 zur Metastasierung von SCG-7901-Zellen in der Leber unterdrücken vorgesehen, um eine eindeutige Erklärung für die Korrelation zwischen niedrigen Niveaus von miR-206 und invasive und metastatische Magenkrebs. Kürzlich STC2 wurde als prädiktiver Marker für Lymphknotenmetastasen in Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus-Zell-Karzinom [20] identifiziert. Die Expression von TrkB und BDNF ist mit einer schlechten Prognose bei NSCLC-Patienten assoziiert [21]. Mehrere Studien haben berichtet, dass IGF1 R Expression in metastasierendem Prostatakrebs und Hormonresistenz Progression erhöht ist [22, 23]. BCL2 Expression in primären Prostatakrebs ist ein Marker für schlechte Prognose, mit einem erhöhten Risiko für Rezidiv [24]. Was oben was auf eine gemeinsame onkogene Rolle in der menschlichen Krebs gesagt wird. Ferner haben wir festgestellt STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF und K-ras als mögliche funktionelle Ziele von miR-206, als ein Teil von ihnen oben gesprochen wurden. Zusammengenommen unsere Ergebnisse einen Tumorsuppressor vorschlagen Rolle der miR-206 in der menschlichen Magenkrebs
Nachweis von miR-206 als ein Tumorwachstum Suppressor hat in mehreren Krebsarten berichtet. MiR-206 gefunden wurde zuerst in ERalpha downregulated werden -positiven menschlichen Brustkrebsgewebe und Einführung von miR-206 in Östrogen-abhängigen MCF-7-Brustkrebszellen hemmt das Zellwachstum in einer dosis- und zeitabhängigen Weise [25]. Met-Tyrosin-Kinase-Rezeptor [26]: Darüber hinaus myogenen Differenzierung und Block das Tumorwachstum in Mäusen xenografted miR-206 konnte durch Herunterregulieren des Produkts der MET-Proto-Onkogen fördern. Yan auch festgestellt, dass die Hemmung der miR-206-Funktion auf aberrante Zellproliferation und -migration beitragen könnten, was zu Rhabdomyosarkom Entwicklung durch die Suppression der C-Met [16]. Inzwischen miR-206 verwendet werden könnte, HeLa Zellmigration zu hemmen und die Bildung konzentrieren, indem sowohl Notch3 Protein hemmen und mRNA [27]. Darüber hinaus wurde miR-206 in hoher Metastasierung Lungenkrebs downregulated im Vergleich zu niedrigen Metastasen Tumoren und normalem Lungengewebe, die Überexpression von miR-206 gehemmt Migration und Invasion von Lungenkrebszellen [18]. MiR-206 Expression verringerte sich in Östrogen-Rezeptor-α (ERa) -positiven Endometrium endometrioid Adenokarzinom (EWG) und die Überexpression gehemmt ERa-abhängige Proliferation, Beeinträchtigung der Invasivität und induzierten Zellzyklusarrest von ERa-positive EWG Zelllinien [28]. Alle diese Ergebnisse darauf hin, dass miR-206 eine Tumor-Suppressor-Rolle bei verschiedenen Krebsarten spielen können.
Metastasierung zu den meisten Krebs Todesfälle im Zusammenhang mit beiträgt. GC gilt als die zweithäufigste Ursache für Krebs-Todesfälle weltweit wegen seiner hohen Metastasierungsrate, einschließlich Lymphknoten, Bauchfell, Leber etc. Besonders die 5-Jahres-Überlebensrate von Magentumor mit Lebermetastasen nicht mehr als 10% überschreiten und den Median Überleben ohne Behandlung beträgt etwa 3 bis 5 Monate [29]. Mehrere Gene spielte eine wichtige Rolle bei der Metastasierung GC: wie beispielsweise die Überexpression von insulin-like growth factor receptor-I (IGF-IR) und die Aktivierung der Signalwege sowohl kritische Rolle in der Entwicklung und Progression von Magenkrebs spielen. Knocking-down von Spl-Expression durch kleine inhibitorischen RNA führte zu einer verminderten IGFIR Expression und abgeschwächten Wachstum und die Metastasierung von Magenkrebszellen [30], sonst, IGF1 R kann durch miR-7 und deutlich reduziert GC Zellmigration und Invasion [31] nach unten reguliert werden. Adachi gefunden, dass eine Blockade von IGF-IR ist in der Unterdrückung der Invasion von Krebszellen durch Herunterregulieren der Matrilysin beteiligt [32]. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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