MicroRNA-206 estää mahalaukun syöpäsolujen kasvua ja etäpesäkkeiden

MicroRNA-206 estää mahalaukun syöpäsolujen kasvua ja etäpesäkkeiden
Abstract
Mahalaukun syöpä on yksi johtavista syistä syövän kuoleman maailmanlaajuisesti ja harjoittaa korkea metastaattisen riskin. Lisäksi muita proteiinia koodaavan onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille, MikroRNA tärkeä rooli mahasyövän tuumorigeenisiä etenemistä. Tässä osoitamme, että miR-206 ekspressoituu huomattavan matalalla tasolla kohortin mahalaukun kasvaimet verrattuna niiden vastaavia normaaleista kudoksista, ja useissa mahasyövän solulinjoissa. Down-regulation miR-206 oli erityisen merkittävä kasvaimia imusuonten etäpesäkkeitä, paikallinen invaasio, ja kehittyneet TNM lavastus. Huomaamme, että pakko ilmentyminen miR-206 tukahdutetaan leviämisen, pesäkkeitä muodostumista, ja ksenografti- tuumorigeneesin SCG-7901 solut, linja mahalaukun syöpäsoluja. Pakko ilmentymisen miR-206 myös tukahdutetaan SCG-7901 solumigraation ja invaasio, sekä etäpesäkkeiden soluviljelmissä tai tail-vein pistetään hiiri malleja, vastaavasti. Anti-metastasoitunut vaikutus miR-206 on todennäköisesti välittyy kohdentamalla etäpesäkkeiden säätelygeenit STC2, HDAC4, Klf4 IGF1 R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, ja K-ras, jotka olivat merkittävästi alas-säädellä vakaa ilmentyminen eksogeenisten miR -206 in SCG-7901-soluissa. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että miR-206 on tuumorisuppressorina mahasyövän toimimalla vaiheet, jotka säätelevät etäpesäke.
Avainsanat
Mahasyöpää miR-206 Etäpesäke Kasvain vaimennin Johdanto
Mahasyöpää (GC) riveissä neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Ennuste potilaille, joilla on edennyt mahasyöpä on huono, vaikka viime aikoina parannuksista gastriectomy, kemoterapiaa, ja sädehoitoa [2]. Koska GC on polygenic sairaus, joka syntyy seurauksena useiden geenin säätelyhäiriöiden, selvittäminen sääntely verkon koskevat GC tumorigeneesin on välttämätöntä kehittää uusia hoitomuotoja kehitettäessä.
Tuumorigeneesiä mahassa on monivaiheinen prosessi, joka edellyttää geneettiset ja epigeneettiset muutokset proteiinin ää koodaavien sekä ei-koodaava proto-onkogeenien ja kasvaimen synnyssä. Vuorovaikutus isäntä, ympäristö- ja bakteerien vaikuttavat myös sairauden etenemisestä. Helicobacter pylori
(HP) infektio on todettu olevan merkittävä riskitekijä GC; kaksi histologinen alatyyppi mahalaukun syövän, suoliston ja hajanainen alatyyppejä, jotka molemmat liittyvät HP infektio, joka muodostaa yli 80% tapauksista [3], erityisesti antral /body mahasyövän [4]. Mekanistisesti HP infektio todettiin aiheuttavan kaksinkertaistamiseksi EGF ja EGFR mahalaukun antral koepala kudoksissa, mutta sen poistaminen alentaa veren molempien tekijöiden kuin valvonnan [5]. HP sairastavilla potilailla krooninen gastriitti myös merkitsevästi liittyy alas-säätely E-kadheriinin lisääntyneen promoottori metylaatio [6], kun taas hävittämiseksi HP vähensi MMP-9, metal- positiivisesti liittyy kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [ ,,,0],7], antrumin ja corpus limakalvon [8].
lisäksi HP-infektio, on lukuisia syitä, jotka johtavat poikkeavan geeniekspression mahasyövän, ja mekanismi mahalaukun syövän etäpesäkkeiden on hyvin monimutkainen myös . Ras-riippuvainen MAPK signalointia, joka lopulta johtaa lisääntyneeseen leviämisen mahasyövän ja johtuu pääasiassa aberraatioita K-ras aktivointi, liittyy usein suoliston-tyyppinen mahasyöpä [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), erittyvä glykoproteiini tärkeitä tehtäviä kalsiumin ja fosfaatin homeostaasiin, oli kuitenkin ilmaistava suuria määriä syöpä- mahalaukun kudoksiin, imusolmuke etäpesäke, ja laskimoiden hyökkäys [10]. 5 vuoden pysyvyys oli merkitsevästi pienempi potilailla, joiden STC2 ilme verrattuna potilaisiin ilman STC2 ilmaisun [11]. BDNF (Brain-johdettu neutrophic tekijä) ilmentyminen ilmoitettu osoittavan huomattavasti ilmentymistä mahasyövän kudoksessa verrattuna viereiseen normaaliin limakalvoon, ja korkea BDNF leviämisrintamassa korreloivat astiaan hyökkäystä, imusolmuke etäpesäke, vatsakalvon levittämistä, ja huono ennusteen mahasyöpäpotilaista [12]. Edistyksestä huolimatta tunnistamaan edellä säätelygeenit tarkka oleva mekanismi aiheuttaa GC etäpesäke on vielä määritettävä.
Säätelyhäiriöiden of MikroRNA pelata erittäin tärkeä rooli kasvainten synnyssä. Rooli MikroRNA mahasyövän kasvainten synnyssä on hyvin dokumentoitu. Tässä keskitymme miR-206, joka yhdessä sen läheistä sukua paralogeille miR-1, 133a, ja miR-133b, pelaa hyvin tärkeä rooli lihasten erilaistumista. Nämä neljä MikroRNA ovat erittäin konservoituneita sekvenssiltään, ja genominen organisaatio, ja niitä kutsutaan myomiRs koska niiden todettiin ilmentyvän korkeina tasoina lihaksissa [13]. MiR-1-1 /miR-133a-2, miR-1-2 /miR-133a-1, ja miR-206 /miR-133b muodossa klustereita kolmella eri kromosomaalisia alueita ihmisen perimässä 20q13.33, 18q11.2 ja 6p12.2, vastaavasti. Kuitenkin nämä miRNA voivat toimia tuumorisuppressoreilla eri ihmisen syövissä [14]; Esimerkiksi miR-1 ja miR-133a todettiin usein säädellä vähentävästi virtsarakon syöpien, ja tukahduttaa kasvaimen kasvua kohdistamalla TAGLN2 [15]. MiR-1 ja miR-206 oli osoitettu olevan samanlainen kasvaimeen vaimennin rooleja rabdomyosarkoomasolut kautta estää c-Met ilmaisun [16]. MiR-206 on myös raportoitu toimia kasvaimen vaimennin rintasyövän [17], ja keuhkosyöpä [18]. Me raportoimme tässä, että miR-206 ilmentyminen käänteisesti yhteydessä imusuonten etäpesäkkeitä, paikallinen invaasio, ja TNM maligniteetin lavastus GC, ja pakottaa ilmentyminen miR-206 estää GC solujen kasvua, kasvaimen kehittymisen, ja etäpesäkkeitä.
Materiaalit ja menetelmät
kudosnäytteitä
Kirurgisesti resektoitiin ihmisen mahasyövän ja viereisen ei-kasvain kudokset saatiin 35 potilasta myönsi Department of Ruoansulatuskanavan leikkaus, Affiliated sairaala Nanjing Medical University (Changzhou Second kansan sairaalassa). Projektin hyväksyi Research Ethics komitean Nanjing Medical University, ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ilmoittautunut tässä tutkimuksessa. Kaikki kudosnäytteet käsiteltiin Säilytys nestemäisessä typessä ja H &E-värjäys patologista analysointia.
Solulinjat ja soluviljelmä
Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat SGC-7901, BGC-823, AGS, ei-pahanlaatuisia mahalaukun solujen line GES-1, ja HEK293T solut ostettiin Cell Resource Center, Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian, Kiinan Academy of Sciences. Nämä solut ylläpidettiin kosteuden inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO 2 ja SGC-7901, BGC-823, ja GES-1-soluja viljeltiin RPMI1640, HEK293T-solut DMEM, ja AGS solut F12K medium, vastaavasti. Kaikki viljelyalustassa, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja.
RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR
Kokonais-RNA mahan kudoksissa tai solulinjoissa uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (TaKaRa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin kanssa PrimeScript RT reagenssipakkausta (TaKaRa). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin SYBR Esisekoite Ex Taq (Takara) on 7500 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (ABI) ja analysoitiin SDS-analyysi ohjelmistopaketti (versio 2.0.1, Applied Biosystems). PCR-alukkeet saatiin Invitrogen, ja reaktio oli 95 ° C, 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekunnin ajan ja 60 ° C, 1 min. U6 snRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. Tulokset esitettiin kertainen muutos, joka on laskettu käyttämällä 2 - △ CT menetelmällä, ja suhde ilmentymisen kasvainten suhteen normaaleissa kudoksissa on vähemmän kuin 1,0 katsottiin alhaiset.
Vector rakentaa
Pri -miR-206 monistettiin normaalin ihmisen genomisesta DNA: sta PCR: llä käyttäen alukkeita: 206-For 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'ja 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. PCR-fragmentti insertoitiin MSCV-P2GM vektori tuottaa P2GM-miR-206. Tyhjän P2GM vektoria käytettiin kontrollina.
Cell transfektio
Plasmidi transfektio SGC-7901-soluja suoritettiin käyttäen lipofektamiinia 2000 (Invitrogen), ja kantavia vakaita klooneja, P2GM-miR-206 tai tyhjän vektorin valittiin puromysiiniresistenssille (10 ug /ml). MiR-206 ja negatiivinen kontrolli jäljittelee saatiin Ribobio (Guangzhou, Kiina) ja transfektointi jäljittelee in SGC-7901-soluissa tehtiin käyttämällä Oligofectamine (Invitrogen). Lyhyesti, SGC-7901-solut maljattiin yksi päivä aikaisemmin transfektoitiin 100 nm miR-206 tai ohjaus matkii saavuttamaan 50% konfluenssiin. 48 tunnin kuluttua solut käsitellään edelleen analysointia.
Soluproliferaatiomääritys
MTT-määritystä käytettiin arvioimaan proliferatiivinen nopeus SGC-7901-soluja. Lyhyesti, SGC-7901-soluja trypsinzed 2 päivää transfektion jälkeen ja siirrostettiin 2,5 x 10 3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille. MTT (3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyyli-tetrazoliumbromide) lisättiin elatusaineeseen tietyin välein xx tuntia, ja absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin spektrofotometrillä. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa itsenäisesti.
Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä
Vakaa SCG-7901-solut kuljettavat miR-206 tai tyhjä kontrolli trypsinoitiin ja maljattiin uudelleen 1 x 10 3 per kuoppa 6 -kuoppaiset levyt. Sen jälkeen, kun 14 päivää viljelmässä RPMI 1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, pesäkkeet kiinnitettiin 3,7% metanolia ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Pesäkkeet, jotka sisältävät vähintään 50 solua, pisteytettiin. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena.
Virtaussytometria
SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-206 matkivat tai negatiivinen kontrolli trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen 1 x sitomispuskurissa 1 x 10 6 solua /ml. 100 ui tätä solususpensiota inkuboitiin 5 l FITC-anneksiini V: n ja 5 ui propridium jodidia (PI) 15 minuutin ajan pimeässä. Reaktio lopetettiin lisäämällä 400 ui 1 x sitomispuskurissa ja analysoitiin (FACSCalibur käyttäen CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson). FITC-anneksiini V-positiivisia ja PI-negatiivisia soluja pidettiin apoptoottisten ja kokeet suoritettiin triplikaatit.
muuttoliike ja invaasio määritykset
haavan paranemista migraatiota arvioitiin mittaamalla liikkumista solujen osaksi soluton alueelle luoma raaputtamalla yhtenäinen so- nurmikkoa 200 ul pipetin kärki. haava suljin valokuvattiin 48 tuntia myöhemmin mikroskoopilla. for siirtokuoppaan muuttoliike määrityksiä, 5 x 10 4-soluja lisättiin ylempään kammioon insertin (BD Science, Sparks, MD, USA), kun taas 1 x 10 5-soluja käytettiin matrigeeliä invaasio määrityksiä. näissä kokeissa solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen seerumia ennen kuin se ympättiin ylempään kammioon. koko viljelyväliaine, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. Soluja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solut kalvon kiinnitettiin, värjättiin, ja laskettiin. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.
Vieraslajisiirteen kasvainmuoto
nuori nainen atyymisissä karvattomia hiiriä (6 viikon ikäisiä) hankittiin malli Animal Research Center of Nanjingin yliopisto. Noin 1,5 x 10 6 vakaa SGC-7901-solujen kuljettaa P2GM-miR-206 tai tyhjän vektorin injektoitiin ihonalaisesti alempaan kylkiin 5 nude-hiirten. Tuumoritilavuudet mitattiin 3 päivän välein kuudentena päivänä injektion eteenpäin 24 päivää ennen eläimet tapettiin. Lopullinen tilavuus ja paino mitattiin sen jälkeen, kun kasvaimet leikattiin. Nude-hiiret manipuloitu ja hoidetaan mukaan NIH Animal Care ja käyttö komitean suuntaviivojen Experiment Animal Center of Nanjing Medical University (Nanjing, Jiangsu, maakunnassa, PR China).
Tilastollinen analyysi
Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistopaketti (SPSS Standard versio 16.0, SPSS Inc.). Aineisto näytetään keskimääräisenä ± SEM. Pariksi-otosten t
-testiä käytettiin analysoitaessa ero miR-206 ilmentymisen välillä kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa. In vitro ja in vivo kokeissa, itsenäinen-otosten t
-testi käytettiin merkityksen arviointiin ero käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. P-arvo < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
Down-regulation of miR-206 korreloi ihmisen mahasyöpä kasvaimien syntyyn, invaasio ja metastaasi
genomin laaja kysely microRNA ilmaisun, olemme aiemmin tunnistettu useita jäseniä myomiR perhe, eli miR-1 /133a ja miR-133b /206, joiden tasot alenivat on neuroectodermic syöpä (julkaisemattomat tulokset). Nämä MikroRNA olivat ensisijaisesti tunnettu toimia myogenic erilaistumista ja vähäisemmässä määrin myös kasvaimen kehittymisen pediatristen syöpiä. Tutkitaan jos myomiRs saattaisi olla rooli tumorigensis on yleisimmistä syövistä aikuinen, tutkimme niiden ekspressiotasot reaaliaikaisella kantasilmukan RT-PCR kvantifiointiin kohortin tuoreeltaan toistoleikattiin mahalaukun kasvaimet ja niiden vastaavat normaaleissa kudoksissa, ja todettiin, että mediaani suhde miR-206 suhteessa U6 snRNA 35 kasvainten oli 4 kertaa pienempi kuin normaalien kudosten (kuvio 1A). Pareittain vertailu osoitti, että yli 85% kasvaimista osoitti yli 2-kertainen väheneminen miR-206 ilmentymisen verrattuna niiden matching valvontaa, jossa vain kaksi paria osoittavat kasvua (kuvio 1 B). Expression of miR-206 väheni myös useissa ihmisen mahasyövän solulinjoissa, mukaan lukien SGC-7901, BGC-823, MGC-803, ja AGS soluja verrattuna, että GES-1-normaalista mahalaukun soluja (kuvio 1C). Kliinis kirjaa näistä kasvaimista osoittivat, että vähentäminen miR-206 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä imusuonten etäpesäkkeitä, paikallinen invaasio, ja TNM maligniteetin lavastus, mutta ei iän, sukupuolen, kasvaimen koko tai sijainti (taulukko 1). Nämä tiedot merkitsevät sitä, että miR-206 voi yleensä käyttää estävä valvonta mahalaukun tumorigeneesin, invaasio, ja etäpesäkkeitä. Kuvio 1 Alentuneita miR-206 ilmentymisen mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. (A) Distribution of miR-206 ilmentymisen kohortin 35 ihmisen GC ja noncancerous kudoksista qRT-PCR. Endogeeninen U6-RNA käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) pareittainen vertailu miR-206 ilmentymisen välillä GC ja vastaavat ei-syöpä kudoksissa miR-206 ilmentyminen väheni 86% (30/35) näytteen paria. (C) Suhteellinen ilmentyminen miR-206 neljän GC solulinjoissa ja normaali mahan solulinja (GES-1).
Taulukko 1 ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia miR-206
Kategoria
NO. potilaista
suhteelliset tasot miR-206 (keskiarvo ± SEM)
P-arvo
Sukupuoli
Mies
21
0.49 ± 0,07
0,32
Female
14
0,40 ± 0,06
Ikä (vuotta) B ≥60
19
0,45 ± 0,05
0,93
< 60
16
0,46 ± 0,09
Halkaisija (cm) B ≥5
13
0,46 ± 0,09
0,90
< 5
22
0,45 ± 0.05
Sijainti
Lähi ja noin kolmanneksen
23
0,47 ± 0,06
0,65
Distal kolmas
12
0,42 ± 0,07
erottelua
hyvin ja kohtalaisesti
12
0,48 ± 0,07
0,70
Huonosti
23
0,44 ± 0,07
Paikallinen invaasio
T1 + T2
10
0,65 ± 0,07
0,01
T3 + T4
25
0,37 ± 0,05
Imusolmuke etäpesäke
NO
14
0,57 ± 0,06
0,04
KYLLÄ
21
0,38 ± 0,07
TNM
I + II
12
0,60 ± 0,07
0.02
III + IV
23
0,38 ± 0,06
ilmentäminen miR-133a havaittiin myös olevan alassäädetty kasvaimissa edellä kriteerit (Additional tiedosto 1: Kuva S1), mutta ilmaus miR-1, joiden geenit ovat ryhmittyneet kanssa, jotka koodaavat miR-133a [14], ei ollut (Additional tiedosto 2: Kuva S2). Koska miR-206 koodaa ainutlaatuinen geeni, se valittiin lisäanalyysiä varten.
MiR-206 estää mahalaukun syövän solujen kasvua
Sen määrittämiseksi, onko miR-206 on taipumus estää mahalaukun syövän kasvainten synnyssä, otimme käyttöön synteettinen kaksijuosteinen miR-206 jäljittelee, 206mi, muuttamaan tasolle koko miR-206 SGC-7901 mahalaukun syöpäsoluja, jotka ilmentävät alhainen miR-206 suhteessa, että GSE-1 tavanomaisen ohjauksen soluissa (kuvio 1 C) ja seurataan määrä solujen kasvua käyttämällä tetratsoliumväriaine 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT). Kantasilmukan PCR vahvisti kohonnut miR-206 transfektoiduissa SGC-7901-soluissa (kuvio 2A), ja tulokset MTT määritys osoitti, että kasvu näiden solujen väheni merkittävästi verrattuna solujen vastaanottaa ei- erityinen valvonta- jäljittelee, miR-ctrl, yli 5 vuorokauden ajan (kuvio 2B). Olemme myös tuotti ennalta miR-206 ilmentävien plasmidi P2GM vektori, ja fluoresointiaktivoituneiden-cell-lajittelu (FACS) analyysi osoitti, että pitkäaikainen G1-faasin ja lyhennetään S-vaihe P2GM-206 (P206) transfektoitu verrattuna P2GM vektori transfektoidaan SGC-7901-soluja (kuvio 2C), mikä vahvistavia tulos edellä 206mi matkivat koe. Keinotekoisesti lisätä kokonaistaso miR-206 206 mi johti myös merkittävään kasvuun apoptoosin 48 tuntia in SGC-7901-solujen yli ohjaus jäljittelee transfektoidut solut määritettynä virtaussytometrianalyysin PI ja anneksiini V kaksinkertainen sisäänoton (kuvio 2D ja E). Nämä tiedot osoittavat, että miR-206 on voimakas antiproliferatiivinen säädin viljeltyjen mahalaukun syövän soluissa. Kuva 2 Pakko ilmentymisen miR-206 estää leviämisen SGC-7901 mahalaukun syöpäsoluja. (A) Yhteensä tasot miR-206 SGC-7901 transfektoitu miR-ctrl tai synteettisiä jäljittelee Mir-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) MTT määritykset SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-206 jäljittelee lopulliseen konsentraatioon 100 nM. Alkaen 24 tuntia transfektion määrityksissä luettiin 24 tunnin välein 5 päivän ajan. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (*** P < 0,0001). (C) Histogrammi kuvaa solusyklin jakautuminen SGC-7901-soluja transfektoitiin väliaikaisesti P2GM-miR-206 tai P2GM-ctrl (100 nM). Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (* P < 0,05). (D) Solut värjäys positiivisia anneksiini V-FITC ja negatiivinen PI 48 h transfektion jälkeen katsottiin olevan tehty apoptoosin. (E) keskiarvo apoptoottista nopeudella kolmen erillisen kokeen ± SEM on esitetty (*** P < 0,0001).
MiR-206 estää kiinnittymisestä riippuvainen mahalaukun syöpäsolujen kasvua ja ksenograftin kasvaimen muodostumisen
Tarkastellaan pitkällä aikavälillä vaikutus miR-206 solun kasvuun ja pesäkkeiden muodostumista, me syntyy vakaa linja SGC-7901-solujen, P2GM-miR-206, joka ilmaisee miR-206 konstitutiivisesti aktiivisen vektorin, MSCV-P2GM, ja linja tyhjän vektorin kuljettavan solut, P2GM-miRctrl. Ensin tarkasteltiin ilmentymisen taso miR-206 näissä kahdessa vakaa solulinjojen ja totesi, että miR-206 dramaattisesti koholla P2GM-miR-206 vakaa solulinja (kuvio 3A). Sitten analysoitiin vaikutusta miR-206 ankkurista riippuva kasvu harvaan siemennys trypsinoitiin soluja suoraan petrimaljaan ja visualisoida solupesäkkeet kristalliviolettivärjäys- värjäys seuraavan 14 päivän kulttuuria. Tulokset osoittivat, että vektorin kantava ohjaus vakaa solut muodostivat merkitsevästi enemmän pesäkkeitä kuin miR-206-ilmentäviä soluja (kuvio 3B ja C). Olemme edelleen pistetään nämä vakaa soluja ihon alle kahteen kahdenvälistä alempaa selän nude-hiirten, ja seurataan kasvaimen kasvua päivittäin. Kaksikymmentäneljä päivää injektion, nämä hiiret tapettiin ja tuumorit leikattiin ja punnittiin (kuvio 3D ja E). Tulokset osoittivat, että keskimääräinen määriä miR-206-yli-ilmentävät kasvaimet kasvoivat paljon hitaammin kuin kontrolli kasvaimet ja keskimääräinen lopullinen paino oli huomattavasti pienempi kuin valvonta (kuvio 3F ja G). Kuva 3 MiR-206 estää kiinnittymisestä riippuvaisen GC solujen kasvua ja ksenograftin kasvaimen muodostumisen. (A) Ilmaisu taso miR-206 P2GM-miR-206 vakaa solulinjasta ja vektorin kantava ohjaus vakaa soluja (*** P < 0,0001). (B) Tuhat vakaa SGC-7901 solut miR-206 ja negatiivinen kontrolli maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja pesäkemuodostusta suorittaa. Edustaja tulokset pesäkkeiden muodostumisen P2GM-miR-ohjaus, P2GM-miR-206. (C) määrä pesäkkeiden laskettiin 14. päivänä sen jälkeen, kun kylvö. Vakaa SGC-7901 solut miR-206 kasvoi pienempi tiheys kuin NC. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta riippumattomasta kokeesta (** P < 0,01). (D) SGC-7901-solujen stabiilia ekspressiota miR-206 tai istutettiin ihonalaisesti molempiin kylkiin nude-hiirten (n = 5 ryhmää kohden). Edustavia valokuvia nude-hiirten 24 päivää ymppäyksen jälkeen näkyvät. (E) Hiiret tapettiin ja tuumorit punnittiin 24 päivää ymppäyksen jälkeen ksenografteissa kanssa miR-206 yliekspressio olivat huomattavasti pienempiä kuin kontrolli-ksenografteissa. (F) esittää kasvaimen kasvukäyrä (* P < 0,05 ** P < 0,01). (G) kasvaimet kustakin ryhmästä punnittiin välittömästi poiston jälkeen. Keskimääräinen kasvaimen paino on ilmoitettu keskiarvoina ± SEM (* P < 0,05).
MiR-206 estää mahalaukun syöpäsoluinvaasiota ja muuttoliike
alennetulla ilmentymisen miR-206 paikallisesti invasiivisia ja etäpesäkkeitä (taulukko 1) ehdottaa, että tämä microRNA voi säädellä solun muuttoprosessista. Voit selvittää, tämä todellakin on, suoritimme haavan paranemista ja siirtokuoppaan muuttoliike määrityksiä käyttäen miR-206-ilmentäviä stabiileja SGC-7901-soluissa. Tulokset osoittivat, että kohdunulkoinen yliekspressio miR-206 aiheutti tukahduttaminen soluvaelluksen SGC-7901-soluissa näkyy arpeutumisprosessit määritys (kuvio 4A ja B) ja siirtokuoppaan solun migraatiokokeessa (kuvio 4C ja D). Kohdunulkoinen yli-ilmentymisen miR-206 edelleen esti SGC-7901 soluinvaasiota osoituksena Matrigel invaasiomääritys (kuva 4E ja F). Siten miR-206 näytetään tukahduttava kiinteistön syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota määrityksissä in vitro. Kuva 4 MiR-206 estää GC solujen vaeltamiseen ja invaasiota in vitro. (EN) arpeutumisprosessit testi osoitti eri solu motilities in miR-ohjaus, miR-206 soluja. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-206 ilmeisesti esti migraation SGC-7901-soluissa. (B) esittää tilastollisia tuloksia. Data edustaa keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (** P < 0,01). Yli-ilmentyminen miR-206 estää merkittävästi kyvyt solumigraation (C) ja invaasiota (E) miR-206-ilmentäviä stabiileja SGC-7901-soluissa verrattuna negatiiviseen kontrolliin. (D, F) esittää tilastollisia tuloksia vastaavasti. Data edustaa keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MiR-206 inhiboi maksan etäpesäke GC in vivo
tutkimiseksi vaikutuksen miR-206 etäpesäkkeitä in vivo, toteutimme häntää -vein injektio P2GM-miR-206 ja vektori yksin P2GM solujen nude-hiirissä 42 päivän kuluessa injektion, me korjataan ja valokuvattu maksa (kuvio 5A, ylemmät paneelit). H &E-värjäys kudosleikkeiden osoitti 7-kertaa pienempi määrä metastaattisen kasvaimen kyhmyjä pinta-alayksikköä kohti on maksa injektoitu P2GM-miR-206-soluja kuin ne, jotka injektoitiin P2GM kontrollisolut (kuvio 5A, alempi paneelit ja B). Lisäksi koot kasvaimen kyhmyjä P2GM-miR-206 solu-ruiskutetaan maksa olivat paljon pienempiä kuin kontrolliryhmässä (kuvio 5A). Tämä tulos vahvasti mukaan miR-206 yleensä voi olla tuumorisuppressorina rooli estää etäpesäke mahalaukun syöpäsoluja. Kuva 5 MiR-206 inhiboi maksan etäpesäke GC in vivo. (A) edustaja makroskooppisen kuvia hiiren maksan, 42 päivää inokulaation jälkeen, (Ylempi). Edustavia valokuvia H &E värjättyä spontaani maksametastaaseja. Suurennus: 10 x (Alempi). Tulokset osoittavat, että kasvaimen kyhmyjä P2GM-miR-206 ryhmä olivat pienempiä ja vähemmän verrattuna kontrolliryhmään. (B) numerot maksan metastasoituneen loci laskettiin ja verrattiin hiirillä SGC-7901 vektorisäädön soluja ja SGC-7901 solut, jotka ilmentävät miR-206. Data edustaa keskiarvoja ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) Suhteellinen mRNA taso otaksuttu tavoitteista miR-206 välillä SGC-7901-miR-P2GM ja SGC-7901-miR-206 soluja. (D) suhteellinen mRNA-tasolla ja oletetun tavoitteet miR-206 välillä GES-1 ja SGC-7901-solulinjat.
Määrittämiseksi mekanismi, jonka miR-206 saa aikaan anti-metastaattinen rooli, etsittiin mahdollista asennuspalveli- 206 kohdegeenien yhdistämällä verkossa mikroRNA kohde hankinta työkaluja, ja rajat viitataan tuloksena ehdokkaita, jotka on ilmoitettu rooli etäpesäke. Poolissa 20 sellaisten geenien, löysimme joista 9 (Additional tiedosto 3: Taulukko S1), nimittäin STC2, HDAC4, Klf4 IGF1 R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, ja K-ras, olivat huomattavasti alassäädetty by miR-206 P2GM-miR-206 stabiili soluissa verrattuna niiden tasot P2GM vektorin stabiili soluissa (kuvio 5C). Jotkut näistä miR-206 kohdegeenien olivat selvästi säädellään ylöspäin vanhempien SCG-7901 GC kasvainsolut verrattuna normaaliin mahalaukun GES-1-soluissa (kuvio 5D), mikä viittaa todennäköisesti syy tapahtuma. Siten miR-206 todennäköisesti estää etäpesäkkeiden GC kasvainsolujen verkoston kautta sääntelyn geenien.
Keskustelu
Vaikka häiriöstä miRNA ilmoitettiin erilaisten ihmisen syöpien [19], poikkeava ilme ja mahdollinen rooli miRNA vuonna mahasyövistä oli tutkittu ilmiö. Tässä osoitamme, että miR-206 on usein vaimentua ihmisen syöpien ja syöpäsolun linjat. Valossa alennetun miR-206 ilmentymistä on raportoitu useita erilaisia ​​kasvaimia, tulokset viittaavat siihen, että vähentäminen miR-206 ilmaisu on todennäköisesti edellytys tapahtuma kasvaimien syntyyn. Tämä vaatimus on vieläkin enemmän merkitystä, kun huomasimme, että alhainen miR-206 liittyivät merkittävästi imusuonten etäpesäkkeitä, paikallinen invaasio, ja TNM-luokitus. Tämä käsite vahvistivat tulokset kohdunulkoisen ilmentymisen miR-206 GC syöpäsolulinja SCG-7901, joka osoitti, että miR-206 tukahdutettu GC solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumista, invaasio, ja muuttoliike. Lopuksi, kyky miR-206 tukahduttaa etäpesäkkeiden SCG-7901 solut maksassa tarjosi selkeän selityksen välisen korrelaation alhaisen miR-206 ja invasiivisen ja metastaattisen syöpien. Äskettäin STC2 todettiin ennakoiva markkerina imusolmuke etäpesäke ruokatorven squamous-cell carcinoma [20]. Expression of TrkB ja BDNF on yhteydessä huonoon ennusteeseen pienisoluista keuhkosyöpää [21]. Useissa tutkimuksissa on raportoitu, että IGF1 R ilmentyminen on kohonnut metastaattisen eturauhassyövän ja hormoni vastus etenemistä [22, 23]. BCL2 ilmentymisen ensisijainen eturauhasen syöpä on merkkiaine huono ennuste, lisääntynyt riski uusiutumisen [24]. Yllä mainittu on ehdottaa yhteistä kasvaimia synnyttävän rooli ihmisen syövässä. Lisäksi tunnistimme STC2, HDAC4, Klf4 IGF1 R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF ja K-ras putatiivisiksi toiminnallinen kohteina miR-206, osana heistä puhunut edellä. Yhdessä meidän havainnot viittaavat tuumorisuppressorina roolin miR-206 ihmisen mahasyövän.
Todisteet miR-206 kasvaimen kasvua vaimennin on raportoitu useissa syövissä: miR-206 oli ensimmäinen havaittu vaimentua vuonna ERalpha positiivisia ihmisen rintasyöpä kudoksiin ja käyttöönotto miR-206 osaksi estrogeeniriippuvainen MCF-7 rintasyöpäsolujen estää solukasvua annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla [25]. Lisäksi miR-206 voisi edistää myogenic erilaistumista ja lohko kasvaimen kasvua ksenosiirrettyjä hiirillä vähen- tämisessä tuote MET esikasvaintekijän: Met tyrosiini-kinaasireseptoriakti- [26]. Yan totesi myös, että inhibitio miR-206 toiminto voitaisiin edistää poikkeavan solun proliferaatio ja migraatio, mikä rhabdomyosarkooma kehitystä tukahduttaminen C-Met [16]. Samaan miR-206 voidaan käyttää estämään HeLa solujen vaeltamiseen ja keskittyä muodostumista estämällä sekä Notch3 proteiini ja mRNA [27]. Lisäksi miR-206 säädeltiin vähentävästi suuria etäpesäkkeitä keuhkosyöpä verrattuna alhainen etäpesäkkeiden kasvaimet ja normaali keuhkojen kudoksia, yliekspressio miR-206 esti muuttoliike ja invaasion keuhkosyövän soluihin [18]. MiR-206 ilmentyminen väheni estrogeenireseptori-α (ERa) -positiivinen endometriumin endomet- adenokarsinooma (ETY) ja sen yli-ilmentymisen esti ERa-riippuvaisen proliferaation, heikentynyt invasiivisuus ja indusoi solusyklin pidätyksen ERa-positiivisten ETY solulinjoissa [28]. Kaikki nämä löydökset osoittivat, että miR-206 voi olla tuumorisuppressorina rooli erilaisten syöpien.
Etäpesäke vaikuttaa eniten syöpään liittyvät kuolemat. GC riveissä toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti, koska sen korkea myös potilaat, joiden imusolmuke, vatsakalvon, maksa jne. Erityisesti 5 vuoden pysyvyys mahalaukun kasvain maksametastaaseihin enintään 10% ja mediaani selviytyminen ilman hoitoa on noin 3-5 kuukautta [29]. Useita geenejä ollut keskeinen rooli GC etäpesäke: esimerkiksi yli-ilmentymisen insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptori-I (IGF-IR) ja aktivoituminen sen signalointireittien molemmat kriittisiä rooleja kehittymistä ja etenemistä mahasyövän. Koputtaa-alas Spl ilmaisun pienten estävän RNA vähensivät IGFIR ilmaisun ja heikennettyjä kasvua ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolujen [30], muuten IGF1 R voi vaimentua by miR-7 ja vähensi GC solumigraatioon ja invaasiota [31]. Adachi havaittu, että saarto IGF-IR on mukana tukahduttaminen syöpäsoluinvaasiota kautta downregulation matrilysiini [32]. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Endoteelin lipaasiproteiinin on lupaava virtsan biomarkkereiden diagnosointiin mahasyöpä
• Merkitys valereseptori 3 (DcR3) ja ulkoisen signaalin säännelty kinaasi 1/2 (Erk1 /2) mahalaukun cancer