MikroRNS-206 elnyomja gyomorrák sejtek növekedését és metastasis

mikroRNS-206 elnyomja gyomorrák sejtek növekedését és metasztázis katalógusa Abstract katalógusa gyomorrák egyik vezető oka a daganatos halálok világszerte, és hordozza a magas aránya a metasztatikus kockázat. Ezen kívül más fehérje-kódoló onkogének és tumorszuppresszor gének, mikroRNS fontos szerepet játszanak a gyomorrák daganatkeltő progresszió. Itt azt mutatják, hogy a miR-206 expresszálódik jelentősen alacsony szinten egy kohorsz gasztrikus tumorok összehasonlítva a megfelelő normális szövetekben, és számos gyomor rákos sejtvonalak. Leszabályozza miR-206 különösen jelentős volt a daganatok nyirok metasztázis, a helyi invázió, és a fejlett TNM stádium. Azt látjuk, hogy kénytelenek kifejezése miR-206 elnyomta a proliferáció, kolónia-képződés, és xenograft tumorogenezisben az SCG-7901 sejtek egy sor gyomor rákos sejteket. Kényszerített expressziójának miR-206 is elnyomta SCG-7901 sejt migrációt és inváziót, valamint metasztázis sejttenyészetben vagy farok-véna injektált egér modellek, ill. Az anti-metasztatikus hatása miR-206 valószínűleg által közvetített célba metasztázis szabályozó gének STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, és a K-ras, amely drasztikusan alulszabályozott stabil expressziója exogén miR -206 SCG-7901 sejtek. Mindezzel együtt, az eredmények azt mutatják, hogy a miR-206 tumor szupresszor gyomorrák ható lépéseket, amelyek szabályozzák az áttétek kialakulása. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa Gyomorrák miR-206 metasztázis szupresszor Tumor Bevezetés katalógusa gyomorrák (GC) rangsorolja a negyedik leggyakoribb rák a második vezető oka a rák okozta halál világszerte [1]. A betegek prognózisa előrehaladott gyomorrák gyenge, annak ellenére, hogy a közelmúltban javulás gastriectomy, kemoterápia, sugárterápia és [2]. Mivel GC poligénes betegség miatt, mint az eredmény több gén dysregulations, megvilágítja a szabályozási hálózat irányító GC tumorogenezisben elengedhetetlen fejlődő új célzott terápiák.
Tumorképzésért a gyomor egy többlépcsős folyamat, amely magában foglalja a genetikai és epigenetikai változások fehérje -coding valamint nem-kódoló proto-onkogének és a tumor-szuppresszor gének. Közötti kölcsönhatások host, környezeti és bakteriális tényezők is befolyásolják a betegség folyamatban. Helicobacter pylori katalógusa (HP) fertőzés jött létre, mint a fő kockázati tényező a GC; a két szövettani altípus a gyomorrák, a vékonybél és a diffúz altípusok, egyaránt társított HP fertőzés, ami hozzájárul a több mint 80% -ában [3], különösen a antrális /test gyomorrák [4]. Elvileg, HP talált fertőzést okoznak duplázódásakor EGF és EGFR a gyomor antrális biopsziás szövetekben, de annak megszüntetése csökkenti a szintjét mindkét tényező azok az ellenőrzések [5]. HP fertőzés krónikus gastritis is szignifikáns összefüggésben down-regulációja E-cadherin miatt megnövekedett promoter metiláció [6], mivel felszámolására HP jelentősen csökkentette a MMP-9, egy metalloproteináz pozitív összefüggésben áll a tumor invázió és metasztázis [ ,,,0],7], az antrum, és a corpus nyálkahártya [8].
továbbá a HP fertőzés, van számos vezető okok aberráns génexpresszió gyomorrák, és a mechanizmus a gyomorrák áttét nagyon összetett, valamint . A Ras-függő MAPK jelátvitel, ami végül is vezet megnövekedett proliferációt gyomorrák és elsősorban okozta rendellenességek K-ras aktiválás, gyakran jár együtt a bél-típusú gyomorrákban [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), egy szekretált glikoprotein fontos funkciókat kalcium és foszfát homeosztázis, jelentették kell kifejezni, a magas szintű rákos gyomor szövetek, nyirokcsomó-metasztázis, és a vénás invázió [10]. Az 5 éves túlélési arány szignifikánsan alacsonyabb volt a betegekben STC2 expressziós betegekhez képest, anélkül STC2 kifejezés [11]. BDNF (agyból származó neutrophic faktor) kifejezés jelentették Szignifikánsan fokozott expressziója gyomorrákban szövetben, mint a szomszédos normális nyálkahártya, és a magas szintű BDNF az invazív első korreláltatták hajó invázió, nyirokcsomó áttét, hashártya terjesztése, és a szegény prognózissal gyomorrákos betegek [12]. Annak ellenére, hogy a haladás azonosításában a fenti szabályozó gének, a pontos mechanizmus mögöttes okozó GC metasztázis továbbra is meg kell határozni.
Dysregulations a mikroRNS igen fontos szerepet játszanak a tumorok. A szerepe mikroRNS gyomorkarcinómában tumorigenezisben már jól dokumentált. Itt elsősorban a miR-206, amely együtt a szorosan kapcsolódó paralógok miR-1, 133a és miR-133B, játszik nagyon fontos szerepet izom differenciálódás. Ez a négy mikroRNS erősen konzervált a szekvenciája és genomiális szerveződését, és nevezik myomiRs mert azt találtuk, hogy magas szinten expresszálódnak az izom- [13]. MiR-1-1 /miR-133a-2, miR-1-2 /miR-133a-1 és miR-206 /miR-133B klasztereket alkotnak, három különböző kromoszóma régiók a humán genom 20q13.33, 18q11.2 és 6p12.2, ill. Azonban ezek a miRNS működhet tumorszuppresszorok különböző humán rákos megbetegedések [14]; például, miR-1 és miR-133a találták gyakran alulszabályozott a húgyhólyag rákos megbetegedések, és elnyomja a tumornövekedést célzásával TAGLN2 [15]. MiR-1 és miR-206-nál mutatták ki hasonló tumor szupresszor szerepet harántcsíkolt keresztül blokkolja a c-Met kifejezés [16]. MiR-206 is jelentette, hogy egyfajta tumor szuppresszor emlőrákban [17], és a tüdőrák. [18] Mi jelentés itt, hogy a miR-206 expresszió fordított összefüggésben áll nyirok metasztázis, a helyi invázió, és a TNM stádium malignus GC, és arra kényszeríti kifejezése miR-206 elnyomja GC sejtnövekedést, tumorigenezis, és metasztázis. Katalógusa Anyagok és módszerek
a szövetminták katalógusa műtétileg eltávolított emberi gyomorrák és a szomszédos nem-daganatos szöveteket szereztünk 35 felvett betegek a Department of Surgery Emésztőrendszeri, a kapcsolt Kórház Nanjing Orvosi Egyetem (Changzhou második Népi Kórház). A projekt által jóváhagyott Kutatási Etikai Bizottságának Nanjing Orvosi Egyetem, és írásos beleegyezésüket adták minden beteg be a vizsgálatba. Minden szövet mintákat feldolgozott tárolásra folyékony nitrogénben, és H &E festés a patológiai elemzés.
Sejtvonalak és sejttenyészet
humán gyomorrák sejtvonalakon SGC-7901, BGC-823, AGS, nem malignus gyomor sejt vonal GES-1, és HEK293T sejteket vásárolt a Cell Resource Center, Shanghai Biokémiai Intézet és sejtbiológiai a kínai Tudományos Akadémia. Ezeket a sejteket tartottunk fenn páratartalmú inkubátorban 37 ° C-on, 5% CO 2, SGC-7901, BGC-823, és GES-1 sejteket tenyésztettünk RPMI1640 közeggel HEK293T-sejteket DMEM-ben, és AGS sejtek F12K közepes, ill. Valamennyi tenyésztési tápközeget 10% magzati borjúszérummal és antibiotikumokkal.
RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR-
Az összes RNS-t gyomor szövetekből vagy sejtvonalakat extraháljuk Trizol reagens (TaKaRa) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. cDNS-t szintetizáltunk a PrimeScript RT reagens készlettel (Takara). Kvantitatív RT-PCR-t végeztünk egy SYBR Premix Ex Taq reagenskészlet (Takara), egy 7500 valós idejű PCR System (ABI), és elemeztük az SDS elemző szoftver csomag (version 2.0.1, Applied Biosystems). PCR-primereket nyert Invitrogen, és a reakcióelegyet 95 ° C, 10 perc, majd 40 ciklus: 95 ° C 15 másodperc, és 60 ° C, 1 perc. Az U6 snRNS használtuk belső kontrollként. Az eredményeket mint szeres változást, kiszámítani 2 - △ CT módszer, és az arány kifejezés a tumorok képest a normális szövetekben kevesebb, mint 1,0 tekintettük alacsony.
Vektor konstrukciók
Pri -miR-206-t amplifikáltunk a normál humán genomiális DNS PCR primerek felhasználásával: 206-5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'és 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. A PCR-fragmenst építettük be MSCV-P2GM vektor generálni P2GM-miR-206. Az üres P2GM vektort alkalmaztuk kontrollként.
Cell transzfekció
plazmid transzfekciója SGC-7901 sejteket végezzük Lipofectamine 2000 (Invitrogen), és stabil klónokat hordozó P2GM-miR-206, vagy üres vektor került kiválasztásra a puromicin-rezisztencia (10 ng /ml). MiR-206 és a negatív kontroll utánozza nyerték Ribobio (Guangzhou, Kína) és transzfekciója utánozza a SGC-7901 sejtek segítségével végeztük Oligofectamine (Invitrogen). Röviden, SGC-7901 sejtek oltottuk ki 1 nappal korábban transzfektáltunk 100 nm miR-206 vagy ellenőrző utánozza elérése 50% összefolyás. 48 óra elteltével a sejteket feldolgoztuk a további elemzéshez.
Cell proliferációs vizsgálati
MTT assay-t becsléséhez használt proliferatív aránya SGC-7901 sejteket. Röviden, SGC-7901 sejteket trypsinzed 2 nappal a transzfekció után, és reseeded 2,5 × 10 3 sejt per lyuk 96 lyukú lemezeken. MTT-t (3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, 5-difenil-tetrazoliumbromide) adunk a táptalajhoz meghatározott időközönként xx óráig keverjük, és az abszorbanciát 490 nm-en mértük spektrofotométerrel. Minden assay-t háromszoros ismétlésben, és háromszor megismételtük függetlenül.
Telepképző assay
Stabil SCG-7901 hordozó sejtek miR-206 vagy az üres kontroll tripszinizáltuk és újra szélesztjük 1 × 10 3 lyukanként 6 nos lemezek. 14 nap után a tenyészetben RPMI 1640, kiegészítve 10% FBS-sel, telepeket fixáljuk 3,7% metanol és megfestettük 0,1% -os kristályibolya. A telepeket, amelyek legalább 50 sejtet pontoztuk. Minden assay-t három párhuzamosban.
Áramlási citometria
SGC-7901 transzfektált sejtek miR-206 utánozzák vagy negatív kontroll tripszinizáltuk és újra szuszpendáljuk 1 × kötő pufferben 1 × 10 6 sejt /ml volt. 100 ul sejtszuszpenziót inkubáltunk 5 l FITC-Annexin V és 5 ul propridium jodid (PI) 15 percig a sötétben. A reakciót leállítottuk hozzáadásával 400 ul 1 × kötőpuffer és elemzik (FACSCalibur segítségével CellQuest szoftvert (Becton Dickinson). FITC-Annexin V-pozitív és a PI-negatív sejteket tekintik apoptotikus és a kísérleteket végeztük háromszori ismétlésben.
migrációs és behatolás vizsgálatokban
Sebgyógyulái sejtmigrációt mérésével mozgása sejteknek egy acelluláris terület által létrehozott kaparás az egybefolyó sejt gyep egy 200 ul pipetta hegyét. a sebet lezárást fényképezett 48 órával később a mikroszkóp alatt. a transwell migrációs assay, 5 × 10 4-sejteket adtunk be a felső kamrába a betét (BD Science, Sparks, MD, USA), míg 1 × 10 5 sejteket alkalmaztuk Matrigel invázió vizsgálatokban. ezekben a kísérletekben, a sejteket tripszinnel kezeltük, és újra szuszpendáljuk szérummentes tápközegben, mielőtt beoltottuk a felső kamrába. a teljes táptalajt, amely 10% FBS-t adtunk hozzá, az alsó kamrában. A sejteket nedvesített inkubátorban 37 ° C-on 24 órán át. A sejteket a membrán fixáltuk, foltos, és számolni. Mindegyik kísérletet végeztünk háromszoros ismétlésben.
Xenograft tumor modell
fiatal nőstény csecsemőmirigy nélküli csupasz egerekben (6 hetesek) szereztünk be a állat Research Center a Nanjing Egyetem. Körülbelül 1,5 × 10 6 stabil SGC-7901 hordozó sejtek P2GM-miR-206 vagy az üres vektort injektáltunk szubkután az alsó széleken 5 meztelen egerekben. A tumorok térfogatát mértük 3 naponként hatodik napon befecskendezés után kezdve 24 nappal az állatokat leöltük. A végső térfogat és tömeg után mértük a tumorokat kimetszettük. Csupasz egereket manipulált és gondozott NIH Animal Care and Use Committee iránymutatások kísérlet Animal Center a Nanjing Orvosi Egyetem (Nanjing, Jiangsu, tartomány, Kína).
Statisztikai analízis katalógusa statisztikai analízist az SPSS programcsomag (SPSS 16.0 standard változat, SPSS Inc.). Az adatok kimutatták, átlag ± SEM. A párosított-mintákat T
-próba használtuk az elemzés során a differenciális miR-206 expressziós között tumoros és normális szövetekben. Az in vitro és in vivo kísérletekben, független-mintás t
-próba használtunk jelentőségének értékelésére különbség a kezelt és a kontroll csoportok között. P érték < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa Eredmények katalógusa down-regulációja miR-206 korrelál a humán gyomorrák tumorigenezis, invázió, és metasztázis katalógusa A genom szintű felmérés mikroRNS expresszió, amit korábban azonosított több tagja a myomiR család, nevezetesen miR-1 /133a és miR-133B /206, melynek hatására csökkentek a neuroectodermic rák (nem közölt eredmények). Ezek a mikroRNS elsősorban ismert, hogy működnek miogén differenciálás és, kisebb mértékben, a tumorigenezis gyermekgyógyászati ​​rákok. Hogy vizsgálja ha ezek myomiRs is lehet szerepe a tumorigensis közös rák a felnőtt, megvizsgáltuk az expressziós szintet valós idejű szár-hurok RT PCR technika egy kohorsz frissen kimetszett gyomor daganatok és azok megfelelő normál szövetekben, és megállapították, hogy a medián aránya miR-206 viszonyítva U6 snRNS a 35 tumorok volt 4-szer alacsonyabb, mint a normál szövetekben (1A). Páronkénti összehasonlítás azt mutatta, hogy több mint 85% a daganatok mutatták, nagyobb, mint 2-szeres csökkenést a miR-206 expressziós összehasonlítva a megfelelő kontroll, csak két pár mutatja növekedés (1B ábra). Expression of miR-206-ben szintén csökkent számos emberi gyomor rákos sejtvonalak, ideértve a SGC-7901, BGC-823, MGC-803, és AGS sejtek összehasonlítva a GES-1 normál gyomor-sejtek (1C). Klinikopatológiai nyilvántartást ezek a daganatok mutatták, hogy a csökkentés a miR-206 expressziója szignifikánsan összefüggött a nyirok metasztázis, a helyi invázió, és a TNM stádium malignus, de nem az életkor, a nem, a tumor mérete és elhelyezkedése (1. táblázat). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a miR-206 normális fejtenek ki gátló kontroll a gyomor tumorigenezis, invázió, és metasztázis. 1. ábra csökkentett szintje miR-206 expresszió gyomorrák szövetekben és sejtvonalakban. (A) megoszlása ​​a miR-206 expresszió kohort 35 emberi GC és jóindulatú szövetek qRT-PCR-rel. Az endogén U6-RNS-t használjuk belső ellenőrzés. (B) páros összehasonlítása a miR-206 expressziós között GC és a megfelelő nem-rákos szövetekből mutató miR-206 expresszió csökkent 86% (30/35), a minta pár. (C) relatív expresszióját miR-206 négy GC sejtvonalak, és egy normális gyomor sejtvonal (GES-1). 1. táblázat katalógusa klinikai és jellemzői a miR-206 katalógusa kategóriák Matton NO. A betegek
relatív szintje miR-206 (átlag ± SEM) Matton P-érték
Gender katalógusa Férfi katalógusa 21 katalógusa 0,49 ± 0,07
0,32 fiatal női katalógusa 14
0,40 ± 0,06 katalógusa Életkor (év) hotelben ≥60 katalógusa 19 katalógusa 0,45 ± 0,05 0,93 katalógusa katalógusa < 60
16 katalógusa 0,46 ± 0,09 katalógusa Átmérő (cm) hotelben ≥5 katalógusa 13
0,46 ± 0,09 0,90 katalógusa katalógusa < 5 katalógusa 22 katalógusa 0,45 ± 0,05 katalógusa hely katalógusa Közép- és közeli harmadik katalógusa 23 katalógusa 0,47 ± 0,06 0,65 katalógusa katalógusa distalis harmadában katalógusa 12 katalógusa 0,42 ± 0,07 katalógusa mértékű megkülönböztetést katalógusa jól és közepesen katalógusa 12 katalógusa 0,48 ± 0,07 0,70 katalógusa katalógusa rosszul katalógusa 23 katalógusa 0,44 ± 0,07 katalógusa Helyi invázió katalógusa T1 + T2 katalógusa 10 katalógusa 0,65 ± 0,07 katalógusa 0.01 katalógusa T3 + T4 katalógusa 25 katalógusa 0,37 ± 0,05 katalógusa nyirokcsomó áttétek katalógusa NO katalógusa 14
0,57 ± 0,06 0,04 katalógusa katalógusa IGEN katalógusa 21
0,38 ± 0,07 katalógusa TNM katalógusa I + II
12 katalógusa 0,60 ± 0,07 0,02 katalógusa katalógusa III + IV katalógusa 23 katalógusa 0,38 ± 0,06 katalógusa Expression miR-133a-t úgy találták, hogy lefelé szabályozni a daganatok a fenti kritériumok (Plusz fájl 1: ábra S1), de expressziója miR-1, amelynek a génjeit csoportosulnak azokkal kódolás miR-133a [14], nem volt (Plusz fájl 2: S2 kép). Mivel a miR-206 kódolja egy egyedi gén, ezt választottuk a további vizsgálatokhoz.
MiR-206 gátolja a gyomorsav ráksejtek növekedését katalógusa Annak megállapításához, hogy a miR-206 van a hajlandóság, hogy elnyomja gyomorrák tumorigenezis, bevezettük a szintetikus kétszálú miR-206-utánzatok, 206mi, hogy megváltoztassa a szint teljes miR-206 SGC-7901 gyomorrák-sejtek, amelyek kifejezik az alacsony szintű miR-206 képest, hogy a GSE-1 normál kontroll sejtek (1C) , és ellenőrizni a sebesség a sejtnövekedés a tetrazolium festék, 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT). Szár-hurok PCR megerősítette a megemelkedett szintje miR-206 a transzfektált SGC-7901 sejtek (2A ábra), és az eredményeket a MTT assay jelezte, hogy a növekedés üteme ezen sejtek csökkent jelentősen képest, hogy a sejtek fogadó nem egyedi ellenőrzési utánozza, miR-ctrl, mint egy 5 napos időszak (2B). Mi is generált egy előre-miR-206 kifejező plazmidot a P2GM vektor, és a fluoreszcencia-aktivált sejt-(FACS) elemzés azt mutatta, az elhúzódó G1-fázis és a rövidített S-fázis P2GM-206 (P206) transzfektált összehasonlítva a P2GM vektor transzfektált SGC-7901 sejtek (2C ábra), így igazoltan eredményt a fenti 206mi utánozzák kísérletet. Mesterségesen növeli az összes szinten a miR-206 206 km is eredményezte jelentős növekedését az apoptózis 48 órával SGC-7901 sejtek a kontrollhoz képest utánozza transzfektált sejteket meghatározott áramlási citometriás elemzése PI és az Annexin V dupla felvétel (2D, ábra és E). Ezek az adatok azt jelzik, hogy a miR-206 egy potens anti-proliferatív szabályozó tenyésztett gyomor rákos sejteket. 2. ábra kényszer kifejezése miR-206 elnyomja elterjedése SGC-7901 gyomorrák sejtek. (A) összesen szintje miR-206 SGC-7901 transzfektált sejtek a miR-ctrl vagy a szintetikus utánozza a miR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) Az MTT assay SGC-7901 transzfektált sejtek miR-206 utánozza a végső koncentrációban 100 nm. Kezdve 24 órával a transzfektálás után a vizsgálati eljárások volt olvasni minden 24 H 5 egymást követő napon. Az eredményeket átlag ± SEM három független kísérlet során. (*** P < 0,0001). (C) A hisztogram ábrázoló sejtciklus eloszlása ​​SGC-7901 sejtek átmenetileg transzfektált P2GM-miR-206 vagy P2GM-ctrl (100 nM). Az eredmények jelentik az eszközök ± SEM három független kísérlet (* P < 0,05). (D) festődő sejtek pozitív Annexin V-FITC és negatív PI 48 óra transzfekció után úgy tekintettünk, hogy apoptózist. (E) Átlagos az apoptózis mértéke három független kísérlet ± SEM mutatjuk be (*** p < 0,0001).
MiR-206 gátolja a lehorgonyzástól függő gyomorrák sejtek növekedését és xenograft tumor kialakulását
Annak vizsgálata, hogy hosszú távon hatása miR-206 a sejtnövekedésre és a kolónia képződését, generáltunk egy stabil vonal SGC-7901 sejteket, P2GM-miR-206, amely kifejezi a miR-206 egy konstitutívan aktív vektor, MSCV-P2GM, és egy sor üres vektor -carrying sejtek P2GM-miRctrl. Először megvizsgáltuk, expressziós szintjének miR-206 ezen a két stabil sejtvonalak és megállapította, hogy a miR-206-ben drámaian megemelkedett P2GM-miR-206 stabil sejtvonal (3A ábra). Aztán vizsgáltuk a miR-206 a lehorgonyzástól függő növekedést gyéren vetés tripszinizált sejtek közvetlenül Petri-csészébe, és jelenítse meg a sejt telepeket kristály ibolya festést követő 14 napon belül a kultúra. Az eredmények azt mutatták, hogy a vektor-hordozó kontroll stabil sejtek kialakult szignifikánsan több telepeket, mint a miR-206-et expresszáló sejtek (3B, ábra és C). Mi tovább beadni ezeket a stabil sejtek szubkután két bilaterális alsó háta meztelen egerek, és ellenőrizni a tumor növekedését naponta. Huszonnégy nappal az injekció után, ezek az egereket feláldoztuk, és a tumorokat kimetszettük és lemértük (ábra 3D és E). Az eredmények azt mutatták, hogy az átlagos mennyiségű miR-206-expressziót mutató tumorok növekedése sokkal lassabb ütemben, mint a kontroll tumorok és az átlagos végső tömeg szignifikánsan kisebb volt, mint a kontroll (3F ábrán és G). 3. ábra A miR-206 elnyomja lehorgonyzástól függő GC sejtnövekedést és xenograft tumor kialakulását. (A) Az expressziós szintjének miR-206 P2GM-miR-206 stabil sejtvonal és a vektor-hordozó kontroll stabil sejtek (*** P < 0,0001). (B) Ezer stabil SGC-7901 sejtek a miR-206 és a negatív kontroll vittük fel 6-lyukú lemezekre és egy telepképző assay végezni. A reprezentatív eredményeket az kolóniaképzést P2GM-miR-vezérlés, P2GM-miR-206. (C) a telepek számát megszámoljuk a 14. napon beoltás után. Stabil SGC-7901 sejtek a miR-206 nőtt a kisebb sűrűségű, mint a NC. Az eredmények jelentik az eszközök ± SEM három független kísérlet (** P < 0,01). (D) SGC-7901 sejtek stabil expresszióját miR-206, vagy sem szubkután oltottuk be mindkét oldalukon a csupasz egerek (n = 5 per csoport). Reprezentatív fényképek a csupasz egerek 24 nappal a beoltás után jelennek meg. (E) az egereket leöltük és a tumorokat lemértük 24 nappal a beoltás után, a xenograftok a miR-206 fokozott expressziója szignifikánsan kisebbek voltak, mint a kontroll xenograftok. (F) azt mutatja, a tumor növekedési görbe (* P < 0,05 és ** P < 0,01). (G) A tumorokat minden egyes csoportból lemértük közvetlenül a kivétel után. Az átlagos tumor tömeg feltüntetése átlag ± SEM (* P < 0,05).
MiR-206 gátolja a gyomorsav ráksejtek terjedését és migráció
csökkent expressziója miR-206 a lokálisan invazív és metasztázisos daganatok (1. táblázat) azt sugallja, hogy ez a mikro-RNS szabályozza sejt migrációs folyamatot. Annak megállapítására, hogy valóban ez az eset áll fenn, akkor végzett sebgyógyulás és transzwell migrációs assay a miR-206-et expresszáló stabil SGC-7901 sejtek. Az eredmények azt mutatták, hogy a méhen kívüli overexpressziója miR-206 okozott elnyomása sejt migráció SGC-7901 sejtek nyilvánvaló a sebgyógyító assay (4a ábra A és B), valamint a transwell sejt migrációs assay (4C és D). Méhen kívüli overexpressziója miR-206 tovább gátolja SGC-7901 sejtek invázióját, amint azt a Matrigel inváziós vizsgálat (ábra 4E és F). Ezért, miR-206 megjelenik egy szuppresszív tulajdonság a rákos sejtek migrációját és invázióját vizsgálatok in vitro. A 4. ábra a miR-206 gátolja a GC-migráció és invázió in vitro. (A) A sebgyógyító vizsgálat kimutatta, különböző sejt motilities a miR-vezérlés, miR-206 sejtekben. A méhen kívüli kifejezése miR-206 természetesen gátolja a migráció SGC-7901 sejtek. (B) mutatja a statisztikai eredményeket. Az adatok képviselik a átlagai ± SEM három független kísérlet során. (** P < 0,01). Túlzott kifejeződése a miR-206 jelentősen korlátozódna képességeit sejt migráció (C) és inváziós (E) miR-206-et expresszáló stabil SGC-7901 sejteket, mint a negatív kontroll. (D, F) mutatja a statisztikai eredmények rendre. Az adatok képviselik a átlagai ± SEM három független kísérlet során. (** P < 0,01; *** P < 0,0001).
MiR-206 gátolja a máj metasztázis GC in vivo katalógusa hatásának vizsgálata a miR-206 a metasztázis in vivo, végeztünk farok -vein injekciót P2GM-miR-206 és a vektort egyedül P2GM sejtek csupasz egerekben 42 nappal az injekció után, mi összegyűjtjük, és fényképezett a májat (5A, felső panelek). H &E festés a szöveti metszetek jelzett egy 7-szer alacsonyabb a metasztázisok száma alapján tumor gócok egységnyi területen májában injektált P2GM-miR-206 sejtek, mint azok injektáltunk P2GM kontroll sejtek (5A ábra, alsó panel és B). Sőt, a méretek a tumor gócok a P2GM-miR-206 sejt injekciózott májat sokkal kisebbek voltak, mint a kontroll csoportban (5A ábra). Ez az eredmény erősen azt állítja, hogy a miR-206 normális lehet a tumor szupresszor szerepet áttétek megelőzésére a gyomor rákos sejteket. 5. ábra A miR-206 gátolja a máj metasztázis GC in vivo. (A) Reprezentatív makroszkopikus képeket egér máj, 42 nappal a beoltás után, (a felső). Reprezentatív fényképeket H &E festett spontán májáttétek. Nagyítás: 10 × (A) alacsonyabb. Az eredmények azt mutatják, hogy a daganat csomók P2GM-miR-206 csoport kisebbek voltak, és kevesebb, mint a kontroll csoportban. (B) számok a máj áttétes lókusz megszámoltuk, és összehasonlították a hordozó egerekből SGC-7901 vektor kontroll sejtek, SGC-7901 expresszáló sejtek miR-206. Az adatok képviselik a átlag ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) Relatív mRNS szintje a feltételezett célpontjai miR-206 között SGC-7901-miR-P2GM, SGC-7901-miR-206 sejtekben. (D) A relatív mRNS szintje a feltételezett célpontjai miR-206 között GES-1 és SGC-7901 sejtvonalak.
Annak megállapításához, a mechanizmus, amely által a miR-206 fejti ki anti-metasztatikus szerepet kerestünk lehetséges miR 206 target gének kombinációja segítségével az online mikroRNS célbefogás eszközöket, és összehasonlítja a kapott jelöltek azok, amelyek leírták, hogy szerepet játszik a metasztázisok. Egy medence 20 ilyen gének, azt találtuk, közülük 9 (Plusz fájl 3: táblázat S1), nevezetesen STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, és a K-ras, drasztikusan alulszabályozott a miR-206 a P2GM-miR-206 stabil sejtek képest saját szintjükön a P2GM vektor stabil sejtek (5C). Néhány ilyen miR-206 célgének voltak jelentősen felülszabályozott a szülői SCG-7901 GC tumorsejtek, összehasonlítva a normál gyomor GES-1 sejteket (5D ábra), ami arra utal, valószínűleg oki esemény. Így miR-206 valószínűleg gátolja a metasztázis GC tumorsejtek hálózatán keresztül szabályozó gének. Katalógusa Megbeszélés katalógusa Bár zavara miRNS számoltak be különböző emberi rákos [19], kóros expressziója és lehetséges szerepe a miRNS-ek a gyomor rákos elváltozást understudied. Itt bemutatjuk, hogy a miR-206 gyakran downregulált a humán gyomor rák és rákos sejtvonalakban. Figyelembe véve a csökkentett miR-206 expresszió jelentett többféle daganat, eredményeink arra utalnak, hogy csökkenti a miR-206 expresszió valószínűleg előfeltétele esemény a tumorok. Ez a követelmény tette még fontosabb, amikor azt tapasztaltuk, hogy az alacsony miR-206 szignifikáns összefüggést mutattak a nyirok metasztázis, a helyi invázió, és a TNM stádium. Ez az elképzelés a támasztja alá az eredmények a méhen kívüli kifejezése miR-206 GC sejtvonal SCG-7901, ami azt mutatta, hogy a miR-206 elfojtott GC sejtburjánzást, telepek kialakulása invázió, és a migráció. Végül, a képesség, a miR-206, hogy elnyomja metasztázis SCG-7901 sejtek a májban adott egyértelmű magyarázat a korreláció alacsony szintje miR-206 és az invazív és metasztatikus gyomor rák. Nemrégiben STC2 azonosították prediktív marker nyirokcsomó-metasztázis nyelőcső pikkelyes sejtes karcinóma [20]. Expressziója TrkB és BDNF rossz prognózissal társul NSCLC betegekben [21]. Számos tanulmány számolt be, hogy IGF1R kifejezés megemelkedik áttétes prosztatarákban és a hormon rezisztencia progresszió [22, 23]. BCL2 expressziója primer prosztatarák markere rossz prognózist, fokozott kiújulási kockázattal [24]. Mit mond a fenti utal a közös onkogén szerepe az emberi rák. További azonosítottunk STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF és a K-ras, mint feltételezett funkcionális célokat a miR-206, a részei voltak beszélt felett. Mindezzel együtt, az eredmények arra utalnak tumorszuppresszorként szerepe a miR-206 humán gyomorrák. Katalógusa Bizonyíték a miR-206, mint a tumor növekedését gátló számoltak be egyes rákok: miR-206-ben először találták downregulált a ERalpha -pozitív humán mellrák szövetekben és bevezetése miR-206 az ösztrogén-függő MCF-7 emlőrákos sejteket gátolja a sejtnövekedést dózis- és időfüggő módon [25]. Sőt, miR-206 segítheti miogén differenciálódást és a blokk tumornövekedést-xenograftot hordozó egerekben mTOR gátlása miatt csökken a termék a MET protoonkogén: Met tirozin-kináz-receptor [26]. Yan is megállapították, hogy gátolja a miR-206 funkciója hozzájárulhatnak aberráns sejtek proliferációját és migrációját, ami a rhabdomyosarcoma fejlődését elnyomása c-Met [16]. Eközben miR-206 lehetne használni, hogy gátolják a HeLa sejtek migrációját és a fókusz kialakulását azáltal, hogy gátolja mind a Notch3 fehérje és mRNS [27]. Továbbá, a miR-206-ben downregulált nagy áttét tüdőrák képest alacsony metasztázis tumoros és normál tüdőszövet, túltermelése miR-206 gátolja migrációs és behatolás tüdőrákos sejtek [18]. MiR-206 expresszió csökkent ösztrogén receptor-α (ERa) -pozitív endometrium endometrioid adenokarcinóma (EGK) és annak overexpressziója gátolta ERa-függő proliferációs, károsodott invazivitását és indukált sejtciklus az ERa-pozitív EGK sejtvonalak [28]. Mindezek az eredmények azt mutatták, hogy a miR-206 játszhat tumorszuppresszor szerepet a különböző rákos megbetegedések.
Metasztázis hozzájárul a legtöbb rákos halálesetek. GC soraiban, mint a második vezető oka a rák okozta halál világszerte, mert a magas arány az áttétek, beleértve nyirokcsomók, hashártya, máj, stb Különösen az 5 éves túlélési arány gyomor tumor máj áttétek nem haladja meg a 10% -ot, és a medián túlélés kezelés nélkül körülbelül 3-5 hónap alatt [29]. Több gént játszott döntő szerepet GC metasztázis: mint például a túlzott mértékű expressziója az inzulin-szerű növekedési faktor receptor-I (IGF-IR) és az aktiválási a jelátviteli útvonalak egyaránt kritikus szerepet játszanak a fejlesztés és progressziójában gyomorrák. Kopogó lefelé SPL expresszió kis gátló RNS vezetett csökkent IGFIR expresszió és legyengített növekedés és metasztázis gyomorrák-sejtek [30], különben IGF1R lehet downregulált által miR-7 és szignifikánsan csökkentette a GC-migráció és invázió [31]. Adachi találtuk, hogy blokád az IGF-IR szerepet játszik a elnyomása ráksejtek terjedését keresztül alulszabályozása matrilizin [32]. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Az endotél lipáz fehérje ígéretes húgyúti biomarker diagnosztizálására gyomorrák
• Jelentősége csali receptor 3 (DcR3) és külső jel szabályozott kináz 1/2 (Erk1 /2) a gyomorrák