MicroRNA-206 zatira rast želodčni rak celic in metastaz

MicroRNA-206 zatira rast želodčni rak celic in metastaz
Abstract
raka želodca, je eden od glavnih vzrokov po vsem svetu rak smrt in nosi visoko stopnjo metastatskega tveganja. Poleg drugih, ki kodirajo proteine ​​onkogenov in zaviralnih genov, microRNAs igrajo pomembno vlogo pri raka želodca tumorogenega napredovanje. Tukaj smo pokazali, da je miR-206, izraženo na bistveno nižjih ravneh kohorti želodčnih tumorjev v primerjavi z njihovimi ujemajočih normalnih tkivih in v številnih želodčnega raka celičnih linij. Dol-ureditev miR-206 je še posebej pomembno v tumorjih z limfno metastaz, lokalna invazija, in napredne TNM uprizoritve. Ugotovili smo, da je prisiljen izraz miR-206 zatreti proliferacije, kolonije oblikovanje in ksenotransplantskih tumorigeneze v SCG-7901 celic, linijo želodčnih rakavih celic. Prisilno izraz miR-206 zatreti tudi migracije SCG-7901 celic in invazijo, kot tudi metastaze v celični kulturi ali rep vene vbrizgali modelov miši, oz. Anti-metastatskega učinek miR-206 je lahko posredovana z usmerjanjem metastaze regulatorne gene STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL 2, BDNF in K-RAS, ki so bile močno ga stabilno izražanje eksogenega miR navzdol urejeno -206 v SCG-7901 celic. Skupaj, naši rezultati kažejo, da je miR-206 tumor supresor raka želodca, ki deluje na korake, ki urejajo metastaze.
Ključne besede
rak želodca miR-206 Metastasis zaviralnih Uvod
Rak želodca (GC) uvršča četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu [1]. Prognoza za bolnike z napredovalim rakom želodca je slaba, kljub nedavnim izboljšavam gastriectomy, kemoterapija in radioterapija [2]. Ker GC je poligensko bolezen, ki izhaja kot posledica več genskih dysregulations, pojasnitev regulativnega omrežja, ki ureja GC tumorigeneze je nujno za razvoj novih ciljno terapij.
Tumorigeneze v želodcu, je večstopenjski proces, ki vključuje genetske in epigenetski spremembe beljakovin -coding kot nekodiran proto-onkogenov in tumor-supresorski geni. Interakcije med gostiteljem, okolja in bakterijskih dejavniki vplivajo tudi napredek bolezni. Helicobacter pylori
(HP) okužba je uveljavil kot pomemben dejavnik tveganja za GC; dva histološke podvrste raka želodca, črevesju in razpršenih podtipov, sta povezana z okužbo s HP, kar prispeva k več kot 80% primerov [3], zlasti pri raku antralnih /telesne želodca [4]. Mehanično, je bila okužba s HP ugotovljeno, da povzroča dvakratno povečanje sklada in EGFR v želodcu antralnih biopsije tkiva, vendar izkoreninjenje zmanjšuje raven obeh dejavnikov tistim kontrol [5]. okužba HP pri bolnikih s kroničnim gastritisom je tudi bistveno povezana z zmanjšanjem števila E-kadherina zaradi povečane promotorja metilacije [6], medtem ko je za izkoreninjenje HP občutno zmanjšala raven MMP-9, metalo pozitivno povezana s tumorsko invazijo in metastaz [ ,,,0],7], v antruma in corpus sluznice [8].
poleg infekcije HP obstaja množica razlogov, ki vodijo do odklonskega genske ekspresije raka želodca, in mehanizem želodca metastaz raka je zelo zapleten, ker dobro . Ras-MAPK odvisna signalizacijo, ki sčasoma vodi do povečane proliferacije raka želodca in ga aberacije aktivacije K-ras v glavnem posledica je pogosto povezana z rakom na želodcu intestinalnega tipa [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), izločeni glikoprotein s pomembnimi funkcijami v kalcija in fosfata homeostaze, so poročali, da se izrazijo na visoki ravni rakavih želodca tkiva, bezgavko metastaze, ter vensko invazijo [10]. Stopnja preživetja 5 let je bila precej nižja pri bolnikih s STC2 izražanja v primerjavi z bolniki brez STC2 izražanja [11]. BDNF (-Brain izhaja neutrophic faktor) izraz so poročali, da pokazati bistveno povečano izražanje v želodcu tkivu raka v primerjavi s sosednjo normalno sluznico, in visoke ravni BDNF na invazivnega sprednji strani so povezana z invazijo plovila, bezgavk metastaze, peritonealno razširjanje in slaba prognoza pri bolnikih želodca z rakom [12]. Kljub napredku pri določanju zgornje regulatorne gene, natančen osnovni mehanizem povzroča GC metastaze treba še določiti.
Dysregulations za microRNAs igrajo zelo pomembno vlogo pri tumorigeneze. Vloga microRNAs želodčnega tumorigeneze raka je dobro dokumentirano. Tu smo se osredotočili na miR-206, ki je skupaj s svojimi tesno povezanih paralogs miR-1, 133a, in miR-133b, igra zelo pomembno vlogo pri diferenciaciji mišic. Te štiri microRNAs so zelo ohranjeni v zaporedju in genomske organizacijo, in se imenujejo myomiRs, ker je bilo ugotovljeno, da se izrazi na visoki ravni v mišicah [13]. MIR-1-1 /miR-133a-2, miR-1-2 /miR-133a-1, in miR-206 /miR-133b oblika grozdi v treh različnih kromosomskih regijah v človeškem genomu 20q13.33, 18q11.2 in 6p12.2 oz. Vendar pa lahko te miRNAs delujejo kot tumorske dušilne člene v raznih človeških rakih [14]; na primer, so miR-1 in miR-133a ugotovil, da je pogosto navzdol ureja mehurja raka in zavirajo rast tumorja z usmerjanjem TAGLN2 [15]. MIR-1 in miR-206 so pokazale, da imajo podobne tumor-zaviranje vloge v rabdomiosarcomom z blokiranjem c-Met izraz [16]. MIR-206 so poročali tudi deluje kot tumorja-supresorski raka dojke [17], in pljučnega raka [18]. Poročamo tukaj, da miR-206 izraz obratno povezana z limfno metastaz, lokalna invazija, in TNM malignimi boleznimi uprizoritev v GC, in prisili izraz miR-206 zavira rast GC celic tumorigeneze, in metastaze.
Materiali in metode
vzorce tkiva
Kirurško odstranjenimi raka človeškega želodca in sosednjih ne-tumorske tkiva so bili pridobljeni od 35 bolnikov, sprejetih na oddelku za operacijo na prebavilih, Bolnišnica odvisnih Nanjing Medical University (Changzhou drugi Ljudska Hospital). Projekt je bil odobren s Odbor za etiko raziskovalnega Nanjing Medical University, in pisno soglasje je bilo pridobljeno iz vsakega bolnika, vključenih v tej študiji. Vse vzorce tkiva so bili obdelani za shranjevanje v tekočem dušiku in H &. E barvanja za patološke analize
Celične linije in celična kultura
človekove želodčne rakave celične linije SGC-7901, BGC-823, AGS, non-maligna želodca celic linijo GES-1, in HEK293T celice so bile kupljene iz celice Resource Center, Shanghai Inštitut za biokemijo in celično biologijo, kitajske akademije znanosti. Te celice smo vzdrževali v inkubatorju vlažnosti pri 37 ° C, 5% CO 2 in GSS-7901, BGC-823 in GES-1 celice smo gojili v RPMI1640 mediju, HEK293T celice v DMEM, in AGS celice v F12K medij, v tem zaporedju. Vsa gojišča smo dopolnili z 10% fetalnega govejega seruma in antibiotiki. Ekstrakcija
RNA in kvantitativni PCR v realnem času
Total RNA iz želodca tkiv ali celičnih linij so bili pridobljeni s pomočjo TRIzola reagenta (Takara) v skladu z navodili proizvajalca. cDNA smo sintetizirali z reagentom kit PrimeScript RT (Takara). Kvantitativne RT-PCR je bila izvedena z SYBR krmil Ex Taq komplet (Takara) na 7500 realnem času PCR sistem (ABI) in analizirali z analizo programskega paketa SDS (različica 2.0.1, Applied Biosystems). PCR primerji so bili pridobljeni iz Invitrogen in reakcija je bila 95 ° C, 10 min, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C 15 sekund in 60 ° C, 1 min. U6 snRNA je bila uporabljena kot notranji nadzor. Rezultati so bili predstavljeni kot kratno spremembo, ki se izračuna z uporabo 2 -. △ metodo CT, in razmerje izražanja v tumorjih v primerjavi s normalnih tkivih manj kot 1,0 zdela tako nizko
Vector konstrukti
gostilne Pri -miR-206 je bila dopolnjena od normalne človeške genomske DNA s PCR z uporabo oligonukleotidnih: 206-Za 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'in 206-Rev 5-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3 ". PCR fragment smo vstavili v MSCV-P2GM vektorja za ustvarjanje P2GM-MIR-206. Prazen P2GM Vektor smo uporabili kot kontrolo.
Cell transfekciji
plazmida transfekcija SGC-7901 celic, so bile opravljene z uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen), in so bili izbrani stabilne klone, ki prevažajo P2GM-MIR-206 ali prazen vektor za puromicin uporom (10 mg /ml). MIR-206 in negativne kontrole posnema so bili pridobljeni iz Ribobio (Guangzhou, Kitajska) in transfekciji posnema v SGC-7901 celic je bilo izvedeno z Oligofectamine (Invitrogen). Na kratko, SGC-7901 celice zasadimo 1 dan prej so transfekciji s 100 nm miR-206 ali nadzor posnema je doseči 50% sotočje. Po 48 urah smo celice pripravljena za nadaljnjo analizo.
Celic proliferacije
MTT testu smo uporabili za oceno proliferativni stopnjo SGC-7901 celic. Na kratko smo SGC-7901 celice trypsinzed 2 dni po transfekciji in reseeded 2,5 x 10 3 celic na dobro v 96-vdolbinami. MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil-tetrazoliumbromide) dodamo mediju kulture v določenih intervalih za xx uri in absorbanco pri 490 nm smo merili s spektrofotometrom. Vsak test je bil izveden v treh izvodih in ponovi trikrat samostojno.
Colony nastanek testa
Stabilni SCG-7901 celic, ki imajo miR-206 ali prazna nadzor tripsiniziramo in replated na 1 × 10 3 po dobro 6 No plošče. Po 14 dneh v kulturi RPMI1640 dopolnjene z 10% FBS, smo kolonije določen z 3,7% metanola in obarvamo z 0,1% kristal vijolično. je bilo doseženih kolonije, ki vsebujejo vsaj 50 celic. Vsak test je bil izveden v treh izvodih.
Pretočno citometrijo
SGC-7901 celic transfekciji z miR-206 posnemajo ali negativno kontrolo tripsiniziramo in ponovno suspendirali v 1 x zavezujoč pufru 1 × 10 6 celic /ml. 100 ul te celične suspenzije smo inkubirali s 5 l FITC-aneksinom V in 5 ul propridium jodida (PI) za 15 minut v temi. Reakcijo smo končali z dodatkom 400 ul 1 x vezave blažilnik in analizirali z (FACSCalibur uporabo programa Cellquest (Becton Dickinson). FITC aneksinom V pozitivni in PI-negativne celice so bile obravnavane kot apoptotske in poskusi so bili izvedeni v treh izvodih.
migracije in invazijo testi
celjenje ran migracijo celic smo ocenili z merjenjem pretoka celic v brezcelicni območje s strganjem trato na zraščene celic s 200 ul pipeto ustvaril. zaprtje rana je bila fotografirana 48 ur kasneje pod mikroskopom. za transwell migracijskih testih, 5 x 10 4 celice smo dodali v zgornjo komoro vložka (BD Science, Sparks, MD, ZDA), medtem ko 1 x 10 5 celicah, so bili uporabljeni za Matrigel invasion teste. pri teh eksperimentih smo celice tripsinizirali in ponovno suspendirali v mediju brez seruma, preden se nasadijo na zgornjo komoro. 10% FBS, smo dodali v spodnji komori Celoten medij kulture vsebuje. Celice inkubiramo v navlaženem inkubatorju pri 37 ° C 24 ur. Celice na membrano, so bile določene, obarvajo, in prešteti. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.
Ksenotransplantskih tumorja modela
Young female gole miši (6 tednov) je bilo kupljeno od modela Research Center živali Nanjing University. Približno 1,5 × 10 6 stabilne SGC-7901 celic, ki opravljajo P2GM-MIR-206 ali prazen vektor smo injicirali subkutano v spodnjih bokov 5 golih miših. Obseg tumor so bile izmerjene na 3 dni od šestega dneva po injiciranju naprej za 24 dni, preden so žrtvovali živali. Končni volumen in teža smo izmerili po razrežemo tumorji. Nude miši manipulira in oskrbujejo v skladu s smernicami NIH varstvo živali in uporaba odbora v eksperimentu Center Živalski Nanjing Medical University (Nanjing, Jiangsu, provinca, PR Kitajska).
Statistična analiza
Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo programski paket SPSS (SPSS Standardna različica 16.0, SPSS Inc). Podatki so prikazani kot povprečje ± SEM. V paru-vzorce, t
-test smo uporabili pri analizi diferencialne miR-206 izražanja med tumorjem in normalnih tkivih. Za in vitro in in vivo poskusih, neodvisni-vzorci t
-test je bil uporabljen za oceno pomembnosti razlik med skupinama zdravljenja in nadzora. P vrednost < 0,05 zdela kot statistično značilne.
Rezultati
Dol-regulacijo miR-206 povezana s prehrano želodčne tumorigeneze raka, invazijo in metastaz
v genomu široko anketo microRNA izražanja, smo že ugotovila več članov myomiR družina, in sicer miR-1 /133a in miR-133b /206, katerih vrednosti v nevroektodermalnih raka (neobjavljeni rezultati) so se zmanjšale. Te microRNAs so bili znani predvsem za delovanje v myogenic diferenciacije in v manjši meri, je tumorigeneze pediatričnih raka. Raziskati, če bi lahko imela vlogo pri tumorigensis skupnih raka pri odraslih tudi ti myomiRs, smo pregledali njihove ravni izražanja, ki v realnem času izvornih loop RT PCR kvantifikacije v kohorti sveže odstranjenimi želodčnih tumorjev in njihovo ujemanje normalnih tkiv in ugotovljeno, da je srednja razmerje miR-206 glede na U6 snRNA od 35 tumorjev 4-krat manjša kot pri normalnih tkiv (slika 1A). Paroma primerjava je pokazala, da več kot 85% tumorjev je pokazala več kot 2-kratno zmanjšanje miR-206 izražanja v primerjavi z ujemajočimi kontrol, s samo dvema paroma, ki kažejo porast (slika 1B). Izraz miR-206 se je zmanjšala tudi v številnih človeških želodčnega raka celičnih linij, vključno SGC-7901, BGC-823, MGC-803 in AGS celice, v primerjavi da ges-1 normalnih želodčnih celic (slika 1C). Clinicopathological evidence teh tumorjev je pokazala, da je bilo zmanjšanje miR-206 izražanja značilno povezana z limfno metastaz, lokalna invazija, in TNM malignimi boleznimi uprizoritvi, vendar ne na starost, spol, velikost tumorja ali lokacijo (tabela 1). Ti podatki kažejo, da lahko miR-206 se običajno izvaja zaviralno nadzor na želodčno tumorigeneze, invazijo, in metastaz. Slika 1 Znižana stopnja miR-206 izražanja v želodcu tkiv rakom in celičnih linij. (A) Porazdelitev miR-206 izražanja v kohorti 35 človeških GC in noncancerous tkiv s QRT-PCR. Endogeni U6 RNA je bila uporabljena kot notranje kontrole. (B) parno primerjavo miR-206 izražanja med GC in ujemajočih se non-rakastih tkiv, ki prikazuje miR-206 izražanje pri 86% (30/35) od parov vzorcev se je zmanjšal. (C) Relativna izraz miR-206 v štirih GC celičnih linijah in normalno želodčne celične linije (ges-1).
Tabela 1 Clinicopathologic značilnosti miR-206
Kategorije
NO. bolnikov
Relativni ravni miR-206 (srednja vrednost ± SEM)
P-vrednost
Spol
Moški
21
0,49 ± 0,07
0,32
Moški
14
0,40 ± 0,06
Starost (leta)
≥60
19
0,45 ± 0,05
0,93
< 60
16
0,46 ± 0,09
Premer (cm)
≥5
13
0,46 ± 0,09
0,90
< 5
22
0,45 ± 0.05
lokacija
Srednja in bližnji tretji
23
0,47 ± 0,06
0,65
Distalno tretji
12
0,42 ± 0,07
Stopnja diferenciacije
dobro in zmerno
12
0,48 ± 0,07
0,70
Slabo
23
0,44 ± 0,07
Lokalni invazije
T1 + T2
10
0,65 ± 0,07
0,01
T3 + T4
25
0,37 ± 0,05
bezgavko metastaze
NO
14
0,57 ± 0,06
0,04
DA
21
0,38 ± 0,07
TNM oder
I + II
12
0,60 ± 0,07
0,02
III + IV
23.
0,38 ± ugotovljeno je bilo 0,06
izražanje pokoj-133a je treba tudi dol-urejeno v tumorjih z zgoraj navedenimi merili (Dodatni datotek 1: Slika S1), ampak izraz miR-1, katerih geni so zbrani s temi kodiranje pokoj-133a [14], ni bilo (Dodatna datoteka 2: Slika S2). Ker je miR-206 kodiran z enkratno gen, je bil izbran za nadaljnjo analizo.
MIR-206 zavira želodčne rast rakavih celic
želite ugotoviti, ali ima miR-206 nagnjenost k zaviranje želodčne tumorigeneze raka, smo uvedli sintetične dvojno nasedlih miR-206 posnema, 206mi, da spremeni raven celotne miR-206 v SGC-7901 z rakom želodca celic, ki izražajo nizko stopnjo miR-206 v primerjavi s tistimi iz GSE 1-normalnih kontrolnih celic (slika 1C) in spremljali stopnjo rasti celic pomočjo tetrazolom barvilo, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolijevega bromida (MTT). Steblo-zanka PCR potrdili povišan nivo miR-206 v transfekciji SGC-7901 celic (slika 2A), ter rezultati MTT testom so pokazali, da je bila rast teh celic zmanjšana bistveno primerjavi s celicami, ki so prejemali ne- posebne kontrolne posnema, mIR-ctrl, več kot 5-dnevnem obdobju (slika 2B). Prav tako smo ustvarili pred miR-206, ki izraža plazmida v P2GM vektorja, in analiza celic sortiranje fluorescenco aktivirano (FACS) je pokazala, da je podaljšala G1-fazo in skrajšano S-fazo P2GM-206 (P206) transfekcirajo v primerjavi s P2GM vektor transfekcije SGC-7901 celic (slika 2c), kar potrjujejo rezultat iz zgornje 206mi posnemajo poskusa. Umetno povečanje skupno raven miR-206 s 206 mi je povzročilo tudi v več nadzornih posnema transfekciji celic znatno povečanje apoptoze v 48 urah v SGC-7901 celic, kot je določena z analizo s pretočno citometrijo PI in aneksin dvojnega vnosa (slika 2D in E). Ti podatki kažejo, da je miR-206 močan antiproliferativno regulator kultiviranih želodca rakavih celic. Slika 2 Prisilna izraz miR-206 zavira proliferacijo SGC-7901 raka želodca celic. (A) skupaj stopnje miR-206 v SGC-7901 celice transficirane z miR-ctrl ali sintetičnih posnema za miR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) MTT teste za SGC-7901 celic, transfektiranih z miR-206 posnema pri končni koncentraciji 100 nM. Od 24 h post-transfekciji so testi brati vsakih 24 ur za 5 zaporednih dni. Rezultati so izraženi kot sredstvo ± SEM od treh neodvisnih eksperimentov. (*** P < 0,0001). (C) Histogram prikazuje porazdelitev celični cikel SGC-7901 celic prehodno transfekciji s P2GM-miR-206 ali P2GM-ctrl (100 nm). Rezultati predstavljajo sredstva ± SEM treh neodvisnih poskusov (* P &0.05). (D) je bilo ugotovljeno, da ima seme apoptozo celice obarvajo pozitiven aneksin V-FITC in negativna PI ob 48 h post-transfekciji. (E) Povprečna apoptotske stopnja treh neodvisnih poskusov ± SEM so prikazani (*** P < 0,0001).
MIR-206 zavira želodčne nastajanje rast rakavih celic in ksenogenskega tumor sidrišča odvisna od
naj preuči dolgoročno vpliv miR-206 na rast celic in tvorbo kolonij, smo ustvarili stabilno linijo SGC-7901 celic, P2GM-MIR-206, ki izraža MIR-206 s konstitutivno aktivne vector, MSCV-P2GM in linijo praznega vektorja -carrying celice, P2GM-miRctrl. Najprej smo pregledali nivo ekspresije miR-206 v teh dveh stabilnih celičnih linij in ugotovili, da je miR-206 občutno povišano P2GM-miR-206 stabilne celične linije (slika 3A). Nato smo analizirali učinek miR-206 na rast pritrditve odvisni tako redko sejanjem tripsinizirali celic neposredno na petrijevki ter vizualizacijo kolonije celic, ki jih kristal vijoličnega obarvanja naslednjih 14 dneh kulture. Rezultati so pokazali, da so kontrolni stabilne celice, vektorskih nosi oblikovani bistveno več kolonije kot miR-206-izražajo celic (slika 3B in C). Nadaljevali smo injicirali teh stabilnih celic subkutano v dveh dvostranskih nižje hrbtih golih miših, in spremljati rast tumorja na dan. Štiriindvajset dni po injekciji so bile te miši žrtvovali in tumorji smo izrezali in stehtali (Slika 3D in E). Rezultati so pokazali, da so se povprečne količine miR-206-Tumorji s prekomerno ekspresijo rasle počasneje kot kontrolnih tumorjev in povprečne končne teže je bila bistveno manjša od kontrole (Slika 3F in G). Slika 3 MIR-206 zatira rast GC celic sidrišča odvisnega in ksenotransplantskih nastanek tumorjev. (A) Raven izražanja miR-206 v P2GM-miR-206 stabilne celične linije in stabilnih celic kontrolnih vektorskih izvedbo (*** P < 0,0001). (B) en tisoč stabilne SGC-7901 celice miR-206 in negativno kontrolo smo nanesli na 6 vdolbinami in test tvorba kolonija izvedena. Reprezentativni rezultati tvorbe kolonij od P2GM-pokoj-nadzor, P2GM-pokoj-206. (C) Število kolonij smo računali na 14. dan po setve. Stabilni SGC-7901 celice miR-206 naraslo na nižjo gostoto v primerjavi z NC. Rezultati predstavljajo sredstva ± SEM treh neodvisnih poskusov (** P < 0,01). (D) SGC-7901 celice s stabilno ekspresijo miR-206 ali niso bile subkutano inokulirali v obeh bokih golih miših (n = 5 na skupino). Reprezentativni fotografije golih miškah 24 dni po inokulaciji so prikazani. (E) Miši ubili in tumorji so bili tehtani 24 dni po okužbi, so ksenotransplantati z miR-206 prekomerno bistveno manjši od kontrolnih presadkov. (F) prikazuje krivulje rasti tumorja (* P < 0,05 in ** P < 0,01). (G) Tumorji iz vsake skupine smo stehtali takoj po odstranitvi. Povprečna teža tumorja je navedena kot sredstvo ± SEM (* P < 0,05).
MIR-206 zavira želodčni rak celic invazijo in migracije PODJETJA
Zmanjšano izražanje miR-206 v lokalno invazivnih in metastatskih tumorjev (tabela 1) kažejo, da lahko to microRNA uravnavajo celično proces preseljevanja. Da bi ugotovili, ali je to res drži, smo izvedli celjenje-ran in transwell migracijskih preskusih z miR-206-izražajo stabilne SGC-7901 celice. Rezultati so pokazali, da zunajmaternične prekomerno miR-206 povzročil zajezitev migracije celic v SGC-7901 celic, kot se kažejo v-celjenje ran testom (slika 4A in B) in testom migracije transwell celic (slika 4C in D). Zunajmaternična čezmernim miR-206 dodatno zaviral invazija SGC-7901 celic, kot je razvidno iz poskus vdora v Matrigel (slika 4E in F). Zato miR-206 prikazali omejevalno nepremičnine v migracijskih rakava celica in invazijo testih in vitro. Slika 4 MIR-206 zavira migracije GC celic in invazijo in vitro. (A) Test-celjenje ran je pokazala različne motilities celic v pokoj-nadzor, miR-206 celic. Ektopična izraz miR-206 seveda zaviral migracije SGC-7901 celic. (B) prikazuje statistične rezultate. Podatki predstavljajo sredstva ± SEM treh neodvisnih poskusov. (** P < 0,01). Prekomerno izražanje miR-206 bistveno ovirana sposobnosti celične migracije (C) in invazije (E) v pokoj-206-izražanje stabilne SGC-7901 celic v primerjavi z negativno kontrolo. (D, F) prikazuje statistične rezultate oz. Podatki predstavljajo sredstva ± SEM treh neodvisnih poskusov. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MIR-206 zavira jeter, metastaze GC in vivo
Da bi raziskali vpliv miR-206 na metastaze in vivo, smo izvedli rep -vein injekcija P2GM-miR-206 in vektorskih sam P2GM celic z golih miših, 42 dni po injiciranju, smo se nabirajo in fotografirali na jetra (slika 5A, zgornje plošče). H & E obarvanje oddelkov tkiva navedeno 7-krat manjše število metastatskih tumorjev gomoljev na enoto površine v jetrih vbrizgali P2GM-miR-206 celic, kot jih vbrizgali kontrolnih P2GM celic (slika 5A, nižjih plošče in B). Poleg tega so velikosti tumorja gomoljev v jetrih P2GM-miR-206 celic vbrizga veliko manjša od tiste iz kontrolne skupine (slika 5A). Ta rezultat močno trdi, da je običajno miR-206 lahko tumor dušenje vlogo preprečuje metastaze želodčnih rakavih celic. Slika 5 MIR-206 zavira jeter, metastaze GC in vivo. (A) Reprezentativni makroskopske slike jetrih miši, 42 dni po okužbi, (Zgornji). Reprezentativni fotografije H & E obarvajo spontano jetrne metastaze. Povečava: 10 x (Nižja). Rezultati kažejo, da so tumorske vozlički v skupini P2GM-miR-206 manjši in manj v primerjavi s kontrolno skupino. (B) Število jeter metastatskega lokusov so prešteti in primerjali med miši SGC-7901 za nadzor vektor celice in SGC-7901 celice, ki izražajo MIR-206. Podatki predstavljajo sredstva ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) Relativna raven mRNA za domnevno ciljev miR-206 med SGC-7901-pokoj-P2GM in SGC-7901-miR-206 celic. (D) Relativna raven mRNA od domnevnih ciljev miR-206 med GES-1 in SGC-7901 celičnih linijah.
Za določitev mehanizem, s katerim miR-206 doseže svoj anti-metastaz vlogo, smo iskali mogoče miR- 206 ciljni geni, ki uporabljajo kombinacijo spletnih orodij ciljne microRNA pridobivanja in navzkrižno nastale kandidate za tiste, ki so poročali, da igrajo vlogo pri metastaz. V bazenu 20 takih genov, smo ugotovili, 9 izmed njih (Dodatna datoteka 3: Tabela S1), in sicer STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL 2, BDNF in K-ras, so drastično navzdol urejeno s miR-206 v stabilnih celic P2GM-miR-206 v primerjavi z njihovimi stopnjami v stabilnih celic P2GM vektorskih (slika 5C). Nekatere od teh miR-206 ciljnih genov so izrazito reguliran v starševskih SCG-7901 GC tumorskih celic v primerjavi z običajnimi želodca GES-1 celic (Slika 5D), kar kaže na verjetno vzročno dogodek. Tako miR-206 najverjetneje inhibira metastaze GC tumorskih celic prek mreže regulatornih genov.
Razprava
Čeprav je disregulacijo od miRNAs poročali v različnih vrstah človeških raka [19], odklonskega izražanja in potencialni vlogi miRNAs v želodčni rak so understudied. Tukaj smo dokazati, da je miR-206 pogosto navzdol reguliranih v želodčnih raka človeških in raka celičnih linijah. Glede na zmanjšano miR-206 izražanja poročali v več vrst tumorjev, naši rezultati kažejo, da je zmanjšanje miR-206 izraz verjetno predpogoj dogodek v tumorigeneze. Ta zahteva je bila še toliko bolj pomembna, ko smo ugotovili, da so bile nizke ravni miR-206 bistveno povezana z limfno metastaz, lokalna invazija, in fazo TNM. Ta pojem je bila potrjena s izidov zunajmaternične izražanja miR-206 v rak GC celične linije SCG-7901, ki je pokazala, da miR-206 zatrta GC proliferacije celic, tvorbo kolonij, invazijo in migracije. Končno, sposobnost miR-206 za zatiranje metastaze SCG-7901 celic v jetrih, če jasno razlago za povezavo med nizkimi ravnmi miR-206 in invazivne in metastatskih želodčnega raka. Pred kratkim je bil STC2 opredeljena kot napovedni marker za bezgavkah metastaze v požiralniku ploščatoceličnega celic raka [20]. Izražanje TrkB in BDNF je povezana s slabo prognozo pri nedrobnoceličnim rakom pljuč bolnikov [21]. Številne študije so poročali, da je IGF1R izraz povišano metastatskim rakom prostate in napredovanje odpornosti hormona [22, 23]. BCL 2 izraz v primarnim rakom prostate je označevalec za slabo prognozo, s povečanim tveganjem za ponovitev [24]. Kaj je rekel nad predlogom za skupni onkogenega vlogo pri raku ljudi. Nadalje smo ugotovili STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL 2, BDNF in K-ras kot domnevne funkcionalne cilje miR-206, saj so del njih govorili zgoraj. Skupaj, naše ugotovitve kažejo na tumor dušenje vlogo miR-206 v človeškega raka želodca
Dokazila o miR-206, kot je bilo poka rast tumorja, objavljene v več raka. MiR-206 je bil prvič ugotovljeno, da je navzdol reguliranih v ERalpha -positive človeškega raka dojke tkiva in uvedba miR-206 v estrogena odvisnih MCF-7 celic raka dojke zavira rast celic v odmerka in časovno odvisni način [25]. Poleg tega bi lahko miR-206 spodbujati myogenic diferenciacijo in blok tumorja rast ksenotransplantirali miših s downregulating izdelek za MET proto-onkogena: Met tirozin-kinaze receptorja [26]. Yan je tudi ugotovila, da lahko zaviranje miR-206 funkcije prispevajo k odklonskega celične proliferacije in migracije, ki vodi do razvoja rabdomiosarkom s zatiranje C-Met [16]. Medtem lahko miR-206 se uporablja za zaviranje migracije HeLa celic in se osredotočiti tvorbo z zaviranjem tako Notch3 beljakovin in mRNA [27]. Poleg tega je bila miR-206 navzdol reguliranih visoko metastaz pljučnega raka v primerjavi z nizkimi metastazami tumorjev in normalnih pljučnih tkiv, prekomerno miR-206 blokiranem migracije in invazije pljučnega raka celic [18]. MIR-206 izraz zmanjšal v estrogen receptorja-a (ERα) -positive endometrija endometrioid adenokarcinom (EGS) in njegovo prekomerno zaviral ERα-odvisno proliferacijo, motnje invazivnosti in povzročeno aretacijo celična cikla ERα pozitivnih celičnih linijah EGS [28]. Vse te ugotovitve so pokazali, da lahko miR-206 vlogo tumor dušenje v različnih rakavih obolenj.
Metastasis prispeva k večini rakom povezanih smrti. GC uvršča kot drugi vodilni vzrok smrti, povezanih z rakom po celem svetu, ker je njegova visoka stopnja metastaz, vključno bezgavke, peritonej, jeter itd Še posebej 5-letno preživetje tumorja želodca z jetrnimi metastazami ne presega 10%, mediana preživetje brez zdravljenja je približno 3 do 5 mesecev [29]. Več geni igral ključno vlogo pri GC metastaz: kot čezmerni insulinu podobnega rastnega faktorja receptorja-I (IGF-IR) in aktiviranje njenih signalnih poti tako igrajo kritično vlogo pri razvoju in napredovanja raka želodca. Potrkala navzdol od Spl izražanja majhne zaviralnim RNA je privedlo do zmanjšala IGFIR izražanja in oslabljenega rast in metastaze želodčnih rakavih celic [30], drugače lahko IGF1R se navzdol reguliranih s pokoj-7 in bistveno zmanjšano migracije GC celic in invazijo [31]. Adachi je ugotovila, da je blokada IGF-IR vpleten v zatiranje rakavih celic invazije skozi downregulation od matrilizin [32]. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• endotelija lipaza protein je obetaven urinska biomarkerjev za diagnozo želodca cancer
• Pomen vaba receptorja 3 (Dcr3) in zunanjim signalom urejeno kinaze 1/2 (Erk1 /2) v želodčni cancer