MicroRNA-206 slopina skrandžio vėžio ląstelių augimą ir metastazes

MicroRNA-206 slopina skrandžio vėžio ląstelių augimą ir metastazes
tezės
Skrandžio vėžys yra viena iš pagrindinių priežasčių visame pasaulyje vėžys mirtis ir atlieka didelį greitį metastazavusiu rizika. Be kitų baltymų kodavimo onkogenų bei navikų slopintuvas genų, mikro RNR vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio tumorogeniškas progresavimą. Čia, mes rodo, kad miR-206 ekspresuojamas žymiai žemo lygio A skrandžio navikų kohortos, palyginti su savo atitikimo normaliuose audiniuose, ir į skrandžio vėžio ląstelių linijų skaičius. Žemyn reguliavimo PPN-206 buvo ypač reikšmingas auglių su limfinės metastazių, vietine invazijos, ir pažangių TNM sustojimo. Manome, kad priversti išraiška miR-206 slopino platinimu, kolonijų formavimosi ir svetimo tumorigenezei iš SCG-7901 ląstelių, iš skrandžio vėžio ląstelių liniją. Priversti išraiška miR-206 taip pat mažina SCG-7901 ląstelių migraciją ir invazija, taip pat metastazių ląstelių kultūroje arba uodegos venų suleistų pelės modeliai, atitinkamai. Anti-metastazavusiu poveikis miR-206 yra tikėtina, tarpininkaujant nukreipiant metastazių reguliavimo genus STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2 NT-ir K-RAS, kurie buvo drastiškai žemyn reguliuoja stabilios išraiška egzogeninės miR -206 į SCG-7901 ląstelių. Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad Pasaulis-206 yra navikas slopintuvas skrandžio vėžio, veikiantis ne žingsniais, kurie reguliuoja metastazes.
Raktiniai žodžiai
Skrandžio vėžys Pasaulis-206 Metastazė Naviko slopintuvas Įžanga
Skrandžio vėžys (GC) užima ketvirtoji dažniausia vėžio ir antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirties visame pasaulyje [1]. Pacientams, sergantys išplitusiu skrandžio vėžiu prognozė yra prasta, nepaisant pastaraisiais patobulinimų gastriectomy, chemoterapija ir radioterapija [2]. Nuo GC yra Polygenic liga, atsiradusi kaip daugelio genų dysregulations rezultatas, išaiškinimas reguliavimo tinklą, reglamentuojančių GC tumorigenezei yra būtinas kurti naujus tikslinės terapijos.
Tumorigenesis skrandyje yra daugiapakopį procesą, kad sukelia genetinius ir epigenetinius pakeitimus baltymų -coding taip pat ne kodavimo prokalbės onkogenų bei navikų slopinančias genus. Sąveika tarp priimančiosios, aplinkos ir bakterinių veiksnių taip pat turi įtakos ligos eigą. Helicobacter pylori
(AG) infekcija buvo įsteigta kaip pagrindinis rizikos veiksnys GC; du histologiniai potipių skrandžio vėžio, žarnyno ir pasklidųjų potipių, yra abi susijusios su HP infekcijos, kuris prisideda prie daugiau nei 80% atvejų [3], ypač antralinių /kūno skrandžio vėžio [4]. Mechaniškai HP infekcija buvo nustatyta, kad sukelti dvejopą padidinti EGF ir EGFR skrandžio antralinių biopsijos audiniuose, tačiau jo likvidavimas sumažina abiejų veiksnių lygius tiems iš [5] kontrolę. HP infekcija pacientams, sergantiems lėtiniu gastritas yra taip pat reikšmingai susijęs su down-regulation E-cad dėl padidėjusio promotoriaus metilinimo [6], kadangi likvidavimo HP žymiai sumažino MMP-9 lygio, metaloproteinazės teigiamai susijęs su naviko invazija ir metastazių [ ,,,0],7], į antralinėje dalyje ir corpus gleivinės [8].
Be to į HP infekcijos, yra daug priežasčių, dėl kurių nukrypusiu nuo normos genų ekspresiją skrandžio vėžio daugybė ir skrandžio vėžio metastazių mechanizmas yra labai sudėtinga, taip pat , Ras-priklauso MAPK signalizacijos, kuris galiausiai veda prie didesnio proliferacija, skrandžio vėžio ir yra daugiausia sukelia aberaciją K-RAS aktyvavimo, dažnai yra susijęs su žarnyno tipo skrandžio vėžio [9]. Stanniocalcin 2 (STC2) A išskiriami glikoproteinas, svarbias funkcijas kalcio ir fosfatų homeostazės, buvo pranešta, kad būti išreikštas aukšto lygio vėžinės skrandžio audinių, limfmazgių metastazės ir venų invazija [10]. 5 metų išgyvenamumas buvo žymiai mažesnis pacientams, sergantiems STC2 išraiška lyginant su pacientais, be STC2 išraiška [11]. NT-(Brain kilęs neutrophic faktorius) išraiška buvo pranešta parodyti žymiai padidėjo išraiška skrandžio vėžio audinyje lyginant su gretimuose normaliuose gleivinę, ir aukšto lygio BDNF tuo invazinės priekyje buvo susijęs su laivo invazija, limfmazgių metastazių, pilvaplėvės sklaidos ir vargšų prognozė skrandžio vėžiu sergančių pacientų [12]. Nepaisant nustatyti pirmiau reguliavimo genus pažangą, tikslų pagrindinis mechanizmas sukelia GC metastazės dar reikia nustatyti.
Dysregulations apie mikro RNR vaidina labai svarbų vaidmenį Tumorigenesis. Iš mikro RNR vaidmuo skrandžio vėžio Tumorigenesis buvo gerai dokumentuota. Čia, mes orientuojamės į miR-206, kuri kartu su savo glaudžiai susijusių paralogs Pasaulis-1, 133a ir Pasaulis-133B, vaidina labai svarbų vaidmenį raumenų diferenciacija. Šie keturi mikro RNR yra labai užkonservuoti iš eilės ir genomo organizacija, ir yra vadinami myomiRs nes buvo nustatyta, kad išreiškė ne aukšto lygio raumenyse [13]. MIR-1-1 /Pasaulis-133a-2, PPN-1-2 /Pasaulis-133a-1, o Pasaulis-206 /Pasaulis-133B forma klasteriai trimis skirtingais chromosomų regionus žmogaus genomo 20q13.33, 18q11.2 , ir 6p12.2, atitinkamai. Tačiau, šie miRNAs gali veikti kaip naviko slopintuvai įvairiose žmogaus vėžio [14]; Pavyzdžiui Pasaulis-1 ir Pasaulis-133a, buvo nustatyta, kad dažnai žemyn reguliuojama šlapimo pūslės vėžio ir nuslopinti naviko augimą nukreipiant TAGLN2 [15]. Mir-1 ir Pasaulis-206 buvo įrodyta, kad turėti panašius naviku slopinančias vaidmenis rabdomiosarkoma per blokuoja c-met išraišką [16]. MiR-206 taip pat buvo pranešė, kad veikti kaip naviko-slopintuvas krūties vėžio [17], ir plaučių vėžio [18]. Mes pranešti, kad čia Pasaulis-206 išraiška yra atvirkščiai susijęs su limfinės metastazių, vietine invazijos, ir TNM piktybinių navikų sustojimo GC, ir priversti išraišką PPN-206 slopina GC ląstelių augimą, Tumorigenesis ir metastazės.
Medžiagos ir metodai
audinių mėginiai
Chirurginis rezekcijos žmogaus skrandžio vėžiu ir gretimų ne navikų audiniuose, buvo gauti iš 35 gydomų pacientų iš virškinimo trakto chirurgijos departamento dukterinė ligoninės Nanjing medicinos universiteto (Changzhou antrasis Liaudies ligoninė). Projektas buvo patvirtintas mokslinių tyrimų etikos komiteto Nanjing medicinos universiteto, o rašytinis sutikimas buvo gautas iš kiekvieno paciento Šiame tyrime dalyvavo. Visi audinio mėginiai buvo tvarkomi saugojimo skystame azote ir H &. El dažymo ir patologinės analizės
Mobilaus ryšio linijų ir ląstelių kultūros
žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas SGC-7901, BGC-823, AGS, nepiktybinis skrandžio ląstelių line GES-1 ir HEK293T ląstelės buvo perkami iš cell išteklių centro, Šanchajus instituto Biochemijos ir ląstelių biologijos, Kinijos mokslų akademija. Šios ląstelės ir buvo išlaikytos drėgmės inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje, 5% CO 2 ir SGC-7901, BGC-823, ir GES-1 ląstelės buvo auginamos RPMI1640 terpėje, HEK293T ląstelių DMEM, ir AGS ląstelės F12K vidutinės, atitinkamai. Visi Kultūrų terpės buvo papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo ir antibiotikų.
RNR gavybos ir kiekybinė realaus laiko PGR
viso RNR iš skrandžio audinių ar ląstelių linijos buvo paimti naudojant Trizol reagento (TAKARA) pagal gamintojo instrukcijas. kDNR buvo susintetintas su PrimeScript RT reagentų rinkinys (TAKARA). Kiekybinė PGR buvo atliekama su SYBR Pašaro ex Taq Kit (TAKARA) dėl 7500 realaus laiko PGR sistema (ABI) ir analizuojami su SDS analizė programinės įrangos paketo (versija 2.0.1, Applied Biosystems). PGR pradmenys buvo gauti iš Invitrogen, ir reakcija buvo 95 ° C, 10 min, po to 40 ciklų 95 ° C 15 sekundžių ir 60 ° C, 1 min. U6 snRNA buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Rezultatai buvo pateikti kaip kartų kaita, apskaičiuojamas taikant 2 -. △ CT būdą, išraiškos santykis navikų, palyginti su sveikų audinių mažiau nei 1,0 buvo laikomas žemu
Vektorius konstruoja
Pri -miR-206 buvo papildytas įprasto žmogaus genomo DNR PGR naudojant pradmenis: 206-už 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 "ir 206-REV 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3". PGR fragmentas buvo įtraukta į MSCV-P2GM vektoriaus generuoti P2GM-mir-206. Tuščia P2GM vektorius buvo naudojamas kaip kontroliuoti.
Mobilusis transfekcijq
plazmidžių transfekavimas SGC-7901 ląstelių buvo atliekami naudojant lipofectamine 2000 (INVITROGEN) ir stabilios klonai, vežantys P2GM-mir-206 arba tuščią vektorių buvo atrinkti už puromicino atsparumo (10 mikrogramų /ml). MIR-206 ir neigiami kontroliniai imituoja buvo gauti iš Ribobio (Guangzhou, Kinija) ir transfekciją imituoja į SGC-7901 ląstelių buvo padaryta naudojant Oligofectamine (Invitrogen). Trumpai tariant, Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių padengtą iš 1 diena anksčiau buvo pernešta su 100 nm PPN-206 ar kontrolės imituoja ne pasiekti 50% santakoje. Po to, kai 48 h, ląstelės buvo neparuoštų tolesnei analizei.
Mobilusis proliferacijos tyrimu
MTT buvo naudojamas įvertinti proliferacinį normą SGC-7901 ląstelių. Trumpai tariant, Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelės buvo trypsinzed 2 dienas po transfekciją ir išpikuojami 2,5 × 10 3 ląstelės per gerai į 96-duobučių lėkštelėse. MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil-tetrazoliumbromide) buvo įtraukta į auginimo terpę nustatytais laiko tarpais xx val, ir esant 490 nm bangos ilgiui, absorbcija, buvo matuojamas spektrofotometru. Kiekvienas tyrimas buvo atliktas trimis egzemplioriais ir kartojamas tris kartus savarankiškai.
Colony formavimo tyrimą
Stable ĮV-7901 ląstelių, vežančių Pasaulis-206 arba tuščias kontrolė buvo tripsinizuojamos ir replated ne 1 × 10 3 už gerai 6 -well plokštės. Po 14 dienų kultūrą į RPMI1640 papildyti su 10% FBS, kolonijos buvo nustatytos su 3,7% metanolio ir tamsintas su 0,1% violetinei. pelnė kolonijos, kurių sudėtyje yra ne mažiau kaip 50 ląstelių. Kiekvienas tyrimas buvo atliktas trimis egzemplioriais.
Tėkmės citometrijos
SGC-7901 ląstelių transfektuotose Pasaulis-206 mimika ar neigiamos kontrolės buvo tripsinizuojamos ir resuspenduota 1 × privalomu buferyje 1 × 10 6 ląstelių /ml. 100 mikrol Šio ląstelių suspensijos buvo inkubuojami su 5 l FITC aneksinu ir 5 mikrol propridium jodido (PI) 15 minučių tamsoje. Reakcija buvo nutrauktas su 400 mikrol, 1 × privalomą buferio to ir analizuojami su (FACSCalibur naudojant CellQuest programinę įrangą ( "Becton Dickinson). FITC-prie aneksino V-teigiamų ir PI-neigiamas ląstelės buvo laikomi aprotoninis ir eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais.
migracijos ir invazija tyrimai
žaizdų gijimą ląstelių migraciją buvo įvertintas matuojant ląstelių judėjimą į neląstelinės erdvės, sukurtos grandymo susiliejantis mobilųjį veją su 200 iL pipetės galiuko. žaizda uždarymas buvo fotografuotas 48 val vėliau po mikroskopu. dėl transwell migracijos tyrimų, 5 × 10 4 ląstelės buvo pridėta į viršutinio kameroje intarpo (BD mokslo, kibirkščių, MD, JAV), tuo tarpu 1 × 10 5 ląstelės buvo naudojamas Matrigel invazijos analizei. Be šių eksperimentų, ląstelės buvo prieš pasėjamos prie viršutinės kameros tripsinizuojamos ir resuspenduojamos terpėje serumo neturinčioje. 10% FBS buvo pridėta į apatinę kamerą visas kultūra terpėje, turinčioje. Ląstelės buvo inkubuojami temperatūroje drėgnoje inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje 24 val. Ląstelės membranoje buvo nustatyti, nudažomi, ir suskaičiuoti. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais.
Ksenografiniuose auglio modelio
merginų athymic nuogas peles (6 savaičių) buvo nupirkta iš pavyzdiniame gyvūnų tyrimų centro Nankino universitete. Maždaug 1,5 × 10 6 stabilios SGC-7901 ląstelių vežantys P2GM-mir-206 arba tuščias vektorius buvo švirkščiamas į poodį į apatines kraštais 5 nuogas pelių. Naviko apimtys buvo matuojamas kas 3 dienas nuo šeštos dienos po injekcijos į priekį 24 dienų iki gyvūnai buvo paaukota. Galutinis tūris ir svoris buvo matuojamas po to, kai navikai buvo išpjaunamas. Nude pelėms buvo manipuliuojama ir slaugomi pagal NIH gyvūnų globos ir vaistų komiteto gaires eksperimente Gyvūnų centras Nanjing medicinos universiteto (Nanjing, Jiangsu, Province, Kinija).
Statistinė analizė
Statistinė analizė atlikta naudojant SPSS programinės įrangos paketas (SPSS Standartinę versiją 16,0 SPSS Inc "). Duomenys buvo parodyta, kaip vidurkis ± SEM. Suporuotų-mėginiai T
-test buvo naudojamas diferencinę Pasaulis-206 išraiškos tarp naviko ir normalių audinių analizę. In vitro ir in vivo, nepriklausomi-mėginiai T
-test buvo naudojamas vertinant skirtumą tarp tiriamosios ir kontrolinės grupių reikšmę. P-vertė < 0,05 buvo laikomi statistiškai reikšmingas.
Rezultatai
Down reguliavimo PPN-206 koreliuoja su žmogaus skrandžio vėžio Tumorigenesis, invazijos, ir metastazes
genomo plataus tyrimo dėl MicroRNA išraiška, mes anksčiau nustatė keletą narius myomiR šeima, ty Pasaulis-1 /133a ir Pasaulis-133B /206, kurio kraujyje buvo sumažintos neuroectodermic vėžio (neskelbtų rezultatų). Šie mikro RNR pirmiausia buvo žinoma, kad veikia myogenic diferenciacijos ir mažesniu laipsniu, pediatrinių vėžio Tumorigenesis. Ištirti, ar šie myomiRs taip pat gali turėti vaidmenį bendrų vėžio suaugusiųjų tumorigensis, mes išanalizavome jų raiškos lygį realaus laiko kamieninių kilpa RT PGR kiekybinio į šviežiai rezekcijos skrandžio navikų kohortos ir jų atitikimo normalius audinius ir Nustatyta, kad vidutinis santykis miR-206, palyginti su U6 snRNA iš 35 navikų buvo 4-kartų mažesnė nei, kad iš normaliuose audiniuose (1A pav). Pora-protingas palyginimas parodė, kad daugiau nei 85% navikų parodė daugiau nei 2 kartus sumažinti Pasaulis-206 raiškos, palyginti su jų atitikimo kontrolę, tik su dviem poromis, rodančių padidėjimas (1B pav.) Išraiška miR-206 taip pat buvo sumažintas į žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų, įskaitant SGC-7901, BGC-823, MGC-803, ir AGS ląstelių skaičius, palyginti su, kad GES-1 normaliomis skrandžio ląstelių (1c pav.) Klinikos įrašai šių navikų parodė, kad Pasaulis-206 raiškos sumažinimas buvo reikšmingai susijęs su limfinės metastazių, vietine invazijos, ir TNM piktybinių navikų sustojimo, bet ne su amžiumi, lytimi, naviko dydžio ar vietos (1 lentelė). Šie duomenys leidžia manyti, kad Pasaulis-206 paprastai gali daryti slopinančiu kontrolę skrandžio Tumorigenesis, invazijos ir metastazių. 1 pav sumažinta lygiai PPN-206 raiškos skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų. (A), pasiskirstymas Pasaulis-206 išraiškos per 35 žmogaus GC ir noncancerous audinių kohortos atliekant KRL-PGR. Endogeninis U6 RNR buvo naudojamas kaip vidinis kontrolės. (B), Pairwise palyginimas Pasaulis-206 išraiškos tarp GC ir derinimas nevėžinės audinių, kuriame Pasaulis-206 išraiška buvo sumažintas 86% (30/35) bandinio poromis. (C) Santykinis išraiška miR-206 į keturias GC ląstelių linijų ir normalus skrandžio ląstelių linijos (GES-1).
1 lentelė Clinicopathologic charakteristikos PPN-206
Kategorijos
NR. pacientų

Santykiniai lygius PPN-206 (vidurkis ± SEM)
p reikšmė

Lytis
Vyras
21
0,49 ± 0,07
0,32
Moteris
14
0,40 ± 0,06
Amžius (metai)
≥60
19
0,45 ± 0,05
0.93
< 60
16
0,09
0,46 ± Skersmuo (cm)
≥5
13
0,46 ± 0,09
0,90
< 5
22
0,45 ± 0,05
VIETA
Vidurio ir proksimalinės trečioji
23
0,06
0,65
0,47 ± Distalinė trečioji
12
0,07
0,42 ± diferenciacijos laipsnis
gerai ir vidutiniškai
12
0,48 ± 0,07 pervežimas 0,70 pervežimas Prastai
23
0,44 ± 0,07
Vietinis invazija
T1 + T2
10
0,65 ± 0,07
0,01
T3 + T4
25
0,05
0,37 ± limfmazgių metastazių
NE
14
0,57 ± 0,06
0,04
TAIP
21
0,07
0,38 ± TNM stadija
I + II
12
0,60 ± 0,07
0,02
III + IV
23
0,38 ± taip pat buvo nustatyta 0,06
išraiška miR-133a būti žemyn reguliuojama navikų pagal pirmiau nurodytus kriterijus (Papildoma failų 1: S1 paveiksle), bet išraiška miR-1, kurio genai susitelkę su tais kodavimo miR-133a [14], nebuvo (Papildoma failą 2: S2 pav.) Nuo miR-206 yra koduotas unikalų geno, ji buvo pasirinktas tolesnei analizei.
MiR-206 slopina skrandžio vėžio ląstelės augimo
Norint nustatyti, ar miR-206 turi polinkį slopinti skrandžio vėžio tumorigenezei, mes įvesta sintetiniai dvigrandq Pasaulis-206 imituoja, 206mi, pakeisti viso miR-206 lygį SGC-7901 skrandžio vėžio ląsteles, kurios išreiškia žemą lygį Pasaulis-206, lyginant su GSE-1 įprastų kontrolės ląstelių (1c pav) , ir stebėjo, kaip ląstelių augimo rodiklį, naudojant tetrazolio dažų, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromido (MTT). Kamieninių kilpa PGR patvirtino padidėjusi lygį miR-206 transfekuotų SGC-7901 ląstelių (2a pav), ir rezultatai iš MTT nurodyta, kad augimo norma iš šių ląstelių buvo gerokai sumažėjo, palyginti su iš ląstelių, gaunančių Ne konkrečias kontrolės imituoja, PPN-ctrl, daugiau nei 5 dienų laikotarpį (2b pav.) Mes taip pat sukurtas iš anksto Pasaulis-206, išreiškiantį plazmidės į P2GM vektoriaus ir fluorescencijos aktyvuota ląstelių rūšiavimo (FACS) analizė parodė, kad ilgai G1 fazėje ir sutrumpintą S-etapas P2GM-206 (P206) transfekuotos palyginti su P2GM vektorius perkeltų SGC-7901 ląsteles (2c pav), todėl patvirtinančių rezultatą iš aukščiau 206mi mnemo eksperimentą. Dirbtinai didinant bendrą lygį PPN-206 su 206 Mi pat lėmė gerokai padidinti apoptozę 48 val į SGC-7901 ląstelių per kontrolės imituoja perkeltų ląstelių, kaip nustatyta tekmės citometrijos analizės PI ir aneksinu dvigubo įsisavinimą (2d pav ir E). Šie duomenys rodo, kad miR-206 yra stiprus antiproliferacinis reguliatorius auginamų skrandžio vėžio ląsteles. 2 pav Priverstinis išraiška miR-206 slopina SGC-7901 skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją. (A) Iš viso lygiai miR-206, esantys SGC-7901 ląstelių transfekuotos su miR-Ctrl arba sintetinių imituoja miR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) MTT Kiekybinėje SGC-7901 ląstelių, transfekuotų su miR-206 imituoja, kurio galutinė koncentracija 100 nm bangos ilgiui. Nuo 24 h po transfekciją, kad tyrimai buvo perskaitytas per 24 h 5 dienas iš eilės. Rezultatai išreiškiami reiškia ± SEM iš trijų nepriklausomų eksperimentų. (*** P < 0,0001). (C) histograma vaizduoja ląstelės ciklo platinimas SGC-7901 ląstelių laikinai perkeltų su P2GM-Pasaulis-206 arba P2GM-ctrl (100 Nm). Rezultatai atstovauja priemones ± SEM trijų nepriklausomų eksperimentų (* P < 0,05). (D), buvo laikomi Ląstelės Dažymo teigiamas aneksinu-FITC ir neigiamas PI ne 48 h po transfekciją turėti atliktos apoptozę. (E) vidutinis aprotoninis norma trijų nepriklausomų eksperimentų ± SEM rodomi (*** p < 0,0001).
MIR-206 slopina tvirtinimo priklausoma skrandžio vėžio ląstelių augimą ir svetimo auglio susidarymą
išnagrinėti ilgalaikį poveikis miR-206 ląstelių augimui ir kolonijos formavimas, mes generuoja stabilų liniją SGC-7901 ląstelių, P2GM-mir-206, kuris išreiškia MIR-206 iš constitutively aktyvaus vektorių, MSCV-P2GM, ir tuščios vektoriaus linija -carrying ląstelės, P2GM-miRctrl. Pirma, mes išnagrinėjo raiškos lygis PPN-206 šių dviejų stabilių ląstelių linijų ir nustatė, kad Pasaulis-206 buvo smarkiai padidėjusi P2GM-Pasaulis-206 stabili ląstelių linijos (3a pav.) Tada mes išanalizavo PPN-206 poveikį tvirtinimo priklausoma augimo retai Sėjamosios tripsinizuojamos ląstelių tiesiai į Petri lėkštelę ir vizualizuoti ląstelių kolonijų Crystal violetinės dažymo šias 14 dienų kultūrą. Rezultatai parodė, kad užkrato vykdant kontrolės stabilios ląstelės susidaro žymiai daugiau kolonijų nei Mir-206-išreiškiančius ląstelių (3b ir C pav.) Mes taip pat švirkščiama šiuos stabilius ląsteles oda į dvi dvišales apatinių nugarą nuogas pelėmis ir stebėjo naviko augimą kasdien. Dvidešimt-keturias dienas po injekcijos, šie pelės buvo paaukotos ir navikai buvo pašalintų ir pasverti (3D ir E pav). Rezultatai parodė, kad vidutinė apimtis PPN-206-ekspresija navikų augo daug lėčiau nei kontrolės navikų ir vidutinis galutinės svoris buvo žymiai mažesnis nei kontroliniuose (3f ir G pav.) 3 pav MIR-206 slopina tvirtinimo priklausoma GC ląstelių augimą ir svetimo auglio susidarymą. (A) Sąvoka lygis miR-206 P2GM-Pasaulis-206 stabilios ląstelių linijos ir užkrato vykdant kontrolės stabilių ląstelių (*** p < 0,0001). (B) vienas tūkstantis stabilios SGC-7901 ląstelių PPN-206 ir neigiamus kontrolinius buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse ir kolonija formavimas tyrimas atliekamas. Reprezentacinės rezultatai kolonijas formavimo P2GM-miR-kontrolės, P2GM-miR-206. (C) kolonijų skaičius buvo skaičiuojamas nuo 14 dienos po sėjos. Stabilus SGC-7901 ląstelių PPN-206 išaugo iki mažesnio tankio, palyginti su NC. Rezultatai atstovauja priemones ± SEM trijų nepriklausomų eksperimentų (** p < 0,01). (D) SGC-7901 ląstelių, sergantys stabilia išraiškos miR-206, ar ne buvo inokuliuoti po oda į abiejų nuogas pelių kraštais (n = 5 grupėje):. Reprezentacinės nuotraukos nuogas pelių 24 dienų po suleistas rodomi. (E) pelėms buvo nužudyti, o augliai buvo svertinis 24 dienų po skiepijimo, kad ksenoimplantai su Pasaulis-206 raiškos buvo gerokai mažesnis nei kontrolinių audiniuose,. (F) rodo, naviko augimo kreivę (* p < 0,05 ir ** P < 0,01). (G) navikai iš kiekvienos grupės buvo pasverti iš karto po to, kai pašalinimas. Vidutinis naviko masė yra nurodyta, kaip tai ± SEM (* p < 0,05).
MIR-206 slopina skrandžio vėžio ląstelių invaziją ir migracijos
sumažinta išraišką PPN-206 vietiškai invazinių ir metastazavusiu navikų (1 lentelė) rodo, kad ši MicroRNA gali reguliuoti ląstelių migracijos procesą. Norėdami nustatyti, ar tai iš tikrųjų yra, mes atlikome žaizdų gijimą ir transwell migracijos tyrimuose, naudojant Mir-206 ekspresija stabilius SGC-7901 ląsteles. Rezultatai parodė, kad negimdinis raiškos miR-206 sukėlė ląstelių migracijos slopinimą SGC-7901 ląstelių Kaip matyti iš žaizdų gijimo tyrimo (4a pav ir B) ir transwell ląstelių migracijos tyrimą (4c ir D paveikslas). Negimdinis raiškos miR-206 dar slopino SGC-7901 ląstelių invazija kaip rodo Matrigel invazijos metodu (4E ir F pav.) Taigi, PPN-206 rodoma slopinančio turtą vėžio ląstelių migracijos ir invazija tyrimai in vitro. 4 pav MIR-206 slopina GC ląstelių migraciją ir invazija in vitro. (A) žaizdų gijimo tyrimas parodė skirtingą mobiliuosius motilities į miR-kontrolės, PPN-206 ląstelių. Negimdinis išraiška miR-206 akivaizdžiai slopino SGC-7901 ląstelių migraciją. (B) rodo, statistinius rezultatus. Duomenys apima priemones ± SEM trijų nepriklausomų eksperimentų. (** P < 0,01). Per išraiškos PPN-206 itin ribojama gebėjimų ląstelių migraciją (C) ir įsiveržimo (E) miR-206-išreikšti stabilius SGC-7901 ląsteles, lyginant su neigiamos kontrolės. (D, F) rodo, statistinius rezultatus atitinkamai. Duomenys apima priemones ± SEM trijų nepriklausomų eksperimentų. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MiR-206 slopina kepenų metastazių GC in vivo
ištirti, miR-206 poveikį metastazių in vivo, mes atliekamas uodega -vein injekcija P2GM-miR-206 ir vektorinę vien P2GM ląstelių su nuogas pelėmis, 42 dienų po injekcijos, mes nuimami ir fotografavo kepenis (pav 5A, viršutinės plokštės). "H & El dažymo audinių skyriuose nurodyta 7 kartus mažesnį skaičių metastazavusiu vėžinių mazgelių ploto vienetui į kepenis sušvirkšta P2GM-Pasaulis-206 ląstelių nei švirkščiamas su P2GM kontrolinių ląstelių (5a paveiksle, apatinių panelių ir B). Be to, naviko mazgelių į P2GM-Pasaulis-206 ląstelių švirkščiamas kepenis dydžiai buvo gerokai mažesnis nei kontrolinės grupės (5A pav.) Šis rezultatas stipriai teigia, kad Pasaulis-206 paprastai gali turėti auglio slopinamojo vaidmenį užkertant kelią metastazių skrandžio vėžio ląsteles. 5 paveikslas MIR-206 slopina kepenų metastazių GC in vivo. (A), atstovas makroskopinių nuotraukos pelės kepenyse po 42 dienų po skiepijimo, (viršutinė). Reprezentacinės nuotraukos H & El tamsintas spontaniškus metastazes kepenyse. Didinimas: 10 × (mažesnis). Rezultatai rodo, kad naviko mazgelių P2GM-miR-206 grupėje buvo mažesnis ir mažiau, palyginti su kontroline grupe. (B) numeriai kepenų metastazavusiu lokusų buvo skaičiuojami ir lyginami tarp pelių SGC-7901 vektoriaus valdymo ląsteles ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląsteles, reikšti MIR-206. Duomenys atstovauja priemones ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) Santykinis iRNR lygį tariamų tikslų PPN-206 tarp SGC-7901-miR-P2GM ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901-Pasaulis-206 ląstelių. (D) santykinis iRNR lygis tariamų tikslų PPN-206 tarp GES-1 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių linijų.
Norėdami nustatyti mechanizmą, pagal kurį Pasaulis-206 daro savo kovos su metastazavusiu vaidmenį, mes ieškoma įmanoma miR- 206 tikslinių genų, naudojant internetinės MicroRNA taikinių įrankių derinys, ir kryžmines nuorodas gautus kandidatų į tuos, kurie buvo pranešta, kad vaidinti vaidmenį metastazių. Per 20 tokių genų baseinas, mes nustatėme, 9 iš jų (papildomų failų 3: Lentelė S1), ty STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, NT-ir K-RAS, buvo drastiškai žemyn reguliuojama iki miR-206 į P2GM-Pasaulis-206 stabilių ląstelių, palyginti su jų atitinkamų lygmenų P2GM vektoriaus stabilių ląstelių (5c pav). Kai kurie iš šių Pasaulis-206 tikslinių genų buvo ženkliai iki-reguliuojama tėvų SCG-7901 GC vėžinių ląstelių, palyginti su įprastais skrandžio GES-1 ląstelių (5d paveikslas), o tai rodo tikėtiną priežastinį renginį. Taigi, PPN-206 tikėtina slopina metastazes GC vėžinių ląstelių per reguliavimo genų tinklą.
Diskusijos
Nors reguliacijos sutrikimas ir miRNAs buvo pranešta įvairių tipų žmogaus vėžio [19], netipiškoms išraiškos ir galimo vaidmens miRNAs į skrandžio vėžio buvo understudied. Čia mes įrodyti, kad Pasaulis-206 yra dažnai downregulated žmogaus skrandžio vėžio ir vėžio ląstelių linijas. Atsižvelgiant į sumažintą Pasaulis-206 raiškos pranešta keliose tipų navikais, mūsų rezultatai rodo, kad mažinant Pasaulis-206 išraišką tikėtina prielaida renginys Tumorigenesis. Šis reikalavimas buvo dar svarbesnė, kai mes nustatėme, kad mažas PPN-206 buvo reikšmingai susijęs su limfinės metastazių, vietine invazijos ir TNM etape. Ši sąvoka buvo patvirtina apie negimdinio išraiškos PPN-206 GC vėžio ląstelių linijos SCG-7901 rezultatus, kurie parodė, kad Pasaulis-206 represuotųjų GC ląstelių proliferaciją, kolonijų susidarymą, invazija, ir migracija. Galiausiai, miR-206 sugebėjimas slopinti metastazes SCG-7901 ląstelių į kepenis pateikė aiškų paaiškinimą tarp žemo lygio PPN-206 ir invazinių ir metastazavusiu skrandžio vėžio koreliacija. Neseniai STC2 buvo identifikuota kaip prognozavimo žymeklis limfmazgių metastazių į stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma [20]. Išraiška TrkB ir BDNF asocijuojasi su prastos prognozės NSLPV sergantiems pacientams [21]. Keletas tyrimų, pranešė, kad IGF1R išraiška padidėjusi metastazavusiu prostatos vėžiu ir atsparumo hormonų progresavimo [22, 23]. BCL2 išraiška pirminėje prostatos vėžys yra žymeklis prastos prognozės, su padidėjusia rizika pasikartojimo [24]. Kas yra pasakyta rodo bendrą onkogeninio vaidmenį žmogaus vėžio. Toliau mes identifikuoti STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2 NT-ir K-RAS kaip tariamų funkcinių tikslų PPN-206, nes dalis jų buvo kalbėta aukščiau. Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, auglio slopinamojo vaidmenį PPN-206 į žmogiškąjį skrandžio vėžio
Įrodymai PPN-206 kaip naviko augimas slopintuvas buvo pranešta keliose vėžio. Pasaulis-206 buvo nustatytas pirmą kartą bus downregulated į ERalpha -positive žmogaus krūties vėžio audiniuose ir įvedimas miR-206 į estrogenų priklausomas MCF-7 krūties vėžio ląstelių slopina ląstelių augimą nuo dozės ir laiko priklausomu būdu [25]. Be to, PPN-206 galėtų skatinti myogenic diferenciacijos ir blokuoti naviko augimą xenografted pelių downregulating su RER prokalbės onkogeno produktą: met tirozinkinazės receptorių [26]. Jonas taip pat nustatė, kad slopinimas Pasaulis-206 funkcijos gali prisidėti prie netipiškoms ląstelėms platinimu ir migracijos, todėl Rhabdomyosarcoma plėtros slopinimo C-met [16]. Tuo tarpu Pasaulis-206 gali būti naudojamas slopinti HeLa ląstelių migraciją ir sutelkti susidarymą slopina tiek Notch3 baltymų ir iRNR [27]. Be to, PPN-206 buvo downregulated aukštos metastazių plaučių vėžiu, palyginti su mažomis metastazės navikų ir įprastų plaučių audinių, raiškos PPN-206 inhibuoja migracijos ir invazijos į plaučių vėžio ląstelių [18]. MIR-206 išraiška sumažėjo estrogenų receptorių alfa-(ERα) -positive endometriumo endometrioid adenokarcinoma (EEB) ir jos raiškos slopinamas ERα priklausomas platinimu, sutrikę invazinis ir sukeliama ląstelių ciklo areštą ERα užsikrėtusių EEB ląstelių linijų [28]. Visi šie faktai rodo, kad Pasaulis-206 gali atlikti auglio slopinamojo vaidmenį įvairiose vėžio.
Metastazė prisideda prie daugumos vėžio mirčių. GC yra vertinama kaip antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje, nes jo aukštas lygis metastazių, įskaitant limfmazgiuose, pilvaplėvės, kepenų ir tt Ypač 5 metų išgyvenamumas skrandžio naviko su kepenų metastazėmis neviršija 10%, o vidutinis išlikimo be jokio gydymo yra apie 3 iki 5 mėnesių [29]. Keli genai vaidina pagrindinį vaidmenį GC metastazių: pavyzdžiui, insuliną panašaus augimo faktoriaus receptoriaus-I (IGF-IR) raiškos ir jos signalų kelius aktyvacijos tiek žaisti kritinių vaidmenis plėtrą ir progresavimo skrandžio vėžio. Beldžiasi į apačią nuo SPL išraiškos mažą slopinančio RNR lėmė sumažėjęs IGFIR išraišką ir susilpnintų augimą ir metastazes skrandžio vėžio ląstelių [30], nes kitaip IGF1R galima downregulated iki miR-7 ir smarkiai sumažino GC ląstelių migraciją ir invazija [31]. Adachi nustatė, kad blokada IGF-IR dalyvauja vėžio ląstelių invaziją slopinimo per downregulation iš matrilysin [32]. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Endotelio lipazės baltymas yra perspektyvus šlapimo biologinis diagnozuoti skrandžio cancer
• Reikšmė masalui receptorių 3 (Dcr3) ir išorinio signalo reguliuojamas kinazės 1/2 (ERK1 /2) skrandžio vėžys