MicroRNA-206 sopprime la crescita delle cellule del cancro gastrico e metastasi

MicroRNA-206 sopprime la crescita delle cellule del cancro gastrico e metastasi
Abstract
cancro gastrico è una delle principali cause di morte in tutto il mondo il cancro e porta un alto tasso di rischio metastatico. Oltre ad altri oncogeni codificanti proteine ​​e geni oncosoppressori, microRNA svolgono un ruolo importante nella progressione del cancro gastrico oncogeno. Qui mostriamo che miR-206 è espressa a livelli notevolmente bassi in una coorte di tumori gastrici rispetto ai tessuti normali corrispondenti, e in un certo numero di linee di cellule di cancro gastrico. Down-regolazione di miR-206 è stato particolarmente significativo nei tumori con metastasi linfatica, invasione locale, e avanzato stadiazione TNM. Troviamo che l'espressione forzata del miR-206 ha soppresso la proliferazione, colonia di formazione, e xenotrapianto di cellule tumorigenesi SCG-7901, una linea di cellule di cancro gastrico. espressione forzata del miR-206 anche soppresso la migrazione SCG-7901 e l'invasione delle cellule, così come metastasi in colture cellulari o modelli di mouse iniettati di coda venosa, rispettivamente. L'effetto anti-metastatico del miR-206 è probabilmente mediato di mira metastasi geni regolatori STC2, HDAC4, Klf4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, e K-ras, che sono stati drasticamente down-regolato da espressione stabile di esogena miR -206 nelle cellule SCG-7901. Nel loro insieme, i nostri risultati indicano che miR-206 è un soppressore del tumore del cancro gastrico agire in passi che regolano la metastasi.
Parole
cancro gastrico miR-206 metastasi tumorali soppressore Introduzione
cancro gastrico (GC), si classifica il la quarta più comune di cancro e la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo [1]. La prognosi per i pazienti con cancro gastrico avanzato è scarsa, nonostante i recenti miglioramenti nella gastriectomy, la chemioterapia, la radioterapia e [2]. Dal momento che GC è una malattia poligenica derivanti come il risultato di molteplici Sregolazione gene, delucidazione della rete normativo che disciplina GC tumorigenesi è indispensabile per lo sviluppo di nuove terapie mirate.
Tumorigenesis nello stomaco è un processo a più fasi che comporta alterazioni genetiche ed epigenetiche di proteine -coding così come non codificante proto-oncogeni e geni oncosoppressori. Interazioni tra ospite, ambientali e fattori batterici influenzano anche il progresso della malattia. Helicobacter pylori
(HP) l'infezione è stata stabilita come un importante fattore di rischio per GC; i due sottotipi istologici di cancro gastrico, intestinale e sottotipi diffuse, sono entrambi associati con l'infezione HP, che contribuisce a più del 80% dei casi [3], in particolare nel cancro gastrico antrale /corpo [4]. Meccanicisticamente, infezioni HP è stato trovato per causare un raddoppio EGF e EGFR in tessuti bioptici antrali gastriche, ma la sua eliminazione riduce i livelli di entrambi i fattori a quelli dei controlli [5]. infezione HP nei pazienti con gastrite cronica è anche significativamente associato con down-regulation di E-caderina causa di un aumento della metilazione promotore [6], mentre eradicazione HP ha ridotto in modo significativo i livelli di MMP-9, un metalloproteinasi positivamente associato con l'invasione del tumore e metastasi [ ,,,0],7], nel antro e il corpus mucosa [8].
Oltre alle infezioni HP, vi è una molteplicità di cause di espressione genica aberrant nel cancro gastrico, e il meccanismo di metastasi del cancro gastrico è molto complessa e . La segnalazione MAPK Ras-dipendente, che alla fine porta ad un aumento della proliferazione di cancro gastrico ed è causata principalmente da aberrazioni di attivazione K-ras, è spesso associato con il tipo intestinale cancro gastrico [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), una glicoproteina secreta con importanti funzioni in omeostasi del calcio e fosfato, è stato segnalato per essere espresso in alti livelli tessuti cancerosi gastrico, metastasi linfonodali, e l'invasione venosa [10]. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni era significativamente più bassa nei pazienti con espressione STC2 rispetto ai pazienti senza espressione STC2 [11]. BDNF (Brain-derived factor neutrofiche) espressione è stato segnalato per mostrare in modo significativo una maggiore espressione nel tessuto cancro gastrico rispetto alla adiacente mucosa normale, e alti livelli di BDNF nella parte anteriore invasiva sono stati correlati alla invasione vascolare, metastasi linfonodali, la diffusione peritoneale, e poveri la prognosi nei pazienti affetti da cancro gastrico [12]. Nonostante i progressi nell'identificazione dei geni regolatori di cui sopra, il preciso meccanismo di fondo che causa GC metastasi resta ancora da determinare.
Sregolazione di microRNA svolgono un ruolo molto importante nella tumorigenesi. Il ruolo dei microRNA nella tumorigenesi gastrica cancro è stata ben documentata. Qui, ci concentriamo su miR-206, che, insieme con i suoi paraloghi strettamente correlate miR-1, 133a e miR-133b, gioca un ruolo molto importante nel differenziamento muscolare. Questi quattro microRNA sono altamente conservati in sequenza e l'organizzazione genomica, e sono chiamati myomiRs perché sono stati trovati ad essere espresso ad alti livelli nei muscoli [13]. MiR-1-1 /miR-133a-2, miR-1-2 /miR-133a-1 e miR-206 /miR-133b cluster forma in tre diverse regioni cromosomiche nel genoma umano 20q13.33, 18q11.2 e 6p12.2 rispettivamente. Tuttavia, questi miRNA possono fungere da soppressori tumorali in diversi tumori umani [14]; per esempio, miR-1 e miR-133a sono risultati essere spesso down-regolato nei tumori della vescica, e sopprimere la crescita tumorale di mira TAGLN2 [15]. MiR-1 e miR-206 hanno dimostrato di possedere simili ruoli tumore-soppressore in rabdomiosarcoma attraverso il blocco c-Met espressione [16]. Mir-206 è stato segnalato anche per agire come un tumore-soppressore del cancro al seno [17], e il cancro ai polmoni [18]. Riportiamo qui che miR-206 espressione è inversamente associato con metastasi linfatica, invasione locale, e la messa in scena TNM malignità del GC, e la forza di espressione di miR-206 sopprime la crescita delle cellule GC, tumorigenesi, e le metastasi.
Materiali e metodi
I campioni di tessuto
resezione chirurgica cancro gastrico umano e dei tessuti non tumorali adiacenti sono stati ottenuti da 35 pazienti ricoverati nel reparto di chirurgia gastrointestinale, l'Ospedale Affiliato di Nanjing Medical University (Ospedale Changzhou Popolo secondo). Il progetto è stato approvato dal Comitato Etico di Ricerca della Nanjing Medical University, e un consenso scritto è stato ottenuto da ciascun paziente arruolato in questo studio. Tutti i campioni di tessuto sono stati trattati per la conservazione in azoto liquido e H &. E colorazione per l'analisi patologica
linee cellulari e colture cellulari
linee di cellule di cancro gastrico umano SGC-7901, BGC-823, AGS, cellula gastrica non maligno linea GES-1, e le cellule HEK293T sono stati acquistati dal cellulare Resource center, Shanghai Istituto di Biochimica e biologia cellulare, l'Accademia Cinese delle Scienze. Queste cellule sono state mantenute in un incubatore di umidità a 37 ° C, 5% CO 2 e SGC-7901, BGC-823, e GES-1 le cellule sono state coltivate in terreno RPMI1640, HEK293T cellule in DMEM, e le cellule AGS a F12K media rispettivamente. Tutti i mezzi di coltura sono stati integrati con siero fetale bovino al 10% e antibiotici. Estrazione
RNA e quantitativa real-time PCR
RNA totale da tessuti gastrici o linee cellulari sono stati estratti utilizzando Trizol reagente (Takara) secondo le istruzioni del produttore. cDNA è stato sintetizzato con il kit di reagenti PrimeScript RT (Takara). Quantitative RT-PCR è stata effettuata con un kit SYBR Premix Ex Taq (Takara) in un sistema PCR 7500 tempo reale (ABI) e analizzati con il pacchetto software di analisi SDS (versione 2.0.1, Applied Biosystems). primer PCR sono stati ottenuti da Invitrogen, e la reazione era 95 ° C, 10 min, seguiti da 40 cicli di 95 ° C 15 secondi e 60 ° C, 1 min. Il U6 snRNA è stato utilizzato come controllo interno. I risultati sono stati presentati come cambiamenti volte, calcolato utilizzando il 2 -. △ metodo CT, e un rapporto di espressione nei tumori rispetto ai tessuti normali meno di 1,0 è stato considerato a partire
vettore costruisce
Pri -miR-206 è stato amplificato dal normale DNA genomico umano mediante PCR utilizzando primer: 206-Per 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'e 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. Il frammento di PCR è stato inserito nel vettore MSCV-P2GM per generare P2GM-miR-206. Il P2GM vettore vuoto è stato utilizzato come controllo.
Cellulare trasfezione
plasmidi trasfezione di cellule SGC-7901 sono state effettuate utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), e sono stati selezionati cloni stabili che trasportano P2GM-miR-206 o il vettore vuoto resistenza puromicina (10 mcg /ml). Mir-206 e imita controllo negativo sono stati ottenuti da Ribobio (Guangzhou, Cina) e trasfezione di imita nelle cellule SGC-7901 è stato fatto usando Oligofectamine (Invitrogen). In breve, le cellule SGC-7901 placcato out 1 giorno prima sono state trasfettate con 100 nm di miR-206 o di controllo imita al raggiungimento del 50% di confluenza. Dopo 48 ore, le cellule sono state trattate per ulteriori analisi.
Proliferazione cellulare saggio
saggio MTT è stato utilizzato per stimare il tasso di proliferazione delle cellule SGC-7901. In breve, le cellule SGC-7901 sono stati trypsinzed 2 giorni dopo la transfezione e reseeded a 2,5 × 10 3 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-il) -2, 5-difenil-tetrazoliumbromide) è stato aggiunto al mezzo di coltura ad intervalli specificati per ore xx, e l'assorbanza a 490 nm è stata misurata con uno spettrofotometro. Ogni test è stato eseguito in triplicato e ripetuta tre volte in modo indipendente
. Saggio di formazione di colonie
cellule stabili SCG-7901 trasportano miR-206 o il controllo vuoto sono stati tripsinizzate e ripiastrate a 1 × 10 3 per bene in 6 piastre -Bene. Dopo 14 giorni di coltura in RPMI1640 supplementato con 10% FBS, le colonie sono state fissate con 3,7% di metanolo e colorate con cristalvioletto 0,1%. sono stati segnati colonie contenenti almeno 50 cellule. Ogni test è stato eseguito in triplicato.
Citometria a flusso
SGC-7901 cellule trasfettate con miR-206 di controllo mimica o negativo sono stati tripsinizzati e risospese in 1 × tampone di legame a 1 × 10 6 cellule /ml. 100 ml di questa sospensione cellulare è stata incubata con 5 l di FITC-annessina V e 5 microlitri propridium ioduro (PI) per 15 minuti al buio. La reazione è stata bloccata con l'aggiunta di 400 microlitri 1 × tampone di legame e analizzata (FACSCalibur utilizzando il software CellQuest (Becton Dickinson). FITC-annessina cellule V-positive e PI-negativi sono stati considerati come apoptosi e gli esperimenti sono stati effettuati in triplicato.
saggi di migrazione e l'invasione delle ferite
migrazione delle cellule di guarigione è stata valutata misurando il movimento delle cellule in una zona acellulare creato da raschiando il prato cellule confluenti con un microlitri punta della pipetta 200. la chiusura della ferita è stato fotografato 48 ore più tardi al microscopio. per transwell saggi di migrazione, 5 × 10 4 cellule sono stati aggiunti nella camera superiore dell'inserto (BD Scienza, Sparks, MD, USA), mentre 1 × 10 5 cellule sono state utilizzate per matrigel saggi di invasione. in questi esperimenti, le cellule sono state tripsinizzate e risospese in terreno privo di siero, prima di essere seminato alla camera superiore. il mezzo completo di coltura contenente 10% FBS è stato aggiunto nella camera inferiore. Le cellule sono state incubate in un incubatore umidificato a 37 ° C per 24 h. Le cellule sulla membrana sono state fissate, colorate, e contate. Ogni esperimento è stato condotto in triplicato
. Modello di tumore dello xenotrapianto
giovani topi nudi atimici femmina (6 settimane) sono stati acquistati dal modello animale Research Center di Nanjing University. Circa 1,5 × 10 6 celle SGC-7901 stabili che trasportano P2GM-miR-206 o il vettore vuoto sono state iniettate per via sottocutanea nei fianchi inferiori di 5 topi nudi. volumi tumorali sono stati misurati ogni 3 giorni dal sesto dopo l'iniezione giorno in poi per 24 giorni prima che gli animali sono stati sacrificati. Il volume finale ed il peso sono stati misurati dopo i tumori sono stati sezionati. topi nudi sono stati manipolati e curati secondo le direttive NIH cura degli animali e del Comitato Usa nell'esperimento Animal Center della Nanjing Medical University (Nanjing, Jiangsu, provincia, Repubblica Popolare Cinese).
Analisi statistica
analisi statistica è stata effettuata utilizzando il pacchetto SPSS software (SPSS standard versione 16.0, SPSS Inc). I dati sono stati mostrati come media ± SEM. I campioni appaiati t
-test è stato utilizzato per l'analisi del differenziale di miR-206 espressione tra il tumore e tessuti normali. Per in vitro e in vivo, T per campioni indipendenti
-test è stato utilizzato per valutare l'importanza di differenza tra i gruppi di trattamento e di controllo. valore <P; 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
down-regulation di miR-206 correla con tumorigenesi umana cancro gastrico, l'invasione e metastasi
In una vasta indagine del genoma per l'espressione di microRNA, abbiamo precedentemente identificato diversi membri della la famiglia myomiR, vale a dire miR-1 /133a e miR-133B /206, i cui livelli sono stati ridotti in un cancro neuroectodermic (risultati non pubblicati). Questi microRNA erano noti soprattutto per funzionare nel differenziamento miogenico e, in misura minore, la tumorigenesi dei tumori pediatrici. Per esplorare se questi myomiRs potrebbe anche avere un ruolo nella tumorigensis dei tumori comuni nel adulti, abbiamo esaminato i loro livelli di espressione da tempo reale stem-loop RT PCR quantificazione in una coorte di tumori gastrici appena asportati e la loro corrispondenza tessuti normali, e trovato che il rapporto mediano di miR-206 rispetto al U6 snRNA dei 35 tumori era 4 volte inferiore a quello dei tessuti normali (Figura 1A). confronto a coppie ha indicato che oltre l'85% dei tumori ha mostrato una riduzione maggiore di 2 volte di espressione di miR-206 rispetto ai loro controlli di corrispondenza, con solo due coppie che mostrano aumento (Figura 1B). L'espressione di miR-206 è stata anche diminuita in un certo numero di linee di cellule di cancro gastrico umano, tra cui SGC-7901, BGC-823, MGC-803, e le cellule AGS, rispetto a quello in GES-1 normali cellule gastriche (Figura 1C). record clinico-patologici di questi tumori hanno mostrato che la riduzione di espressione di miR-206 era significativamente associato con metastasi linfatica, invasione locale, e la TNM malignità messa in scena, ma non con l'età, il sesso, dimensioni del tumore o la posizione (Tabella 1). Questi dati implicano che miR-206 può normalmente esercitare un controllo inibitorio sulla gastrica tumorigenesi, invasione e metastasi. Figura 1 riduzione dei livelli di espressione di miR-206 nei tessuti di cancro gastrico e linee cellulari. (A) Distribuzione di espressione di miR-206 in una coorte di 35 tessuti GC e non tumorali umane da qRT-PCR. L'RNA U6 endogena è stato utilizzato come controllo interno. (B) confronto a coppie di espressione di miR-206 tra il GC e tessuti non tumorali corrispondenti mostrando miR-206 espressione è stata ridotta a 86% (30/35) delle coppie di campioni. (C) l'espressione relativa di miR-206 in quattro linee di cellule GC e una normale linea di cellule gastriche (GES-1).
Tabella 1 caratteristiche clinico-patologiche di miR-206
Categorie
NO. dei pazienti
livelli relativi di miR-206 (media ± SEM)
P-valore
genere
Maschio
21
0.49 ± 0.07
0,32
femminile
14
0.40 ± 0.06
Età (anni)
≥60
19
0.45 ± 0.05
0.93
< 60
16
0,46 ± 0,09
Diametro (cm)
≥5
13
0.46 ± 0.09
0.90
< 5
22
0,45 ± 0.05
Località
Medio e prossimale terzo
23
0.47 ± 0.06
0.65
distale terzo
12
0,42 ± 0,07
grado di differenziazione
bene e moderatamente
12
0.48 ± 0.07
0,70
scarsamente
23
0.44 ± 0.07
invasione locale
T1 + T2 10
0.65 ± 0,07
0,01
T3 + T4
25
0.37 ± 0.05
metastasi linfonodali
NO
14
0.57 ± 0.06
0,04
SI
21
0.38 ± 0.07
stadio TNM
I + II
12
0.60 ± 0.07
0.02
III + IV
23
0,38 ± è stato anche trovato 0,06
espressione di miR-133a essere down-regolato nei tumori dai criteri di cui sopra (file aggiuntivo 1: Figura S1), ma espressione di miR-1, i cui geni sono raggruppati con quelli codifica miR-133a [14], non era (sui file 2: Figura S2). Dal momento che miR-206 è codificato da un gene unico, è stato scelto per ulteriori analisi.
MiR-206 inibisce la crescita delle cellule tumorali gastriche
Per determinare se miR-206 ha la propensione a reprimere gastrica tumorigenesi cancro, abbiamo introdotto un sintetici a doppia elica miR-206 imita, 206mi, di modificare il livello del totale miR-206 in cellule di cancro gastrico SGC-7901, che esprimono un basso livello di miR-206 rispetto a quella di GSE-1 normali cellule di controllo (Figura 1C) , e monitorato il tasso di crescita cellulare utilizzando il colorante tetrazolio, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT). Stem-loop PCR ha confermato l'elevato livello di miR-206 nelle cellule trasfettate SGC-7901 (Figura 2A), e risultati del test MTT indicato che il tasso di crescita di queste cellule è stato ridotto sensibilmente rispetto a quella delle cellule riceventi non imita specifiche di controllo, miR-CTRL, per un periodo di 5 giorni (Figura 2B). Abbiamo inoltre generato un plasmide pre-miR-206 che esprimono nel vettore P2GM, e-cell-ordinamento fluorescenza-attivato (FAC) L'analisi ha dimostrato il G1-fase di prolungata e la accorciato fase S in P2GM-206 (P206) trasfettate rispetto al il vettore P2GM trasfettate SGC-7901 cellule (Figura 2C), corroborando così il risultato da quanto sopra 206mi esperimento mimica. Si aumenta artificialmente il livello totale di miR-206 con 206 mi ha portato anche a un significativo aumento di apoptosi nelle 48 ore nelle cellule SGC-7901 negli imita controllo cellule trasfettate come determinato da analisi di citometria di flusso di PI e annessina V doppio assorbimento (Figura 2D ed e). Questi dati indicano che miR-206 è un potente regolatore anti-proliferativa di cellule di cancro gastrico in coltura. Figura 2 forzata espressione di miR-206 sopprime la proliferazione delle cellule di cancro gastrico SGC-7901. (A) i livelli totali di miR-206 in cellule SGC-7901 trasfettate con il miR-ctrl o imita sintetiche di miR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) saggi MTT per SGC-7901 cellule trasfettate con miR-206 imita ad una concentrazione finale di 100 nm. A partire da 24 ore dopo la trasfezione, i test è stato letto ogni 24 ore per 5 giorni consecutivi. I risultati sono espressi come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. (*** P < 0,0001). (C) Un istogramma che rappresenta la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule SGC-7901 trasfettate con P2GM-miR-206 o P2GM-ctrl (100 nm). I risultati rappresentano la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0,05). (D) Cellule colorazione positiva per annessina V-FITC e negativo per PI a 48 ore dopo la trasfezione sono stati considerati hanno subito apoptosi. (E) Tasso medio apoptotico di tre esperimenti indipendenti ± SEM sono riportati (*** P < 0,0001).
MiR-206 inibisce la crescita delle cellule del cancro gastrico e tumore xenotrapianto formazione di ancoraggio-dipendente
Per esaminare il lungo termine impatto del miR-206 sulla crescita cellulare e la formazione di colonie, abbiamo generato una linea stabile di cellule SGC-7901, P2GM-miR-206, che esprime miR-206 da un vettore costitutivamente attivo, MSCV-P2GM, e una linea di vettore vuoto Trasportare cellule, P2GM-miRctrl. In primo luogo, abbiamo esaminato il livello di espressione di miR-206 in queste due linee cellulari stabili e abbiamo scoperto che miR-206 è stato notevolmente elevato in P2GM-miR-206 linea cellulare stabile (figura 3A). Poi abbiamo analizzato l'effetto di miR-206 sulla crescita ancoraggio-dipendente da parte delle cellule scarsamente seeding trypsinized direttamente sulla capsula di Petri e visualizzare le colonie di cellule di colorazione cristallo viola successivi 14 giorni di coltura. I risultati hanno mostrato che le cellule stabili controllo vettori che trasportano formate significativamente più colonie di cellule miR-206 che esprimono (Figura 3B e C). Abbiamo iniettato ulteriormente queste cellule stabili per via sottocutanea in due parti posteriori inferiori bilaterali di topi nudi, e monitorato la crescita del tumore al giorno. Ventiquattro giorni dopo l'iniezione, i topi sono stati sacrificati ed i tumori sono stati asportati e pesati (Figura 3D ed E). I risultati hanno mostrato che i volumi medi di tumori miR-206-sovraesprimono cresciuti ad un ritmo molto più lento rispetto ai tumori di controllo e il peso finale medio era significativamente inferiore a quella dei controlli (Figura 3F e G). Figura 3 mir-206 sopprime la crescita delle cellule GC di ancoraggio-dipendente e la formazione del tumore xenotrapianto. (A) il livello di espressione di miR-206 in P2GM-miR-206 linea cellulare stabile e cellule stabili di controllo vettori che trasportano (*** P < 0,0001). (B) Un migliaio di stabili cellule SGC-7901 di miR-206 e controllo negativo sono stati placcato su piastre da 6 pozzetti e un saggio di formazione di colonie effettuata. Risultati rappresentativi di formazione colonia di P2GM-miR-controllo, P2GM-miR-206. (C) Il numero di colonie è stato contato il 14 ° giorno dopo la semina. Stabile cellule SGC-7901 di miR-206 è cresciuto ad una densità inferiore rispetto al controllo negativo. I risultati rappresentano la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (** P < 0.01). (D) le cellule SGC-7901 con l'espressione stabile di miR-206 o non sono stati inoculati per via sottocutanea in entrambi i fianchi di topi nudi (n = 5 per gruppo). sono mostrati fotografie rappresentativi di topi nudi 24 giorni dopo l'inoculazione. (E) I topi sono stati uccisi ed i tumori sono stati ponderati 24 giorni dopo l'inoculazione, i xenotrapianti con miR-206 sovraespressione erano significativamente più piccole delle xenotrapianti di controllo. (F) mostra curva di crescita tumorale (* P < 0.05 e ** P < 0.01). (G) Tumori da ciascun gruppo sono stati pesati immediatamente dopo la rimozione. Il peso medio del tumore è indicato come media ± SEM (* P < 0,05).
MiR-206 inibisce gastrica invasione delle cellule del cancro e la migrazione
ridotta espressione di miR-206 nei tumori localmente invasivi e metastatici (Tabella 1) suggerisce che questo microRNA possono disciplinare processo migratorio delle cellule. Per determinare se questo è davvero il caso, abbiamo effettuato guarigione delle ferite e transwell saggi di migrazione con i miR-206 che esprimono le cellule SGC-7901 stabili. I risultati hanno dimostrato che la sovraespressione ectopica di miR-206 ha causato una soppressione della migrazione cellulare in cellule SGC-7901 come evidenti nel saggio di guarigione (Figura 4A e B) e il saggio migrazione cellulare transwell (Figura 4C e D). sovraespressione ectopica di miR-206 inoltre inibito l'invasione delle cellule SGC-7901, come dimostrato dal test di invasione Matrigel (Figura 4E e F). Quindi, miR-206 visualizza una proprietà soppressiva nei test di migrazione delle cellule tumorali e l'invasione in vitro. Figura 4 mir-206 sopprime la migrazione delle cellule GC e l'invasione in vitro. (A) Il test di guarigione ha mostrato diverse motilità delle cellule di miR-controllo, miR-206 cellule. L'espressione ectopica di miR-206, ovviamente, ha inibito la migrazione delle cellule SGC-7901. (B) mostra i risultati statistici. I dati rappresentano i mezzi ± SEM di tre esperimenti indipendenti. (** P < 0,01). Over-espressione di miR-206 abilità significativo impedimento della migrazione cellulare (C) e l'invasione (E) in miR-206-cellule che esprimono SGC-7901 stabili rispetto al controllo negativo. (D, F) mostra i risultati statistici rispettivamente. I dati rappresentano i mezzi ± SEM di tre esperimenti indipendenti. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MiR-206 inibisce le metastasi epatiche di GC in vivo
Per studiare l'effetto di miR-206 in metastasi in vivo, abbiamo effettuato coda iniezione -vein di P2GM-miR-206 e il solo vettore cellule P2GM con topi nudi, 42 giorni dopo l'iniezione, abbiamo raccolto e fotografato i fegati (Figura 5A, pannelli superiori). H & E colorazione delle sezioni di tessuto indicati a 7 volte minore numero di noduli tumorali metastatiche per unità di superficie nel fegato iniettati con P2GM-miR-206 cellule rispetto a quelli iniettati con cellule di controllo P2GM (Figura 5A, pannelli inferiori e B). Inoltre, le dimensioni dei noduli tumorali nei fegati cellule iniettato P2GM-miR-206 sono molto più piccoli di quelli del gruppo di controllo (Figura 5A). Questo risultato sostiene fortemente che miR-206 normalmente può avere un ruolo oncosoppressore prevenire le metastasi di cellule di cancro gastrico. Figura 5 mir-206 inibisce la metastasi del fegato di GC in vivo. (A) le immagini macroscopiche rappresentativi di fegato di topo, 42 giorni dopo l'inoculazione, (La parte superiore). fotografie rappresentativi di H & E macchiati metastasi epatiche spontanee. Ingrandimento: 10 × (più basso). I risultati mostrano che noduli tumorali nel gruppo P2GM-miR-206 erano più piccole e meno rispetto al gruppo di controllo. (B) Numero di fegato metastatico loci sono state contate e confrontate tra topi portatori di SGC-7901 cellule di controllo vettoriale e cellule SGC-7901 che esprimono miR-206. I dati rappresentano i mezzi ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) livello di mRNA dei bersagli putativi di miR-206 tra SGC-7901-miR-P2GM e SGC-7901-miR-206 cellule. Il livello di mRNA dei bersagli putativi di miR-206 tra GES-1 e linee cellulari SGC-7901 (D).
Per determinare il meccanismo attraverso il quale miR-206 esercita il suo ruolo di anti-metastatico, abbiamo cercato possibili retrovisori 206 geni bersaglio utilizzando una combinazione di strumenti di acquisizione dei bersagli microRNA online e riferimenti incrociati i candidati risultanti a coloro che sono stati segnalati per svolgere un ruolo nella metastasi. In un pool di 20 di tali geni, abbiamo trovato 9 di loro (sui file 3: Tabella S1), vale a dire STC2, HDAC4, Klf4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, e K-ras, sono stati drasticamente down-regolato da miR-206 nelle cellule stabili P2GM-miR-206 rispetto ai loro rispettivi livelli nelle cellule stabili P2GM vettoriali (Figura 5C). Alcuni di questi geni bersaglio miR-206 erano marcatamente up-regolata nelle cellule tumorali GC SCG-7901 dei genitori rispetto ai normali GES-1 gastrici cellule (Figura 5D), suggerendo un evento causale probabile. Così, miR-206 probabilmente inibisce la metastasi delle cellule tumorali GC attraverso una rete di geni regolatori.
Discussione
Sebbene disregolazione dei miRNA è stato segnalato in vari tipi di tumori umani [19], l'espressione aberrante e potenziale ruolo dei miRNA nel tumori gastrici sono stati poco studiato. Qui, dimostriamo che miR-206 è spesso downregulated nei tumori gastrici umani e linee cellulari di cancro. Alla luce della espressione miR-206 ridotto riportata in molti tipi di tumori, i nostri risultati suggeriscono che la riduzione espressione miR-206 è probabilmente un evento prerequisito nella tumorigenesi. Questo requisito è stato reso ancora più rilevante quando abbiamo scoperto che bassi livelli di miR-206 sono risultati significativamente associati con metastasi linfatica, invasione locale, e lo stadio TNM. Questa nozione è stata confermata dai risultati di espressione ectopica di miR-206 in linea di cellule di cancro GC SCG-7901, che ha dimostrato che miR-206 represso la proliferazione delle cellule GC, formazione di colonie, l'invasione e la migrazione. Infine, la capacità di miR-206 per sopprimere metastasi delle cellule SCG-7901 nel fegato ha fornito una spiegazione chiara per la correlazione tra bassi livelli di miR-206 e tumori gastrici invasivi e metastatici. Recentemente STC2 è stato identificato come un marker predittivo per metastasi linfonodali nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago [20]. L'espressione di TrkB e BDNF è associata a prognosi infausta in pazienti con NSCLC [21]. Diversi studi hanno riportato che l'espressione IGF1R è elevata nel carcinoma della prostata metastatico e la progressione di resistenza ormonale [22, 23]. espressione BCL2 nel carcinoma della prostata primario è un marcatore per prognosi infausta, con un aumento del rischio di recidiva [24]. Quello che è detto sopra suggerendo un ruolo oncogeno comune nel cancro umano. Inoltre abbiamo identificato STC2, HDAC4, Klf4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF e K-ras come obiettivi funzionali putativi di miR-206, come parte di loro sono stati già parlato in precedenza. Nel loro insieme, i nostri risultati suggeriscono un ruolo soppressore del tumore del miR-206 nel carcinoma gastrico umano
Prove di miR-206 come soppressore della crescita tumorale è stata riportata in diversi tumori:. MiR-206 è stato trovato ad essere downregulated in ERalpha -positive tessuti cancro al seno umano e l'introduzione di miR-206 in cellule MCF-7 di cancro al seno estrogeno-dipendenti inibisce la crescita delle cellule in una dose e tempo-dipendente modo [25]. Inoltre, miR-206 potrebbe promuovere myogenic differenziazione e blocco della crescita tumorale nei topi xenotrapiantati dal downregulating il prodotto del proto-oncogene MET: Met tirosin-chinasi del recettore [26]. Yan ha anche scoperto che l'inibizione della funzione di miR-206 potrebbe contribuire alla proliferazione delle cellule aberranti e la migrazione, che porta allo sviluppo rabdomiosarcoma dalla soppressione del C-Met [16]. Nel frattempo, miR-206 può essere utilizzato per inibire la migrazione delle cellule HeLa e mettere a fuoco la formazione inibendo sia proteine ​​Notch3 e mRNA [27]. Inoltre, miR-206 è stato downregulated nel cancro del polmone alta metastasi rispetto ai tumori metastasi bassi e tessuti polmonari normali, sovraespressione di miR-206 migrazione inibito e l'invasione delle cellule tumorali del polmone [18]. Mir-206 espressione diminuita in recettore estrogeno-α (ERα) -positivo endometriale endometrioidi adenocarcinoma (CEE) e la sua sovraespressione inibito la proliferazione ERα-dipendente, invasività ridotta e indotta arresto del ciclo cellulare di linee cellulari CEE ERα-positivi [28]. Tutti questi risultati hanno indicato che miR-206 può giocare un ruolo soppressore del tumore in vari tipi di cancro.
Metastasi contribuisce alla maggior parte dei decessi per cancro correlati. GC classifica come la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo, perché il suo alto tasso di metastasi, tra cui linfonodi, il peritoneo, fegato ecc Soprattutto il tasso di sopravvivenza a 5 anni del tumore gastrico con metastasi epatiche non supera il 10% e la mediana sopravvivenza senza alcun trattamento è di circa 3 a 5 mesi [29]. geni multipli hanno giocato un ruolo fondamentale nel GC metastasi: come la sovraespressione di insulino-simile del fattore di crescita recettore-I (IGF-IR) e l'attivazione delle sue vie di segnalazione sia giocano un ruolo critico nello sviluppo e nella progressione del cancro gastrico. Bussare-down dell'espressione Spl da piccoli RNA inibitori comporta una diminuita IGFIR espressione e di crescita attenuata e metastasi delle cellule di cancro gastrico [30], in caso contrario, IGF1R può essere inibiti da miR-7 e la migrazione delle cellule GC significativamente ridotto e l'invasione [31]. Adachi ha trovato che il blocco di IGF-IR è coinvolto nella soppressione della invasione delle cellule del cancro attraverso la down-regulation di matrilysin [32]. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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