MicroRNA-206 potláča žalúdočnú rast rakovinových buniek a metastáz

MicroRNA-206 potláča žalúdočnú rast rakovinových buniek a metastáz
abstraktné
rakovina žalúdka je jednou z hlavných príčin úmrtí na rakovinu po celom svete a nesie vysokú mieru rizika metastatické. Okrem iných onkogénov kódujúcich proteíny a tumor supresorových génov, microRNA hrajú dôležitú úlohu v progresii rakoviny žalúdka tumorigénny. Tu ukazujeme, že mier-206 je exprimovaný na výrazne nízkych hladinách v kohorte nádorov žalúdka v porovnaní s ich zodpovedajúcich normálnych tkanív, a v rade žalúdočných nádorových bunkových línií. Down-reguláciu MIR-206 bol obzvlášť výrazný u nádorov lymfatických metastáz, miestne invázie, a pokročilé TNM staging. Zistili sme, že nútená expresie MIR-206 potlačil proliferáciu, kolónie tvorbu a xenoštěpem tumorigenezi z SCG-7901 bunky, línie rakovinových buniek žalúdka. Nútené expresie MIR-206 tiež potlačená SCG-7901 migráciu buniek a inváziu, rovnako ako metastázy v bunkovej kultúre alebo chvostovej žily injekčne myšiach modeloch, v danom poradí. Anti-metastatického účinku MIR-206 je pravdepodobne sprostredkovaná cielenie metastáz regulačných génov STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, Bcl2, BDNF, a K-ras, ktoré boli výrazne down-regulované stabilný expresie exogénneho Mir -206 do SCG-7901 buniek. Celkovo vzaté, naše výsledky naznačujú, že mier-206 je nádor potláčajúcich žalúdočné rakoviny, ktorá koná v krokoch, ktoré regulujú metastáz.
Kľúčové
Karcinóm žalúdka MIR-206 metastázy nádoru potlačujúci Úvod
Karcinóm žalúdka (GC) zaradila na štvrtou najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu spojených s po celom svete [1]. Prognóza pre pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka je zlá, napriek nedávnemu zlepšeniu v gastriectomy, chemoterapia, rádioterapia a [2]. Vzhľadom k tomu, GC je polygénny ochorenie, vznikajúce v dôsledku niekoľkých génových dysregulations, objasnenie regulačné siete sa riadi GC tumorigeneze je nevyhnutné pre vývoj nových cielených terapií.
Vzniku nádorov v žalúdku, je viacstupňový proces, ktorý zahŕňa genetické a epigenetické zmeny bielkovín -coding rovnako ako nekódujúca preto-onkogény a tumor-supresorových génov. Interakcia medzi hostiteľom, životného prostredia a bakteriálnych faktory, ktoré ovplyvňujú priebeh choroby. Helicobacter pylori
(HP) infekcia bola založená ako hlavný rizikový faktor pre GC; dve histologické podtypy rakoviny žalúdka, na črevnú a difúznych subtypov, sú spojené s infekciou HP, ktorý tvorí viac ako 80% prípadov [3], a to najmä v antrálnej /tela žalúdka rakoviny [4]. Mechanicky bolo zistené, že infekcia HP spôsobiť dvojnásobný nárast EGF a EGFR v žalúdočnej antrálnej biopsia tkaniva, ale jeho odstránenie znižuje hladiny oboch faktorov, ktoré sú ovládacie prvky [5]. infekcie HP u pacientov s chronickou gastritídou je tiež významne spojené s down-reguláciou E-cadherinu v dôsledku zvýšenej metylácie promótorom [6], vzhľadom k tomu, odstránenie HP významne znížila hladiny MMP-9, metaloproteinázy pozitívne spojená s nádorovú inváziu a metastázy [ ,,,0],7], v antra a corpus sliznice [8].
Okrem infekciu HP, je tu veľké množstvo príčin, ktoré vedú k aberantne expresii génu pri rakovine žalúdka, a mechanizmus žalúdočné nádorových metastáz je veľmi zložité, rovnako , Ras-MAPK signalizačnej závislá, čo nakoniec vedie k zvýšenej proliferácii u karcinómu žalúdka a je spôsobená predovšetkým tým, odchýlok aktiváciou K-rás, je často spojená s rakovinou žalúdka intestinálneho typu [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), vylučovaný glykoproteín s dôležitými funkciami v homeostázu vápnika a fosfátu, bola hlásená byť vyjadrený vo vysokých úrovniach rakovinové žalúdočné tkaniva, lymfatických uzlín, a žilovej invázie [10]. Miera prežitia 5 rokov bolo u pacientov s STC2 expresie významne nižšie v porovnaní s pacientmi bez STC2 expresie [11]. BDNF (Brain-odvodený neutrophic faktor) bola expresie hlásených vykazujú významne zvýšenou expresiu v karcinómu žalúdka tkanive v porovnaní s priľahlou normálnou sliznice, a vysokej úrovne BDNF na invazívnu prednej boli korelované k nádrži invázii, lymfatických uzlín, peritoneálnej šírenie, a chudobný prognóza u pacientov s karcinómom žalúdka [12]. Napriek pokroku v určovaní vyššie uvedených regulačných génov, presný základný mechanizmus spôsobujúce GC metastázy ešte zostáva určiť.
Dysregulations mikroRNA hrajú veľmi dôležitú úlohu pri vzniku nádorov. Úloha mikroRNA v karcinómu žalúdka vzniku nádorov je dobre zdokumentovaná. Tu sa zameriavame na Mir-206, ktorý spolu so svojimi paralogy úzko súvisiacimi MIR-1, 133a a mier-133b, hrá veľmi dôležitú úlohu pri svalovej diferenciácie. Tieto štyri microRNA sú vysoko konzervované v poradí a genómovej organizáciu, a sú nazývané myomiRs, pretože sa zistilo, že sa vyjadrí pri vysokých hladinách vo svaloch [13]. MIR-1-1 /MIR-133a-2, MIR-1-2 /MIR-133a-1, a mier-206 /MIR-133b tvorí zhluky v troch rôznych chromozomálnych oblastiach v ľudskom genóme 20q13.33, 18q11.2 a 6p12.2, resp. Avšak, tieto miRNA môžu pôsobiť ako nádorové supresormi v rôznych ľudských nádorov [14]; Napríklad bolo zistené, že mier-1 a Mir-133a, aby sa často down-regulované u karcinómov močového mechúra, a potláča rast nádoru zacielením TAGLN2 [15]. Mir-1 a Mir-206 bolo preukázané, že majú podobné tumor-supresorové role v rabdomyosarkom blokovaním expresie c-Met [16]. MIR-206 bola tiež hlásená pôsobí ako supresor nádoru rakoviny prsníka [17], a rakovina pľúc [18]. Máme správy, že tu MIR-206 expresie je nepriamo spojená s lymfatickým metastázy, miestne invázie, a TNM malignít inscenácie GC, a núti expresiu Mir-206 potláča GC rast buniek, tvorbe nádorov a metastáz.
Materiály a metódy
Tkanivové vzorky
Chirurgicky operaciindikováni rakovina žalúdka u ľudí a priľahlé non-nádorového tkaniva boli získané od 35 pacientov hospitalizovaných v oddelení gastrointestinálne chirurgie, pridružená nemocnice Nanjing lekárskej univerzity (Changzhou Second ľudová nemocnice). Projekt bol schválený etickou komisiou pre výskum Nanjing lekárskej univerzity, a písomný súhlas bol získaný od každého pacienta zapísaný v tejto štúdii. Všetky tkanivové vzorky boli spracované pre skladovanie v tekutom dusíku a H &. E farbenie na patologickú analýzu
Bunkové línie a bunková kultúra
ľudských nádorových bunkových línií žalúdočné SGC-7901, BGC-823, AGS, non-malígne bunky žalúdka linka GES-1 a HEK293T bunky boli zakúpené od cell Resource Center, Shanghai ústav biochémie a bunkovej biológie, čínskej akadémie vied. Tieto bunky boli udržiavané vo vlhkej inkubátora pri teplote 37 ° C, 5% CO 2 a SGC-7901, BGC-823, a GES-1 bunky boli pestované v RPMI1640 médiu, HEK293T bunky v DMEM a AGS bunky v F12K médium, v tomto poradí. Všetky kultivačné médiá boli doplnené 10% fetálnym bovinným sérom a antibiotikami. Extrakcia
RNA a kvantitatívnej PCR v reálnom čase
Celková RNA z žalúdočné tkaniva alebo bunkové línie boli získané za použitia TRIzolu činidla (TAKARA) podľa inštrukcií výrobcu. cDNA bola syntetizovaná s reagenciami súpravy PrimeScript RT (Takara). Kvantitatívny RT-PCR bola vykonaná za použitia metódy SYBR Premix Ex Taq (Takara) na systém PCR v reálnom čase, 7500 (ABI) a analyzované s SDS analýza softvérového balíka (verzia 2.0.1, Applied Biosystems). PCR priméry boli získané od firmy Invitrogen, a reakčná zmes bola 95 ° C, 10 min, nasledovalo 40 cyklov 95 ° C 15 sekúnd a 60 ° C, 1 min. U6 snRNA bola použitá ako vnútorná kontrola. Výsledky boli prezentované ako násobok zmeny, vypočíta s použitím 2 -. △ metódou CT, a pomer expresie v nádore vzhľadom na normálnu tkanive menší ako 1,0, bola považovaná za nízku
vektorové konštrukty
Pri -miR-206 bola amplifikovaná z normálnej ľudskej genómovej DNA pomocou PCR za použitia primérov: 206-U 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'a 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. PCR fragment bol vložený do vektora MSCV-P2GM generovať P2GM-MIR-206. Prázdna P2GM vektor bol použitý ako kontrola.
Prenos buniek
Plasmid transfekcia SGC-7901 bunky boli vykonané za použitia lipofektaminového 2000 (Invitrogen), a boli vybrané klony nesúce stabilný P2GM-MIR-206, alebo prázdny vektor na puromycin odpor (10 ug /ml). Mir-206 a negatívne kontrolné napodobňuje boli získané od Ribobio (Guangzhou, Čína) a transfekciu napodobňuje v SGC-7901 buniek bolo vykonané pomocou Oligofectamine (Invitrogen). Stručne povedané, SGC-7901 bunky schovať 1 deň skôr boli transfekovány 100 nm MIR-206 alebo kontrolných napodobňuje pri dosiahnutí 50% zhlukovania. Po 48 hodinách boli bunky spracované pre ďalšiu analýzu.
Cell Test proliferácie
MTT test bol použitý na odhad proliferačnú rýchlosť SGC-7901 bunky. Stručne povedané, SGC-7901 bunky boli trypsinzed 2 dni po transfekciu a reseeded pri 2,5 x 10 3 buniek na jamku do 96-jamkových doštičiek. MTT (3- (4, 5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromide) bol pridaný do kultivačného média v stanovených intervaloch po xx hodiny a absorbancie pri 490 nm bola meraná pomocou spektrofotometra. Každý test bol vykonaný v troch vyhotoveniach a opakuje trikrát nezávisle na sebe.
Testu tvorby kolónií
Stabilné SCG-7901 buniek nesúcich MIR-206 alebo na prázdnu kontrolné boli trypsinizovány a replated 1 × 10 3 na jamku v 6 no dosky. Po 14 dňoch v kultúre v RPMI 1640 doplnenom 10% FBS, kolónie boli fixované 3,7% metanolu a farbené 0,1% kryštálovú violeťou. Kolónie, ktoré obsahujú aspoň 50 buniek boli hodnotené. Každý test bol vykonaný v troch vyhotoveniach.
Prietoková cytometria
SGC-7901 buniek transfektovaných s Mir-206 mimetikum či negatívna kontrola boli trypsinizovány a resuspendované v 1 x väzobného pufru na 1 x 10 6 buniek /ml. 100 ul tejto bunkovej suspenzie sa inkubuje s 5 litrami FITC-annexin V a 5 ul propridium jodidu (PI) po dobu 15 minút v tme. Reakcia bola ukončená pridaním 400 ul 1 x väzbovým pufrom a analyzované (FACSCalibur pomocou CellQuest software (Becton Dickinson). FITC-annexin V-pozitívnych a PI-negatívne bunky boli považované za apoptotické a experimenty boli vykonávané v triplikátech.
migrácie a invázie testy
hojenie rán migráciu buniek bola stanovená meraním pohybu buniek do acelulárna priestor vytvorený škrabanie konfluentní bunkovej trávnik s 200 ul pipety. uzatvorenie rany bola fotografovaná 48 hodín neskôr pod mikroskopom. pre transwell migračné testy, 5 x 10 4 bunky boli pridané do hornej komory vložky (BD Science, Sparks, MD, USA), pričom 1 × 10 5 bunky boli použité pre matrigelu invázie testy. pri týchto experimentoch boli bunky trypsinizovány a resuspendované v médiu bez séra pred tým, než naočkuje do hornej komory. úplnej kultivačnom médiu obsahujúcom 10% FBS bolo pridané do dolnej komory. Bunky boli inkubované vo vlhkom inkubátore pri teplote 37 ° C počas 24 hodín. Bunky na membráne boli fixované, zafarbené a počítané. Každý experiment bol vykonaný v troch vyhotoveniach.
Modelu xenografe tumoru
Mladé samica athymických nahých myší (vek 6 týždňov) boli zakúpené od zvieracom modeli Research Center Nanjing University. Približne 1,5 × 10 6 stabilný SGC-7901 bunky nesúce P2GM-MIR-206 alebo prázdnym vektorom boli injikované podkožne do spodných bokov 5 holých myší. Objemy nádorov boli merané raz za 3 dni od šiestej injekciu deň po vpred po dobu 24 dní pred boli zvieratá obetovaná. Konečný objem a hmotnosť boli merané potom, čo nádory boli vybraté. Nahé myši boli manipulované a starať sa o ne v súlade s pokynmi NIH Animal Care and Use výboru v experimente Animal stredu Nanjing lekárskej univerzity (Nanjing, Jiangsu, provincia, PR Čína).
Štatistická analýza
Štatistická analýza bola vykonaná s použitím softvérový balík SPSS (SPSS Štandardná verzia 16.0, SPSS Inc.). Údaje boli uvedené ako priemer ± SEM. Dvojica-Vzorky t
-test bol použitý v analýze diferenciálnej expresie MIR-206 medzi nádorom a normálneho tkaniva. Pre in vitro a in vivo experimenty, Nezávislé vzorky t
-test bol použitý pre posúdenie významnosti rozdielu medzi liečenou a kontrolnou skupinou. Hodnota P < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.
Výsledky
Down-regulácia MIR-206 koreluje s rakovina žalúdka vzniku nádorov, invázie a metastáz Br &genómu širokom prieskume mikroRNA expresie sme už skôr identifikovali niekoľko členov rodina myomiR, menovite Mir-1 /133a a mier-133b /206, ktorých hladiny boli znížené v neuroectodermic rakovinu (nepublikované výsledky). Tieto microRNA boli primárne známe, že fungujú v Myogénne diferenciáciu a, v menšej miere, na vzniku nádorov nádorov detského veku. Preskúmať, či môže mať úlohu v tumorigensis spoločných rakoviny u dospelých aj tieto myomiRs sme skúmali ich hladiny expresie v reálnom čase stopka-loop RT PCR kvantifikácia v kohorte čerstvo resekcii nádorov žalúdka a ich zodpovedajúce normálne tkanivá, a zistené, že stredná pomer MIR-206, vztiahnuté na U6 snRNA z 35 nádorov sa 4-krát nižšia ako u normálnych tkanív (Obrázok 1A). Párové porovnania vyplynulo, že viac ako 85% nádorov ukázala viac než 2-násobné zníženie MIR-206 expresie v porovnaní s ich ovládanie zodpovedajúcich, s iba dvoma pármi ukazujú nárast (Obrázok 1B). Expresie MIR-206 sa tiež znížila v rade ľudských žalúdočných nádorových bunkových línií, vrátane SGC-7901, BGC-823, MGC-803, a AGS buniek, v porovnaní s v GES-1 normálny žalúdočné bunkách (obrázok 1C). Klinicko-záznamy o týchto nádorov ukázalo, že zníženie expresie MIR-206 bola významne spojená s lymfatické metastázy, miestne invázie a TNM malígnym staging, ale nie na veku, pohlavia, veľkosť nádoru alebo miesta (Tabuľka 1). Tieto údaje naznačujú, že mier-206 sa môže normálne pôsobiť inhibičný kontrolu žalúdočnej vzniku nádorov, invázie a metastáz. Obrázok 1 Znížená hladina MIR-206 expresie v karcinómu žalúdka tkanivách a bunkových línií. (A) Distribúcia MIR-206 expresiu v kohorte 35 ľudských GC a nenádorové tkaniva pomocou QRT-PCR. Endogénne U6 RNA bola použitá ako vnútorná kontrola. (B) párového porovnania MIR-206 expresie medzi GC a zosúlaďovanie potrieb non-rakovinové tkanivá ukazujúci MIR-206 expresie bola znížená na 86% (30/35) z dvojíc vzoriek. (C) Relatívna expresie MIR-206 v štyroch GC bunkových línií a normálne žalúdočné bunkové línie (GES-1). Tabuľka 1
patologickým charakteristiky MIR-206
kategórie
NO. Z pacientov
Relatívna hladiny MIR-206 (priemer ± SEM)
hodnota p
rodovej rovnosti
Muž
21
0,49 ± 0,07
0,32
Žena
14
0,40 ± 0,06
vek (roky)
≥60
19
0,45 ± 0,05
0,93 Hotel < 60
16
0,46 ± 0,09
Priemer (cm)
≥5
13
0,46 ± 0,09
0,90 Hotel < 5
22
0,45 ± 0,05
Umiestnenie archívov
Strednej a blízky tretí
23
0,47 ± 0,06
0,65
distálnej tretej
12
0,42 ± 0,07
stupeň diferenciácie
dobre a stredne
12
0,48 ± 0,07
0,70
Zle
23
0,44 ± 0,07
Miestne invázie
T1 + T2
10
0,65 ± 0,07
0,01
T3 + T4
25
0,37 ± 0,05
metastáz do lymfatických uzlín
NO
14
0,57 ± 0,06
0,04
ÁNO
21
0,38 ± 0,07
TNM štádium
I + II
12
0,60 ± 0,07
0,02
III + IV
23.
0,38 ± bolo tiež zistené 0,06
expresie MIR-133a, ktoré majú byť down-regulované v nádoroch podľa vyššie uvedených kritérií (ďalšie súbor 1: Obrázok S1), ale expresie mir-1, ktorých gény sú združené s tými, kódovanie MIR-133a [14], nebol (Ďalší súbor 2: Obrázok S2). Vzhľadom k tomu, Mir-206 je kódovaný jedinečným génom, bol vybraný pre ďalšiu analýzu.
MIR-206 inhibuje rast nádorových buniek žalúdočnej
Pre stanovenie, či MIR-206 má sklon k potlačeniu rakoviny žalúdka tumorigenezi sme zaviedli syntetické dvojřetězcové MIR-206 napodobňuje, 206mm, meniť úroveň celkového Mir-206 v SGC-7901 s rakovinou žalúdka buniek, ktoré vyjadrujú nízku hladinu Mir-206 v pomere k tomu GSE 1-normálnych kontrolných buniek (obrázok 1C) a monitorovať rýchlosť bunkového rastu s použitím tetrazoliové farbivo, 3- (4,5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromidu (MTT). Kmeňových slučka PCR potvrdila zvýšenú hladinu Mir-206 v transfekciou SGC-7901 buniek (obrázok 2A), a výsledky testu MTT je uvedené, že miera rastu týchto buniek bola znížená výrazne v porovnaní s bunkami, ktorým non osobitné kontrolné napodobňuje, MIR-CTRL počas 5 dní (obrázok 2B). Tiež vytvorila pre-MIR-206 exprimujúce plazmid vo vektora P2GM, a-cell-triedenie fluorescenciou aktivovaného (FACS) ukázala, že predĺžený G1-fázy a skrátenou S-fáza v P2GM-206 (P206) transfekovány v porovnaní s P2GM vektor transfekován SGC-7901 bunky (Obrázok 2C), tak potvrdzujúce výsledok z vyššie uvedeného 206mm napodobňovať experimentu. Umelo zvýšiť celkovú úroveň MIR-206 sa 206 mi tiež viedlo k výraznému zvýšeniu apoptózy v 48 hodín v SGC-7901 buniek v kontrolnom napodobňuje transfekciou buniek, ako bolo stanovené prietokovej cytometrie PI a annexinu V dvojitej absorpciu (obrázok 2D a E). Tieto údaje naznačujú, že mier-206 je silný anti-proliferačnej regulátor kultivovaných buniek karcinómu žalúdka. Obrázok 2 Nútené expresie MIR-206 potláča proliferáciu SGC-7901 buniek karcinómu žalúdka. (A) Celkové hladiny MIR-206 v SGC-7901 bunky prenesené Mir-ctrl alebo syntetických napodobňuje Mir-206, 206mm (*** P < 0,0001). (B) MTT testy pre SGC-7901 buniek transfektovaných s Mir-206 napodobňuje v konečnej koncentrácii 100 nM. Počnúc 24 hodín po transfekciu boli testy bola prečítaná každých 24 hodín počas 5 po sebe nasledujúcich dní. Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SEM z troch nezávislých pokusov. (*** P 0,0001). (C) histogram ukazujúci rozloženie bunkového cyklu z SGC-7901 bunky dočasne prenesené P2GM-MIR-206 alebo P2GM-ctrl (100 nM). Výsledky predstavujú priemer ± SEM z troch nezávislých experimentov (* p 0,05). (D) Bunky Pozitívne sfarbenie na annexin V-FITC a PI negatívne na 48 hodín po transfekciu boli považované prešli apoptózu. (E) Priemerná miera apoptotické troch nezávislých experimentov ± SEM sú zobrazené (*** p 0,0001).
MIR-206 inhibuje rast rakovinových buniek žalúdočnej a xenografe tumoru tvorbu závislých na ukotvenie
skúmať v dlhodobom horizonte vplyv Mir-206 na rast buniek a tvorbu kolónií, generované sme stabilné línie SGC-7901 bunky, P2GM-MIR-206, ktorá exprimuje MIR-206 z konštitutívne aktívnej vektora, MSCV-P2GM, a rad prázdnym vektorom -carrying bunky, P2GM-miRctrl. Najprv sme skúmali hladinu expresie Mir-206 v týchto dvoch stabilných bunkových línií a zistil, že mier-206 bola výrazne zvýšená u P2GM-MIR-206 stabilný bunkové línie (obrázok 3A). Potom sme analyzovali vplyv Mir-206 na rast závislých na ukotvenie podľa riedko naočkovaní trypsinizovaných buniek priamo do Petriho misky a vizualizáciu bunkovej kolónie farbením s kryštalickou violeťou nasledujúcich 14 dňoch kultivácie. Výsledky ukázali, že sa vektor nesúci kontrolný stabilné bunky tvorili významne viac kolónií, ako sú MIR-206-exprimujúcich bunkách (Obrázok 3B a C). Ďalej injekčne týchto stabilných buniek podkožne do dvoch bilaterálnych dolných chrbta u nahých myší, a sledovať rast nádoru denne. Dvadsať štyri dni po injekcii, tieto myši boli usmrtené a nádory boli vybraté a zvážené (obrázok 3D a E). Výsledky ukázali, že priemerné objemy MIR-206-zvýšene exprimujúcich nádorov rástli oveľa pomalšie ako kontrolná nádory a priemernej konečnej hmotnosti je podstatne menší ako kontroly (obrázok 3F a G). Obrázok 3 MIR-206 potláča závislých na ukotvenie, GC buniek rásť a xenoštěpem tvorbu nádorov. (A) hladina expresie MIR-206 v P2GM-MIR-206 stabilný bunkové línie a kontrolnej stabilných buniek vektor nesúci (*** p 0,0001). (B) Tisíc stabilný SGC-7901 bunky MIR-206 a negatívna kontrola boli nanesené na 6-jamkové doštičky a testom tvorby kolónií vykonané. Reprezentatívne výsledky tvorby kolónií P2GM-MIR-control, P2GM-MIR-206. (C) Počet kolónií bolo počítané na 14. deň po naočkovaní. Stabilné SGC-7901 bunky MIR-206 vzrástol na nižšiu hustotu v porovnaní s NC. Výsledky predstavujú priemer ± SEM z troch nezávislých experimentov (** P 0,01). (D) SGC-7901 bunky so stabilnou expresie MIR-206, alebo nie boli vrúbľovať subkutánne do oboch bokov holých myší (n = 5 na skupinu). sú zobrazené reprezentatívne fotografie u nahých myší 24 dní po inokulácii. (E) Myši boli usmrtené a nádory boli odvážené 24 dní po inokulácii sa xenoimplantáty s Mir-206 nadmernou expresiou boli výrazne menšie ako kontrolné xenoimplantátů. (F) ukazuje krivku rastu nádoru (* P menšie ako 0,05 a ** P 0,01). (G) Nádory z každej skupiny boli vážené ihneď po vybratí. Priemerná hmotnosť nádoru je uvedená ako priemer ± SEM (* p 0,05).
MIR-206 inhibuje žalúdočné rakovina invázie buniek a migráciu
Znížená expresia Mir-206 v lokálne invazívne a metastatické nádory (tabuľka 1) naznačuje, že microRNA môže regulovať bunkový migračný proces. Ak chcete zistiť, či tomu tak skutočne je to tak, sme vykonali hojenie rán a transjamkových migračné testy pomocou MIR-206 exprimujúce stabilný SGC-7901 bunky. Výsledky ukázali, že ektopická nadmerná expresia MIR-206 spôsobilo potlačenie bunkovej migrácie v SGC-7901 buniek, ako je evidentná v teste hojení rán (obrázok 4A a B) a migráciu buniek Transwell testu (obrázok 4C a D). Ektopická nadmerná expresia MIR-206 ďalej inhiboval invázie buniek SGC-7901, ako dokladá test invázie Matrigel (obr 4E a F). Z tohto dôvodu, MIR-206 vykazovali potláčajúci nehnuteľnosť v migrácii a invázii rakovinových buniek testoch in vitro. Obrázok 4 MIR-206 potláča GC bunkovú migráciu a inváziu in vitro. (A) Test hojenie rán ukázali rôzne bunkové motilities v MIR-riadenie, mier-206 buniek. Mimomaternicové expresie MIR-206 evidentne inhibuje migráciu SGC-7901 buniek. (B) zobrazuje štatistické výsledky. Dáta predstavujú priemer ± SEM z troch nezávislých experimentov. (** P 0,01). Nadmerná expresia MIR-206 vážne narušená schopnosťou pohybu buniek (C) a invázie (E) v MIR-206 exprimujúcich stabilný SGC-7901 buniek v porovnaní s negatívnou kontrolou. (D, F) ukazuje štatistické výsledky, resp. Dáta predstavujú priemer ± SEM z troch nezávislých experimentov. (** P < 0,01, *** p 0,0001).
MIR-206 inhibuje pečeňové metastázy GC in vivo
Pre skúmanie účinku Mir-206 na metastáz in vivo, vykonali sme chvost -vein injekcie P2GM-MIR-206 a vektor samotný P2GM buniek nahých myší do 42 dní po injekcii, sme sa zožne a vyfotografoval pečeň (obrázok 5A, horná panely). H &E farbenie tkanivových rezoch je uvedené 7-násobne menší počet metastatických nádorových uzlíkov na jednotku plochy v pečeni injektovaných P2GM-MIR-206 buniek, ako sú injikované P2GM kontrolných buniek (obrázok 5A, spodné panely A a B). Navyše veľkosť nádorových uzlíkov v bunkových vstrekovaním pečene P2GM-MIR-206 boli oveľa menšie ako u kontrolnej skupiny (Obrázok 5A). Tento výsledok silne uvádza, že mier-206 za normálnych okolností môžu mať tumor supresorové úlohu zabraňujúci metastázovaniu buniek karcinómu žalúdka. Obrázok 5 MIR-206 inhibuje pečeňové metastázy GC in vivo. (A) Zástupca makroskopické obrazy pečene myší do 42 dní po naočkovaní (Horný). Reprezentatívne fotografie z H &E zafarbia spontánnych metastáz v pečeni. Zväčšenie: 10 × (dolný). Výsledky ukazujú, že nádorové uzlíky v skupine P2GM-MIR-206 boli menšie a menej v porovnaní s kontrolnou skupinou. (B) Počty pečene metastatického loci boli spočítané a porovnané medzi myšou nesúcich SGC-7901 pre riadenie vektora bunky a SGC-7901 bunky exprimujúce MIR-206. Dáta predstavujú priemer ± SEM, (*** p 0,0001). (C) Relatívna hladiny mRNA domnelých cieľov MIR-206 medzi SGC-7901-MIR-P2GM a SGC-7901-MIR-206 buniek. (D) Relatívna úroveň mRNA domnelých cieľov MIR-206 medzi GES-1 a SGC-7901 bunkových línií.
Pre stanovenie mechanizmus, ktorým MIR-206 uplatňuje svoj anti-metastatické úlohu, sme hľadali možné spätných 206 cieľových génov pomocou kombinácie on-line obstarávacích microRNA cieľ nástrojov a krížové odkazy výsledných kandidátov na tie, ktoré boli hlásené hrať úlohu v metastáz. V kaluži 20 takých génov, sme zistili, 9 z nich (Ďalší súbor 3: Tabuľka S1), a to STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF a K-ras, boli drasticky down-regulované o Mir-206 v P2GM-MIR-206 stabilných buniek, v porovnaní s ich úrovňou v P2GM vektora stabilné bunky (obrázok 5c). Niektoré z týchto cieľových génov MIR-206 boli významne up-regulované v rodičovských SCG-7901 GC nádorových buniek v porovnaní s normálnymi žalúdočnej GES-1 buniek (obrázok 5D), čo ukazuje na pravdepodobný kauzálne udalosť. Tak, mier-206 pravdepodobne inhibuje metastázovaniu GC nádorových buniek prostredníctvom siete regulačných génov.
Diskusia
Hoci dysregulácia miRNA bola hlásená u rôznych typov ľudských nádorov [19] odchylnú expresiou a potenciálnu úlohu miRNA v karcinómov žalúdka boli understudied. Tu sme dokázať, že mier-206 je často downregulated v ľudských karcinómov žalúdka a nádorových bunkových línií. S ohľadom na zníženie expresie Mir-206 hlásené v niekoľkých typov nádorov, naše výsledky naznačujú, že zníženie expresie MIR-206 je pravdepodobne predpokladom udalosť v vzniku nádorov. Táto požiadavka bola ešte viac dôležité, keď sme zistili, že nízke hladiny MIR-206 boli významne spojené s lymfatické metastázy, miestne invázie a TNM fáze. Táto predstava bola potvrdzujú aj výsledky ektopickej expresie MIR-206 pri liečbe rakoviny GC bunkové línie SCG-7901, ktoré ukázali, že mier-206 potlačená proliferácie GC buniek, tvorbu kolónií, inváziu a migráciu. Napokon, schopnosť Mir-206 na potlačenie metastáz SCG-7901 buniek do pečene poskytuje jasné vysvetlenie pre koreláciu medzi nízkou úrovňou Mir-206 a invazívne a metastatické rakoviny žalúdka. V poslednej dobe STC2 bol identifikovaný ako prediktívne marker pre lymfatických uzlín v pažeráku karcinómu dlaždicových buniek [20]. Expresie trkB a BDNF je spojená so zlou prognózou u pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc [21]. Niektoré štúdie uvádzajú, že IGF1R expresia je zvýšená u metastatického karcinómu prostaty a progresie hormón odporu [22, 23]. BCL2 expresie v primárnej rakoviny prostaty je marker pre zlou prognózou, so zvýšeným rizikom recidívy [24]. Čo je povedané vyššie, že navrhne spoločný onkogénne úlohu v ľudskej rakoviny. Ďalej sme identifikovali STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, bcl2, BDNF a K-RAS ako domnelé funkčné ciele Mir-206, pretože časť z nich hovorilo vyššie. Celkovo vzaté, naše výsledky naznačujú tumor supresorové úlohu Mir-206 v ľudskej rakovine žalúdka
Preukazovanie MIR-206 ako rastový nádorový supresor bola označená v niekoľkých druhov rakoviny :. MIR-206 bol najprv zistené, že v downregulated ERalpha -pozitívnych ľudskej rakoviny prsníka tkaniva a zavedenie Mir-206 v MCF-7 bunkách rakoviny prsníka závislej od estrogénu, inhibuje rast buniek od dávky a je závislý na čase [25]. Okrem toho, mier-206 by mohol podporiť Myogénne diferenciácie a blok nádorový rast xenografted myšou downregulating produkt MET protoonkogenu: Met tyrozín-kinázy receptora [26]. Yan tiež zistili, že inhibícia MIR-206 funkcia by mohla prispieť k aberantne bunkovej proliferácie a migrácie, čo vedie k rozvoju rabdomyosarkom potlačením c-Met [16]. Medzitým MIR-206 by mohli byť použité na inhibíciu migrácie buniek Hela a tvorbu ložísk tým, že inhibuje ako Notch3 proteín a mRNA [27]. Okrem toho, mier-206 bol downregulated vo vysokom metastáz rakoviny pľúc v porovnaní s nízkymi metastáz nádorov a normálne pľúcnom tkanive, nadmerné expresie MIR-206 inhibuje migráciu a inváziu buniek pľúcneho karcinómu [18]. MIR-206 expresia znížená estrogén receptor-a (ERA) pozitívna endometria endometrioid adenokarcinóm (EHS) a jeho nadmerné expresiu inhibuje ERA-dependentný proliferáciu, poruchy invazívnosti a indukované zastavenie bunkového cyklu vo ERA-pozitívnych bunkových línií EHS [28]. Všetky tieto nálezy ukázali, že mier-206 môže hrať tumor supresorové úlohu v rôznych druhov rakoviny.
Metastázy prispieva k väčšine úmrtí na rakovinu súvisiace. GC radí ako druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu v súvislosti s celosvetovou pretože jeho vysoká miera metastáz, vrátane lymfatických uzlín, pobrušnice, pečene atď Zvlášť 5-ročné prežitie žalúdočného nádoru s metastázami do pečene nepresahuje 10% a medián prežitia bez akejkoľvek liečby je asi 3 až 5 mesiacov [29]. Viac gény hrajú kľúčovú úlohu v GC metastáz: ako je napríklad nadmerná expresia inzulínu podobný rastový faktor-I receptora (IGF-IR), a aktivácia signalizačných dráh jeho obaja hrajú kľúčovú úlohu v rozvoji a progresii karcinómu žalúdka. Klepanie dole SPL expresie malú inhibičnú RNA vedie k zníženiu IGFIR expresie a oslabené rast a metastázovaniu buniek karcinómu žalúdka [30], inak, IGF1R možno downregulated pomocou Mir-7 a výrazne zníženou migráciu GC buniek a inváziu [31]. Adachi zistené, že blokáda IGF-IR sa zúčastňuje na potláčanie nádorových buniek invázia cez downregulace Matrilysin [32]. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Endoteliálny lipázy proteín je sľubná močový biomarker pre diagnostiku žalúdočného cancer
• Význam Decoy receptora 3 (Dcr3) a vonkajším signálom regulovaná kináza 1/2 (Erk1 /2) v žalúdočnej cancer