MicroRNA-206 onderdrukt maag kanker celgroei en metastasis

MicroRNA-206 onderdrukt maag kanker celgroei en metastase
De abstracte Maagkanker is een van de belangrijkste oorzaken van kanker overlijden wereldwijd en draagt ​​een hoge mate van metastatische risico. Naast andere eiwitcoderende oncogenen en tumorsuppressorgenen, microRNA's spelen een belangrijke rol bij maagkanker tumorigene progressie. Hier laten we zien dat miR-206 wordt tot expressie gebracht op lage niveaus aanzienlijk in een cohort van maag tumoren in vergelijking met hun overeenkomende normale weefsels en in een aantal maagkanker cellijnen. Down-regulatie van miR-206 was bijzonder belangrijk in tumoren met lymfatische metastase, lokale invasie en geavanceerde TNM enscenering. We vinden dat gedwongen expressie van miR-206 onderdrukt de proliferatie, kolonie-formatie, en xenograft tumorvorming van SCG-7901 cellen, een lijn van maagkanker cellen. Geforceerde expressie van miR-206 onderdrukte ook SCG-7901 celmigratie en invasie, en metastase in celkweek of staartader geïnjecteerd muismodellen, respectievelijk. De anti-metastatische effect van miR-206 wordt waarschijnlijk gemedieerd door zich te richten metastase regulerende genen STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, sFRP1, BCL2, BDNF, en K-ras, die drastisch waren down-gereguleerd door stabiele expressie van exogeen miR -206 in SCG-7901 cellen. Bij elkaar genomen, onze resultaten geven aan dat miR-206 is een tumor suppressor van maagkanker acteren in de stappen die metastase reguleren.
Sleutelwoorden
Maagkanker miR-206 metastase tumor suppressor Inleiding
Maagkanker (GC) rangschikt de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. De prognose voor patiënten met gevorderde maagkanker slecht Ondanks recente verbeteringen in gastriectomy, chemotherapie en radiotherapie [2]. Omdat GC is een polygene ziekte ontstaan ​​als gevolg van meervoudige genen Disregulatie, opheldering van de regelgevingsnetwerk betreffende GC tumorigenese is noodzakelijk voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën gericht.
Tumorgenese in de maag een meerstaps proces dat genetische en epigenetische veranderingen eiwit inhoudt coderende als niet-coderende proto-oncogenen en tumorsuppressorgenen. Interacties tussen gastheer, milieu en bacteriële factoren beïnvloeden ook de voortgang ziekte. Helicobacter pylori
(HP) infectie is opgericht als een belangrijke risicofactor voor GC; de twee histologische subtypen van maagkanker, de darm en de diffuse subtypen, beide gekoppeld aan HP-infectie, hetgeen bijdraagt ​​aan meer dan 80% van de gevallen [3], met name in antrale /body maagkanker [4]. Mechanistisch werd HP infectie bleek een verdubbeling van EGF EGFR en gastrische biopsie antrale weefsels veroorzaken, maar de uitroeiing vermindert de niveaus van beide factoren aan die van de [5] controles. HP-infectie bij patiënten met chronische gastritis ook significant geassocieerd met down-regulatie van E-cadherine door verhoogde promoter methylatie [6], terwijl uitroeiing HP de niveaus van MMP-9 aanzienlijk verminderd, een metalloproteïnase positief gecorreleerd met tumorinvasie en metastase [ ,,,0],7], in het antrum en corpus mucosa [8].
Naast HP-infectie, is er een veelheid aan oorzaken die leiden tot afwijkende genexpressie bij maagkanker en het mechanisme van maagkanker metastasering is zeer complex en . De Ras-afhankelijke MAPK signalering, wat uiteindelijk leidt tot verhoogde proliferatie bij maagkanker en wordt voornamelijk veroorzaakt door afwijkingen van K-ras activering wordt vaak geassocieerd met de intestinale type maagkanker [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), een afgescheiden glycoproteïne met belangrijke functies aan calcium en fosfaat homeostase, werd gerapporteerd als zijnde uitgedrukt in hoge mate kankerachtige gastrische weefsels, lymfeknoop metastase en invasie veneuze [10]. De 5-jaars overleving was significant lager bij patiënten met STC2 expressie in vergelijking met patiënten zonder STC2 expressie [11]. BDNF (brain-derived neutrophic factor) expressie werd gemeld aanzienlijk verhoogde expressie bij maagkanker weefsel in vergelijking met aangrenzende normale mucosa, en hoge niveaus van BDNF op invasieve voorzijde tonen gecorreleerd naar vat invasie, lymfeknoop metastase, peritoneale verspreiding en slechte prognose bij maagkanker patiënten [12]. Ondanks de vooruitgang in het identificeren bovenstaande regulerende genen, blijft de precieze onderliggende mechanisme waardoor GC metastase nader te bepalen.
Disregulatie van miRNA spelen belangrijke rol in tumorvorming. De rol van microRNA's bij maagkanker ontstaan ​​van tumoren is goed gedocumenteerd. Hier richten we ons op miR-206, die samen met zijn nauw verwant paralogen miR-1, 133a en miR-133b, speelt zeer belangrijke rol in de spier differentiatie. Deze vier microRNA zijn sterk geconserveerd in sequentie en genomische organisatie en worden myomiRs genoemd omdat zij bleken tot expressie op hoog niveau in spieren [13]. MiR-1-1 /miR-133a-2, miR-1-2 /miR-133a-1 en miR-206 /miR-133b vorm clusters in drie verschillende chromosomale gebieden in het menselijk genoom 20q13.33, 18q11.2 en 6p12.2, respectievelijk. Echter, deze miRNAs fungeren als tumor suppressors in verschillende menselijke kankers [14]; bijvoorbeeld miR-1 en miR-133a bleken vaak worden neerwaarts gereguleerd in blaaskanker en onderdrukken tumorgroei doelwit TAGLN2 [15]. MiR-1 en miR-206 bleken vergelijkbaar tumor-suppressor rollen in rhabdomyosarcoom hebben tot het blokkeren van c-Met-expressie [16]. MiR-206 werd ook gemeld om als een tumor-suppressor bij borstkanker [17] en longkanker [18]. Wij rapporteren hier dat miR-206 expressie invers geassocieerd met lymfatische metastase, lokale invasie en het TNM staging maligniteit van GC en de expressie van miR-206 GC kracht onderdrukt celgroei, tumorigenese en metastase.
Materialen en werkwijzen
Tissue monsters
chirurgisch weggesneden menselijke maagkanker en de aangrenzende niet-tumorweefsels werden verkregen van 35 patiënten opgenomen in de afdeling Gastro-intestinale chirurgie, de Affiliated Hospital van Nanjing Medical University (Changzhou Tweede People's Hospital). Het project werd goedgekeurd door de Research Ethics Committee van Nanjing Medical University, en een schriftelijke toestemming werd verkregen van elke patiënt die deelnamen aan deze studie. Alle weefselmonsters werden voor opslag in vloeibare stikstof en H &verwerkt;. E kleuring voor pathologische analyse
Cellijnen en celkweek
menselijke maagkanker cellijnen SGC-7901, BGC-823, AGS, niet-maligne cellen maag lijn GES-1, en HEK293T cellen werden gekocht van de Cell Resource Center, Shanghai Instituut voor Biochemie en celbiologie, de Chinese Academie van Wetenschappen. Deze cellen werden in een vochtige incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 en SGC-7901, BGC-823 en GES-1-cellen werden gekweekt in RPMI1640 medium HEK293T cellen in DMEM en AGS cellen in F12K medium, respectievelijk. Alle kweekmedia werden aangevuld met 10% foetaal runderserum en antibiotica.
RNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR Totaal RNA
aan maag- weefsels of cellijnen werden geëxtraheerd met behulp van Trizol reagens (TaKaRa) volgens de instructies van de fabrikant. cDNA werd gesynthetiseerd met de PrimeScript RT reagenskit (TaKaRa). Kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met Ex Taq SYBR Premix kit (TaKaRa) op 7500 real time PCR systeem (ABI) uitgevoerd en geanalyseerd met SDS-analyse software pakket (versie 2.0.1, Applied Biosystems). PCR-primers werden verkregen van Invitrogen, en de reactie was 95 ° C, 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C en 15 seconden 60 ° C, 1 min. De U6 snRNA werd gebruikt als een interne controle. De resultaten werden gepresenteerd als voudige verandering, berekend volgens de 2 -. △ CT methode en een verhouding van de expressie in tumoren ten opzichte van de normale weefsels minder dan 1,0 werd beschouwd als laag
vectorconstructen
Pri -miR-206 werd geamplificeerd uit normaal humaan genomisch DNA door PCR met primers: 206-For 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'en 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. Het PCR fragment werd ingevoegd in de MSCV-vector P2GM aan P2GM-miR-206 te genereren. De lege P2GM vector werd gebruikt als de controle.
Celtransfectie
Plasmid transfectie van SGC-7901-cellen werden met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) uitgevoerd, en stabiele klonen uitvoeren P2GM-miR-206 of de lege vector werden geselecteerd voor puromycineresistentie (10 ug /ml). MiR-206 en negatieve controle bootst werden verkregen van Ribobio (Guangzhou, China) en transfectie van bootst in SGC-7901 cellen werd gedaan met behulp van Oligofectamine (Invitrogen). In het kort, SGC-7901-cellen uitgestreken 1 dag eerder werden met 100 nm van miR-206 of de controle bootst op het bereiken van 50% samenvloeiing. Na 48 uur werden de cellen verwerkt voor verdere analyse.
Celproliferatie assay
MTT-bepaling werd toegepast om de proliferatieve snelheid van SGC-7901-cellen te schatten. Kort samengevat werden SGC-7901 cellen trypsinzed 2 dagen na transfectie en opnieuw uitgezet bij 2,5 x 10 3 cellen per well in 96-wells platen. MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromide) aan het cultuurmedium toegevoegd op gespecificeerde intervallen xx uur en de absorptie bij 490 nm werd gemeten met een spectrofotometer. Elke test werd uitgevoerd in drievoud en herhaalde driemaal onafhankelijk van elkaar.
Kolonie vorming assay
Stable SCG-7901 cellen die miR-206 of de lege controle werden met trypsine behandeld en opnieuw uitgeplaat bij 1 x 10 3 per putje in 6 -goed platen. Na 14 dagen in kweek in RPMI1640 gesupplementeerd met 10% FBS, werden de kolonies gefixeerd met 3,7% methanol en gekleurd met 0,1% kristalviolet. Kolonies bevattende ten minste 50 cellen werden gescoord. Elke assay werd uitgevoerd in drievoud.
Flowcytometrie
SGC-7901-cellen die met miR-206 nabootsen of negatieve controle werden getrypsiniseerd en opnieuw gesuspendeerd in 1 x bindingsbuffer bij 1 x 10 6 cellen /ml. 100 pi van deze celsuspensie werd geïncubeerd met 5 l van FITC-Annexine V en 5 gl propridium jodide (PI) gedurende 15 minuten in het donker. De reactie werd beëindigd door toevoeging van 400 pi 1 × bindingsbuffer en geanalyseerd (FACSCalibur met de CellQuest software (Becton Dickinson). FITC-Annexine V-positieve en PI-negatieve cellen werden als apoptotisch beschouwd en de experimenten werden uitgevoerd in drievoud.
migratie en invasie assays
wondgenezing celmigratie werd vastgesteld door het meten van de beweging van cellen in een acellulaire ruimte gecreëerd door het afschrapen van het gazon samenvloeiing cel met een 200 ul pipet tip. de wond sluiting werd 48 uur later gefotografeerd onder een microscoop. voor transwell migratie assays, 5 x 10 4 cellen werden toegevoegd in de bovenste kamer van het inzetstuk (BD Science, Sparks, MD, USA), terwijl 1 × 10 5-cellen werden gebruikt voor matrigel invasie assays. in deze experimenten werden de cellen getrypsiniseerd en opnieuw gesuspendeerd in serumvrij medium alvorens te worden geënt op de bovenste kamer. de volledige kweekmedium dat 10% FBS in de onderste kamer toegevoegd. De cellen werden geïncubeerd in een bevochtigde incubator bij 37 ° C gedurende 24 uur. De cellen op het membraan werden gefixeerd, gekleurd en geteld. Elk experiment werd uitgevoerd in drievoud.
Xenograft tumor model
Jonge vrouwelijke athymische naakt muizen (6 weken oud) werden gekocht van de Model Animal Research Center van Nanjing University. Ongeveer 1,5 × 10 6 stabiele SGC-7901 cellen die P2GM-miR-206 of de lege vector werden subcutaan in de onderste flanken van 5 naakt muizen geïnjecteerd. Tumor volumes werden elke 3 dagen vanaf de zesde dag na de injectie verder gemeten 24 dagen voor de dieren opgeofferd. Het uiteindelijke volume en gewicht werden gemeten nadat de tumoren ontleed. Naakt muizen werden gemanipuleerd en verzorgd volgens NIH Animal Care en gebruik Comite richtlijnen op het Experiment Animal Center van de Nanjing Medical University (Nanjing, Jiangsu, provincie, PR China).
Statistische analyse
Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het SPSS softwarepakket (SPSS standaard versie 16.0, SPSS Inc). De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De gepaarde-samples t
-test werd gebruikt bij de analyse van differentiële miR-206 expressie tussen tumor en normale weefsels. In vitro en in vivo experimenten, onafhankelijke monsters
t-test werd gebruikt voor de beoordeling van de significantie van verschillen tussen de behandelings- en controlegroepen. P-waarde < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
stads regulering van miR-206 correleert met menselijke maagkanker ontstaan ​​van tumoren, invasie en metastase
In een genoomwijde onderzoek voor microRNA expressie, we eerder geïdentificeerd verschillende leden van de familie myomiR, namelijk miR-1 /133a en miR-133b /206, waarvan de spiegels werden verlaagd in een neuroectodermic kanker (niet gepubliceerde resultaten). Deze microRNAs werden vooral bekend functioneren in myogene differentiatie en, in mindere mate, de tumorigenese van pediatrische kankers. Te onderzoeken of deze myomiRs ook kan een rol spelen bij de tumorigensis gemeenschappelijke kankers bij volwassenen, onderzochten wij de expressie niveaus van real-time stamlus RT PCR kwantificatie in een cohort van vers uitgesneden maag tumoren en hun overeenkomende normale weefsels en vond dat de gemiddelde verhouding van miR-206 ten opzichte U6 snRNA van de 35 tumoren 4-voudig lager dan die van de normale weefsels (Figuur 1A). Paarsgewijze vergelijking aangegeven dat meer dan 85% van de tumoren vertoonden meer dan 2-voudige reductie van miR-206 expressie vergeleken met hun bijpassende controles, met slechts twee paren blijkt verhogen (Figuur 1B). Expressie van miR-206 werd ook verlaagd in verschillende humane maagkanker cellijnen, waaronder SGC-7901, BGC-823, MGC-803 en AGS-cellen, vergeleken met die in GES-1 normale gastrische cellen (Figuur 1C). Klinisch-pathologische gegevens van deze tumoren toonde aan dat de vermindering van miR-206 expressie was significant geassocieerd met lymfatische metastase, lokale invasie, en de TNM maligniteit enscenering, maar niet met de leeftijd, geslacht, tumorgrootte of de locatie (tabel 1). Deze gegevens impliceren dat miR-206 normaal een remmende controle op de maag ontstaan ​​van tumoren, invasie en metastase kunnen uitoefenen. Figuur 1 Lagere niveaus van miR-206 expressie bij maagkanker weefsels en cellijnen. (A) Verdeling van miR-206 expressie in een cohort van 35 menselijke GC en goedaardige weefsel met qRT-PCR. De endogene U6 RNA werd gebruikt als interne controle. (B) Paarsgewijze vergelijking van miR-206 expressie tussen GC en bijpassende niet-kankerachtige weefsels die miR-206 expressie werd gereduceerd in 86% (30/35) van het monster paren. (C) Relatieve expressie van miR-206 in vier GC cellijnen en een normale maag-cellijn (GES-1).
Tabel 1 Clinicopathologische kenmerken van miR-206
categorieën
NO. van de patiënten
relatieve niveaus van miR-206 (gemiddelde ± SEM)
P-waarde
Geslacht
Man
21
0,49 ± 0,07
0.32
Female
14
0.40 ± 0.06
Leeftijd (jaar)
≥60
19
0.45 ± 0.05
0.93 Restaurant < 60
16
0.46 ± 0.09
Diameter (cm)
≥5
13
0.46 ± 0.09
0,90 Restaurant < 5
22
0,45 ± 0.05
Locatie
Midden en proximale derde
23
0.47 ± 0.06
0.65
distale derde
12
0,42 ± 0,07
mate van differentiatie
goed en matig
12
0.48 ± 0.07
0,70
Slecht
23
0.44 ± 0.07
Lokale invasie
T1 + T2
10 | 0,65 ± 0.07
0,01
T3 + T4
25 | 0,37 ± 0.05
lymfekliermetastasen verhuur No
14
0.57 ± 0.06
0.04
JA
21
0.38 ± 0.07
TNM stadium
I + II
12
0.60 ± 0.07
0.02
III + IV
23
0,38 ± 0,06
expressie van miR-133a werd ook gevonden dat neerwaarts gereguleerd in de tumoren van de bovengenoemde criteria (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1), maar expressie van miR-1, waarvan de genen zijn geclusterd met die coderen miR-133a [14], was niet (Extra file 2: Figuur S2). Aangezien miR-206 wordt gecodeerd door een uniek gen, werd gekozen voor verdere analyse.
MiR-206 remt maag kankercelgroei Belgique Om te bepalen of miR-206 heeft de neiging om maagkanker tumorigenese onderdrukken, introduceerden wij een synthetisch dubbelstrengs miR-206 bootst, 206mi, tot het niveau van totale miR-206 in SGC-7901 maagkanker cellen, die een geringe miR-206 ten opzichte van die van GSE-1 normale controlecellen expressie veranderen (figuur 1C) en bewaakt de snelheid van celgroei met de tetrazolium kleurstof, 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromide (MTT). Stamlus PCR bevestigde de verhoogde niveau van miR-206 in de getransfecteerde SGC-7901-cellen (Figuur 2A) en resultaten van de MTT-bepaling bleek dat de groei van deze cellen sterk is verminderd in vergelijking met die van de cellen waar niet- specifieke controle bootst, miR-ctrl, over een periode van 5 dagen (Figuur 2B). We genereerden ook een pre-miR-206 expressie plasmide in de P2GM vector, en-celsortering fluorescentie geactiveerde analyse (FACS) toonde de verlengde G1-fase en de verkorte S-fase P2GM-206 (P206) getransfecteerd vergeleken de P2GM vector getransfecteerde SGC-7901-cellen (figuur 2C), dus het resultaat bevestigende uit de bovenstaande 206mi mimic experiment. Kunstmatige verhoging van het totale gehalte aan miR-206 met 206 mi ook geleid tot een aanzienlijke toename van apoptose in 48 uur in SGC-7901 cellen via controle bootst getransfecteerde cellen zoals bepaald door flow cytometrische analyse van PI en annexine V dubbele opname (Figuur 2D en E). Deze gegevens aan dat miR-206 is een krachtige anti-proliferatieve regulator van gekweekte cellen maagkanker. Figuur 2 Geforceerde expressie van miR-206 onderdrukt de proliferatie van SGC-7901 maagkanker cellen. (A) Totaal niveau van miR-206 in SGC-7901-cellen die met de miR-ctrl of de synthetische bootst van miR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) MTT assays voor SGC-7901-cellen die met miR-206 bootst in een uiteindelijke concentratie van 100 nM. Vanaf 24 uur na transfectie werd de assays lees elke 24 uur gedurende 5 opeenvolgende dagen. Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. (*** P < 0,0001). (C) Een histogram celcyclusverdeling van SGC-7901-cellen die transiënt getransfecteerd met P2GM-miR-206 of P2GM-ctrl (100 nM). De resultaten vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten (* P < 0,05). (D) Cellen die positief kleuren voor Annexine V-FITC en PI negatief bij 48 uur na transfectie werden geacht ondergaan van apoptose. (E) Gemiddeld apoptotische tarief van drie onafhankelijke experimenten ± SEM worden weergegeven (*** P < 0,0001).
MiR-206 remt verankering-afhankelijke maag kanker celgroei en xenograft tumorvorming Belgique Om op de lange termijn te onderzoeken impact van miR-206 op celgroei en de vorming kolonie, genereerden wij een stabiele lijn van SGC-7901 cellen, P2GM-miR-206, dat miR-206 tot expressie van een constitutief actieve vector, MSCV-P2GM, en een lijn van lege vector -Het cellen, P2GM-miRctrl. Eerst onderzochten we de expressie van miR-206 in deze twee stabiele cellijnen en vonden dat miR-206 werd dramatisch verhoogd in P2GM-miR-206 stabiele cellijn (Figuur 3A). Vervolgens analyseerden we het effect van miR-206 op verankering-afhankelijke groei van spaarzaam zaaien getrypsiniseerd cellen direct op petrischaaltje visualiseren celkolonies door kristalviolet kleuring na 14 dagen kweek. De resultaten toonden aan dat de vector die control stabiel gevormde cellen aanzienlijk meer kolonies dan de miR-206-tot expressie brengende cellen (Figuur 3B en C). We verder ingespoten deze stabiele cellen subcutaan in twee bilaterale lagere rug van naakt muizen, en gecontroleerd tumorgroei dagelijks. Vierentwintig dagen na de injectie werden de muizen gedood en werden de tumoren uitgesneden en gewogen (Figuur 3D en E). De resultaten toonden aan dat de gemiddelde omvang van miR-206-overexpressie tumoren groeiden veel langzamer dan de controle tumoren en de gemiddelde eindgewicht was significant lager dan die van de controles (Figuur 3F en G). Figuur 3 MiR-206 onderdrukt verankering-afhankelijke groei GC cel en xenograft tumorvorming. (A) De expressie niveau van miR-206 in P2GM-miR-206 stabiele cellijn en vector die controle stabiele cellen (*** P < 0,0001). (B) Duizend stabiele SGC-7901 cellen van miR-206 en negatieve controle werden uitgeplaat op 6-putjesplaten en kolonievorming assay uitgevoerd. Representatieve resultaten van de kolonie de vorming van P2GM-miR-control, P2GM-miR-206. (C) Het aantal kolonies werd geteld op de 14e dag na het uitzaaien. Stabiele SGC-7901 cellen van miR-206 groeide uit tot een lagere dichtheid in vergelijking met NC. De resultaten vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten (** P < 0,01). (D) SGC-7901 cellen met stabiele expressie van miR-206 of subcutaan geïnoculeerd in beide flanken van naakt muizen (n = 5 per groep). Representatieve foto's van naakt muizen 24 dagen na enting worden getoond. (E) De muizen werden gedood en de tumoren werden gewogen 24 dagen na inoculatie, van de xenotransplantaten met miR-206 overexpressie significant kleiner dan de controle xenotransplantaten. (F) toont tumorgroei curve (* P < 0,05 en ** P < 0,01). (G) Tumoren van elke groep werden onmiddellijk gewogen na verwijdering. Het gemiddelde tumorgewicht aangeduid als gemiddelden ± SEM (* P < 0,05).
MiR-206 remt maagkanker invasie en migratie
Verminderde expressie van miR-206 in lokaal invasieve en metastatische tumoren (Tabel 1) suggereert dat dit microRNA cel trekkende proces kan reguleren. Om te bepalen of dit inderdaad het geval is, voerden we wondgenezing en transwell migratie testen met behulp van de miR-206 tot expressie stabiele SGC-7901-cellen. De resultaten toonden aan dat ectopische overexpressie van miR-206 veroorzaakte onderdrukking van celmigratie in SGC-7901 cellen zoals blijkt uit de wondgenezing assay (figuur 4A en B) en de transwell celmigratie assay (figuur 4C en D). Ectopische overexpressie van miR-206 verder tegengegaan SGC-7901 celinvasie getuige de Matrigel invasie assay (Figuur 4E en F). Vandaar dat miR-206 vertoonden een onderdrukkende woning in kankercel migratie en invasie assays in vitro. Figuur 4 MiR-206 onderdrukt GC cel migratie en invasie in vitro. (A) De wondgenezende assay toonde andere cel motilities in miR-control, miR-206-cellen. De ectopische expressie van miR-206 duidelijk remde de migratie van SGC-7901-cellen. (B) toont de statistische resultaten. Gegevens stellen het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. (** P < 0,01). Overexpressie van miR-206 ernstig wordt belemmerd capaciteiten van de cel migratie (C) en de invasie (E) in miR-206 tot expressie stabiele SGC-7901-cellen in vergelijking met de negatieve controle. (D, F) toont de statistische resultaten respectievelijk. Gegevens stellen het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MiR-206 remt de lever metastase van GC in vivo
Om het effect van miR-206 op metastase in vivo te onderzoeken, voerden we de staart -vein injectie van P2GM-miR-206 en de vector alleen P2GM cellen met naakt muizen, 42 dagen na injectie, we geoogst en gefotografeerd de lever (Figuur 5A, bovenste panelen). H &E kleuring van weefselcoupes gaf een 7-voudig lagere aantal metastatische tumoren per oppervlakte-eenheid in de lever geïnjecteerd met P2GM-miR-206-cellen dan geïnjecteerd met P2GM controlecellen (Figuur 5A, onderste panelen en B). Bovendien is de grootte van tumoren in de P2GM-miR-206-cellen geïnjecteerde levers waren veel kleiner dan die van de controlegroep (figuur 5A). Dit resultaat pleit sterk dat miR-206 kan normaal gesproken een tumor suppressor rol voorkomen van uitzaaiing van maagkanker cellen hebben. Figuur 5 MiR-206 remt de lever metastase van GC in vivo. (A) Vertegenwoordiger macroscopische foto's van de muis lever, 42 dagen na de inenting, (De bovenste). Representatieve foto's van H & E gekleurde spontane leveruitzaaiingen. Vergroting: 10 × (De lagere). De resultaten tonen aan dat tumoren in P2GM-miR-206 groep kleiner en minder waren in vergelijking met de controlegroep. (B) Nummers van de lever uitgezaaide loci werden geteld en vergeleken tussen de muizen met SGC-7901 vector controle cellen en SGC-7901 cellen die miR-206. Gegevens stellen gemiddelden ± SEM (*** P < 0,0001). (C) Relatieve mRNA niveau van vermeende doelwitten van miR-206 tussen de SGC-7901-miR-P2GM en SGC-7901-miR-206 cellen. (D) De relatieve mRNA-niveau van vermeende doelwitten van miR-206 tussen GES-1 en SGC-7901 cellijnen. Belgique Om het mechanisme te bepalen waarmee miR-206 oefent zijn anti-metastatische rol, hebben we gezocht naar mogelijke buitenspiegels 206 target genen met behulp van een combinatie van online microRNA target acquisition gereedschappen en kruisverwijzingen de resulterende kandidaten aan degenen die zijn gemeld een rol te spelen in metastase. In een pool van 20 van dergelijke genen, vonden wij 9 daarvan (aanvullende bestandsinformatie 3: Tabel S1), namelijk STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, sFRP1, BCL2, BDNF en K-ras, werden drastisch neergereguleerd door miR-206 in de P2GM-miR-206 cellen stabiel in vergelijking met hun respectieve niveaus in de P2GM vector stabiele cellen (figuur 5C). Sommige miR-206 doelgenen werden aanzienlijk opwaarts gereguleerd in de ouderlijke SCG-7901 GC tumorcellen in vergelijking met normale gastrische GES-1 cellen (Figuur 5D), hetgeen een waarschijnlijke oorzakelijke gebeurtenis. Aldus miR-206 waarschijnlijk remt metastase van tumorcellen GC via een netwerk van regulerende genen.
Discussie
Hoewel ontregeling van miRNAs gerapporteerd in verschillende typen menselijke kankers [19], afwijkende expressie en mogelijke rol van miRNAs in maag kankers werden weinig bestudeerd. Hier laten we zien dat miR-206 continu neerwaarts gereguleerd in menselijke maagkanker en kanker cellijnen. In het licht van de verminderde miR-206 expressie gemeld in verschillende typen tumoren, onze resultaten suggereren dat de vermindering van miR-206 expressie is waarschijnlijk een eerste vereiste evenement in het ontstaan ​​van tumoren. Deze eis werd nog relevanter gemaakt toen we vonden dat lage miR-206 waren significant geassocieerd met lymfatische metastase, lokale invasie en TNM. Dit idee werd bevestigd door de resultaten van ectopische expressie van miR-206 in GC kankercellijn SCG-7901, waaruit bleek dat miR-206 GC onderdrukt celproliferatie, kolonievorming, invasie en migratie. Tenslotte werd het vermogen van miR-206 op metastase van SCG-7901-cellen te onderdrukken in de lever geeft een duidelijke verklaring voor het verband tussen lage niveaus van miR-206 en invasieve en metastatische maagkanker. Onlangs STC2 werd geïdentificeerd als een voorspellende marker voor lymfeklier metastase in oesofageale plaveiselcelcarcinoom [20]. Expressie van TrkB en BDNF wordt geassocieerd met een slechte prognose bij NSCLC patiënten [21]. Verschillende studies hebben gemeld dat IGF1R expressie is verhoogd bij uitgezaaide prostaatkanker en hormoon weerstand progressie [22, 23]. BCL2 expressie in primaire prostaatkanker is een merker voor slechte prognose, met een verhoogd risico van herhaling [24]. Wat hierboven gezegd suggereert een gemeenschappelijke oncogeen rol in humane kanker. Verder hebben we vastgesteld STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, sFRP1, BCL2, BDNF en K-ras als vermeende functionele doelen van miR-206 in het kader van deze hierboven werden besproken. Samen genomen, suggereren onze bevindingen een tumor suppressor rol van miR-206 in humane maagkanker
Bewijs van miR-206 als tumorgroei suppressor is gemeld bij een aantal kankers. miR-206 werd eerst gevonden dat neerwaarts gereguleerd in ERalpha -positieve menselijke borstkanker weefsel en de invoering van miR-206 in oestrogeen-afhankelijke MCF-7 borstkankercellen remt celgroei in een dosis- en tijdsafhankelijke wijze [25]. Bovendien zou miR-206 myogene differentiatie en blokkeren tumorgroei bij muizen xenotransplantatie bevorderen door neerwaarts reguleren van het product van het proto-oncogen MET: Met tyrosine-kinase-receptor [26]. Yan vond ook dat remming van miR-206 functie kunnen bijdragen tot afwijkende proliferatie en cel migratie, waardoor rhabdomyosarcoom ontwikkeling door onderdrukking van C-Met [16]. Ondertussen miR-206 kan worden gebruikt om HeLa celmigratie remt en focusvorming door remming van zowel Notch3 eiwit en mRNA [27]. Bovendien miR-206 werd downgereguleerd in hoge metastase longkanker vergeleken met lage metastase tumoren en normaal longweefsel overexpressie van miR-206 remde migratie en invasie van longkankercellen [18]. MiR-206 expressie afgenomen oestrogeen receptor-α (ERa) -positieve endometrial endometrioïde adenocarcinoom (EEG) en de overexpressie remde ERa-afhankelijke proliferatie, verminderde invasiviteit en geïnduceerde celcyclus arrestatie van ERa-positieve EEG cellijnen [28]. Al deze bevindingen gaven aan dat miR-206 een tumor suppressor rol in diverse vormen van kanker kunnen spelen.
Metastase draagt ​​bij tot de meeste kanker gerelateerde sterfgevallen. GC geldt als de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd, omdat de hoge mate van metastase, met inbegrip van lymfeklieren, buikvlies, lever enz. Vooral de 5-jaarsoverleving van maag tumor met uitzaaiingen in de lever niet meer dan 10% en de mediane overleving zonder behandeling ongeveer 3-5 maanden [29]. Meerdere genen spelen een centrale rol in metastase GC: zoals de overexpressie van insuline-achtige groeifactor-I receptor (IGF-IR) en de activering van de beide signaalwegen spelen cruciale rol in de ontwikkeling en progressie van maagkanker. Kloppen-down van Spl expressie door kleine remmend RNA leidde tot een verminderde IGFIR expressie en verzwakte groei en uitzaaiing van maagkanker cellen [30], anders kan IGF1R worden neerwaarts gereguleerd door miR-7 en een aanzienlijk verlaagde GC cel migratie en invasie [31]. Adachi gevonden dat blokkade van IGF-IR betrokken is bij het onderdrukken van kankercel invasie door de downregulatie van matrilysine [32]. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• De endotheliale lipaseproteïne belooft urinaire biomarker voor de diagnose van maagkanker
• Betekenis van decoy receptor 3 (Dcr3) en externe-signaal gereguleerd kinase 1/2 (Erk1 /2) bij maagkanker