Mekanismer för gastro av metanolextrakt av melastoma malabathricum leaves

Mekanismer för gastro av metanolextrakt av melastoma malabathricum
lämnar Bild Sammanfattning
Bakgrund
melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) är en liten buske med olika medicinskt bruk. Den aktuella studien genomfördes för att bestämma de gastro mekanismerna för metanolextrakt av M. malabathricum
blad (MEMM) hos råttor.
Metoder
extrakt mekanismer för gastro (50, 250, 500 mg /kg) studerades med hjälp av pylorus-ligering i råttmodell där volym, pH, fri och total syrahalt magsaft och magväggen slem innehåll bestämdes. Medverkan av endogena kväveoxid (NO) och sulfhydryl (SH) föreningar i magskyddande effekten av MEMM mättes också. MEMM utsattes för antioxidanten, anti-inflammatoriska och fytokemiska analys och HPLC-profilering.
Resultat
MEMM innehöll olika fyto-beståndsdelar med kvercitrin att identifieras som en del av dem. MEMM och kvercitrin: i) signifikant (p < 0,05) minskade volymen och surhetsgraden i magsaft och samtidigt öka pH och magväggen slem innehåll .; ii) signifikant (p < 0,05) höjt SOD, GTP och GTR medan signifikant (p < 0,05) minskade nivån av CAT, MPO och TBARS aktiviteter .; iii) som utövas gastroprotektiv aktivitet när bedömas med användning av etanol-inducerade magsår assay, som reverserades genom N G-nitro-L-arginin metylestrar (L-NAME, en hämmare av NO-syntas) och N
- etylmaleimid (NEM, en sulfhydryl (SH) blockerare). MEMM hämmade lipoxygenas (LOX) och xantinoxidas (XO) verksamhet med den högsta affiniteten för fd medan kvercitrin visade hög affinitet för XO-aktivitet.
Slutsatser
MEMM uppvisade en gastro verksamhet beror delvis på närvaron av kvercitrin, dess antioxidant och anti-inflammatoriska aktiviteterna, och via modulering av NO och SH-grupper.
Nyckelord
melastoma malabathricum
Melastomaceae Metanol extrahera gastroprotektiva mekanismer Kväveoxid sulfhydrylgrupp antioxidant anti~~POS=TRUNC inflammatorisk~~POS=HEADCOMP bakgrund
magsår är en vanlig sjukdom av hela mag-tarmkanalen. På nästan 8 till 10% av världens befolkning drabbas av magsår, ca 5% av dem lider av magsår [1]. De sår som påverkar mag-tarmsystemet vanligtvis förvärras av en obalans mellan destruktiva och defensiva faktorer i magen [1]. Även anses multifaktoriell sjukdom, är det allmänt känt att nästan alla magsår är kopplade till infektion av Helicobacter pylori
och huvud terapeutiskt syfte är att utrota H. pylori
infektion. För närvarande är den första linjens medicinsk behandling av magsår inriktade på att utrota H. pylori
infektion och vanligtvis baserad på trippelbehandling förfarande, som innefattade användning av magsårs hämmare (Dvs histamin H 2-antagonister, proton pumpshämmare, eller sukralfat och vismut) i kombination med två typer av antibiotika [2]. Emellertid bör det faktum att det finns andra än H. pylori
olika faktorer som kan utlösa magsår bildning inte ignoreras [3]. Olika tillvägagångssätt har använts vid behandling av magsår i samband med de icke-H. pylori
-relaterade faktorer såsom att minska syrasekre och öka slemproduktion men dessa metoder har betraktats som andrahandsbehandling.
Trots deras effektivitet i att utrota H. pylori
är behandlingen komplex och höga kostnader, som inbegriper användning av åtminstone två antibiotika i kombination med magsyrahämmare. Denna kombination orsakar ofta flera oönskade biverkningar (dvs antibiotikaresistens, återfall, illamående) [2,3]. Trots att H. pylori
infektioner gradvis har minskat under större delen av de industrialiserade länderna, är en gradvis ökning av fel på H. pylori
behandlingar utrotnings observerats någon annanstans [2]. Detta är ytterligare förvärras av föreningen av dessa standard antiulcusmedel med olika oönskade biverkningar. Med tanke på deras olika biverkningar och förekomsten av antibiotikaresistenta H. pylori
stammar, sökandet efter nya och säkra icke-antibiotiska gastroprotektiva medel från naturliga källor, i synnerhet växter, fortsätter att öka i hela världen [2, 4]. Review, en av de växter som används för att behandla magsår i Malaysia är melastoma malabathricum
L. (familj Melastomaceae). Lokalt känd för malajiska som "Senduduk
", är M. malabathricum
finns rikligt i Indiska oceanen Island hela Syd- och Sydostasien, Taiwan, Kina, södra Stilla havet och Australien. Olika delar av växten används i Malay traditionella läkemedel för att behandla en rad olika krämpor med bladen, i synnerhet, har använts för att behandla magsår bland andra [5]. Vetenskapligt, M. malabathricum
delar har rapporterats uppvisa olika farmakologiska aktiviteter [5-7]. Andra än för sin traditionella användning som antiulcusmedel, var M. malabathricum
valts i den aktuella studien bygger på det faktum att det är en av de berömda örter i Malay läkemedel folklore, men fick bristande uppmärksamhet bland samhället. Dessutom M. malabathricum
har rapporterats innehålla hög total fenolhalt och att utöva hög antioxidant och anti-inflammatoriska aktiviteter [5-7], som är viktiga i mekanismerna för antiulcus eventuella föreningar /extrakt. Det är väl känt att magsår, i synnerhet de som inducerar genom etanol, är förknippad med ROS generation. Etanol penetrerar snabbt magslemhinnan som den är i stånd att solubilisera de skyddande slem och orsakar frisättning av hydroperoxifettsyror fria radikaler och superoxidanjon. Dessa fria radikaler orsaka en ökning av oxidativ stress i vävnaderna, vilket i sin tur, ökar nivån av malondialdehyd, en markör av ökad lipidperoxidation. Sammantaget kan etanol-inducerad skadlig effekt manifesteras direkt via generering av reaktiva metaboliter eller indirekt via aktivering andra mekanismer som slutligen utlöser oxidativ skada [7]. Därför, extrakt /föreningar med antioxidanter aktivitet spelar en mycket viktig roll i sophantering dessa fria radikaler och hämmar lipidperoxidation. I stället för denna, har M. malabathricum
rapporterats att utöva en anmärkningsvärd antioxidant aktivitet [7], och därför, tros ha antimagsårs potential. Vår tidigare screening av metanolextrakt av M. malabathricum
(MEMM) för mot magsår potential mot etanol- och indometacin-inducerade magsår modeller har rapporterats på annat håll [8]. MEMM befanns dämpa etanol-inducerad, men förvärras indometacin-inducerad gastrisk sårbildning. Förmågan hos MEMM att utöva både den gastroskydd och anti-inflammatoriska aktiviteter [5] är i motsats till det av indometacin, som endast utövade anti-inflammatorisk aktivitet. Denna observation tyder på att extraktet aktiverar gastro via en mekanism som inte är kopplat till den anti-inflammation. Dessutom kan den antiinflammatoriska aktiviteten hos MEMM möjligen skilde sig från ett som utövas av indometacin. Att vara en inhibitor av både Coxs (dvs COX-1 och COX-2), är indometacin mer selektiv med avseende på COX-1, vilket krävs för att bibehålla den skyddande gastrointestinala skiktet [9]. Förmågan hos MEMM att intensifiera indometacin-inducerad gastrisk sårbildning antyder att MEMM också kanske hämmade COX-1-verkan och stör bildningen av konstitutivt PG som hjälper till att skydda magslemhinnan bland andra. Å andra sidan kan förmågan hos MEMM att utöva antiinflammatoriska aktiviteten bero på dess förmåga att hämma COX-2-beroende respons associerad med karrageenan-inducerat rått-tass ödemtestet [5; 9]. Annat än att kanske MEMM också arbeta motsats genom att aktivera COX-2, vilket leder till ökad PGE 2 syntes, som har rapporterats utöva anti-inflammatorisk aktivitet genom att binda till en av dess receptorer, PGE receptor 4 (EP 4) [10]. Dessutom PGE 2 har varit känt för att vara en föregångare till bildandet av cyklopentenon prostaglandiner (cyPG) som utövar antiinflammatoriska [11]. Dessutom, förmågan att aktivera PGE 2 syntes, vilket i sin tur ökar den gastriska slemproduktion kan ske via aktivering av EP 3 receptorer [10]. Detta kan återigen hjälpa till att förklara förmågan hos MEMM att demonstrera anti-inflammatorisk aktivitet, medan, på samma gång, utövar antimagsårsaktivitet mot etanol-, men inte indometacin-inducerad modell. Trots dessa förslag har inga försök gjorts för att bestämma de möjliga mekanismer för gastro av MEMM, som kan användas för att förklara den observerade antiulcusaktivitet.
Med hänsyn till ovan nämnda rapport [8] och en annan rapporter från Hussain et al. [6], som bedömde antiulcus potential vattenextrakt av M. malabathricum
att använda endast en modell av magsår (dvs etanol-inducerad modell), var den aktuella undersökningen mönster. Även M. malabathricum
har aldrig använts vid behandling av H. pylori
infektion, som stöds av dess dåliga antibakteriell aktivitet [12,13], den traditionella användningen av anläggningen för behandling av magsår motiverade närvaron forskning med hopp om att finna ett alternativ /naturlig magskyddande medel som ersättning för de för närvarande tillgängliga bieffekt-blottar läkemedel som används vid andrahandsbehandling. Ta hänsyn till detta, den aktuella studien syftar till att undersöka om de eventuella mekanismer för gastro av MEMM med hjälp av olika råttor modeller.
Metoder
Kemikalier
De kemikalier som används i denna studie är av analytiska kvaliteter och hade framställts omedelbart före användning. Följande läkemedel användes: ranitidin (Sigma-Aldrich, USA), kvercitrin (Sigma-Aldrich, USA), absolut etanol (Fischer Scientific, USA), N-etylmaleimid (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G -nitro-L-arginin metylestrar (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), karbenoxolon (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) och dietyleter (Fischer Scientific, USA).
Växtmaterial insamling och förberedelse av MEMM
bladen M. malabathricum
samlades in mellan augusti och september 2010 från Serdang, Selangor, Malaysia, och identifieras med hjälp av en botanist från Institute of Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, Malaysia. En kupong prov, ACP-0017, har deponerats vid Herbarium av IBS, UPM, Malaysia. De malda torkade blad (40 g) lades i blöt tre gånger vid rumstemperatur under 24 h med metanol i förhållandet 01:20 (vikt /volym) och metanolen supematanten indunstades (40 ° C) under reducerat tryck till torrhet vilket resulterade i ett utbyte av 12,8 g torkad och klibbig metanolextrakt (procent gav ades ≈ 32%).
phytochemical screening och HPLC-analys av MEMM
fytokemiska screening och HPLC-analys av MEMM utfördes enligt den tidigare rapporterade metoden [ ,,,0],7]. Phytochemical screening av MEMM utfördes för att bestämma närvaron av flavonoider, triterpener, tanniner, alkaloider och saponiner enligt konventionella protokoll som beskrivs below.i) Flavonoider
Cirka 10,0 g av MEMM ades separat kokt under 2 till 3 minuter i 100 ml vatten i ett vattenbad. Till 3 ml av filtratet, 3 ml av syra-alkohol (etanol: vatten: koncentrerad klorvätesyra i förhållandet 1: 1: 1), fast magnesium (1 cm) och 1 ml t-amyl-alkohol tillsattes. Blandningarna observerades därefter för en ros-orange eller kränka färg change.ii) Triterpenes
Cirka 1,0 g MEMM var separat extraheras under 24 timmar i eter. 1 ml av filtratet indunstades till torrhet och återstoden upplöstes på nytt i flera droppar ättiksyraanhydrid och sedan flera droppar svavelsyra tillsattes till lösningen. Blandningarna observerades därefter för en grön färg change.iii) Tanniner
Cirka 0,2 g av MEMM ades separat kokades i 5 ml vatten. Blandningarna kyldes och filtrerades. Några droppar (3 droppar) av 5% järnkloridlösning sattes till filtratet och observerades under en blå-svart fällning formation.iv) Alkaloider
Cirka 0,5 g av MEMM ades separat kokades med 10 ml utspädd saltsyra (alkoholisk) i ett provrör under 5 min. Blandningarna kyldes och skräpet fick sedimentera. Var och en av de överstående vätskorna filtrerades in i en annan provrör och 1 ml av varje filtrat togs i vilken tre droppar Dragendorffreagens reagens (kalium vismut didlösning) tillsattes, skakades och observerades för uppkomsten av en orange-röd fläck och en fällning formation.v) Saponiner
Cirka 0,2 g av MEMM skakades med vatten och blandningen observerades för en ihållande skum.
HPLC-analys av MEMM utfördes enligt den föregående rapporten [4 ] men med smärre ändringar. I korthet var MEMM (10 mg) suspenderades i 1 ml metanol. Lösningen bringades att passera genom en filterpatron (porstorlek 0,45 ^ m) före analys. Det filtrerade provet analyserades med hjälp av HPLC-systemet består av Waters Delta 600 med 600 Controller, fotodiod-array-detektor (Waters 996). Och en Phenomenex Luna (5 ^ m) (Torrance, CA, USA) kolonn (4,6 mm innerdiameter x 250 mm). Två lösningsmedel som betecknas som A och B användes för eluering av beståndsdelarna. A var 0,1% vattenhaltig myrsyra och B var acetonitril. Begynnelsevillkor var 95% A och 5% B med en linjär gradient når 25% B vid t
= 12 min och detta tillstånd upprätthölls under 8 min. B reducerades tillbaka till 15% vid t
= 22 min och hölls vid detta tillstånd under ytterligare 8 min (t
= 30 min). Vid t
= 35 min, återvände programmet till det initiala lösningsmedelskomposition. Flödeshastigheten som användes var 1,0 ml /min och injektionsvolymen var 10 pl. Kolonnugnen var satt till 27 ° C och elueringsmedlet övervakades vid 210, 254, 280, 300, 330 och 366 nm. Retentionstiderna, toppytor och UV-spektra av de stora topparna analyserades. HPLC-analysen genomfördes i laboratoriet för Phytomedicine, medicinalväxter Division, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Malaysia
Försöksdjur
Sprague Dawley (180-200 g. 8-10 veckor gamla) erhölls från veterinärdjurenhet, veterinärmedicinska fakulteten, Universiti Putra Malaysia (UPM), Malaysia och förvaras i rumstemperatur (27 ± 2 ° C, 70-80% luftfuktighet, 12 h ljus /mörker cykel) i Animal Holding Unit, Medicinska fakulteten och Hälsouniversitetet, UPM. De försågs med föda och vatten ad libitum
från början av experimenten. Studieprotokollet med denna studie godkändes av Animal House och användning kommittén, Medicinska fakulteten och Hälsouniversitetet, UPM (etiskt godkännande nr: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00.449). Råttorna hanteras i enlighet med gällande UPM riktlinjer för vård av försöksdjur och etiska riktlinjer för undersökningar av experimentell smärta i medvetna djur [14]. Alla experiment utfördes mellan 09.30 och 18.30 h för att minimera effekterna av miljöförändringar. Fastande applicerades under 48 h före alla analyser vari råttorna fick tillgång till endast vatten.
Bestämning av möjliga mekanismer för gastroskydd av MEMM
Pylorus ligering-inducerad ulceration
Pylorus ligering utfördes enligt metoden av Shay et al. [15] med smärre ändringar. Trettio råttor uppdelades slumpmässigt i 5 grupper (n = 6). Grupp-I (kontroll) behandlades med vehikel (10% DMSO), var grupp-II (positiv kontroll, ranitidin) ges vid 100 mg /kg (po), grupp-III, -IV och-V råttorna behandlades med MEMM (50, 250 och 500 mg /kg, respektive). Pylorus-ligering utfördes 1 h efter administreringen av testföreningarna på 48 h fastande råttor. Ketamin HCl (100 mg /kg, intramuskulärt) och xylazin-HCl (16 mg /kg, intramuskulär) användes för att söva råttorna före ligering av pylorus. En 2 cm långt snitt gjordes i buken strax under bröstbenet på sövda råttor. Magen exponerades, och en tråd fördes runt pyloric sphincter och bunden i en stram knut. Omsorg togs stunder knyta knuten för att undvika involverar blodkärl i knut. Buken syddes och skalet var rengöras av någon blod fläckar eller blödning. Djuren avlivades 6 h efter ligering genom cervikal dislokation.
Bestämning av volym, pH, fri och total surhet av gastrisk innehåll
Magarna avlägsnades, och innehållet tömdes ut, uppsamlades och centrifugerades vid 2500 varv per minut under 10 min. Volymen och pH-värdet hos magsaften mättes och utsattes för fri och total aciditet uppskattning i enlighet med den metod som beskrivs av Srivastava et al. [16]. Fria fettsyror bestämdes genom titrering med 0,01 N natriumhydroxid (NaOH) med metylorange reagens tills färgen av lösningen blev gulaktig. Volymen av tillsatt alkali noterades. Därefter tillsattes två till tre droppar fenolftalin sattes och lösningen titrerades tills en bestämd rosa färg uppträder. Den totala volymen av NaOH tillsattes noterades och detta motsvarar den totala syrahalten. Surhetsgrad beräknades enligt följande formel: $$ \\ mathrm {surhet} = \\ frac {\\ mathrm {Volym} \\ kern0.5em \\ mathrm {av} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ gånger \\ mathrm {normalitet} \\ kern0.5em \\ mathrm {av} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ gånger 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Skattning av magväggen slem innehåll
Gastric vägg sleminnehåll bestämdes genom metoden beskriven av Corne et al. [17] med smärre ändringar. Magsäcken öppnades längs den större krökningen, vägdes och nedsänktes i 10 ml av 0,1% Alcian Blue i 0,16 M sackaros /0,05 M natriumacetat, pH 5,8 under 2 timmar. Den överdrivna färgämne avlägsnades därefter genom två på varandra följande sköljningar i 0,25 M sackaroslösning (15 min vardera). Den kvarvarande färgämnet komplexbunden med de gastriska mukus extraherades med 0,5 M MgCl 2 under 2 timmar och skakades intermittent under en min i varje 30 min intervall. Den blå extraktet skakades sedan kraftigt med en lika stor volym av dietyleter och den resulterande emulsionen centrifugerades vid 3600 rpm under 10 min. Absorbansen (OD) för Alcian Blue i det vattenhaltiga skiktet avlästes vid 580 nm med användning av en spektrofotometer. Kvantiteten av Alcian Blue extrakt per gram våt magen beräknades därefter från en standardkurva.
Etanol-inducerad gastrisk mukosal lesion i L-NAME pre-behandlade råttor
Medverkan av endogent NO i modulering av etanol-inducerad magskyddande aktivitet bestämdes i enlighet med metoden av Andreo et al. [18], men med smärre ändringar. Hanråttor delades slumpmässigt in i tolv grupper (n = 6) och fastade i 24 timmar men fick fri tillgång till vatten. De överfördes sedan förbehandlas med saltlösning eller L-NAME (70 mg /kg; en inhibitor av NO-syntas) intraperitonealt (ip) och 30 min senare fick djuren vehikel (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positiv kontrollgrupp) eller 500 mg /kg MEMM (po). En timme efter administreringen av testlösningar, var magsår inducerades med användning av 5 ml /kg absolut etanol i samtliga grupper. Å andra sidan, var L-arginin (200 mg /kg) administrerades, 30 min efter saltlösning eller L-NAME behandling och, följt 30 min senare av etanoladministration. Samtliga råttor avlivades 1 h senare genom exponering för dietyleter. Magsäcken öppnades längs den större krökningen för att bestämma den magsår området (UA) såsom beskrivits av Balan et al. [19]. Den procentuella skydd beräknades enligt följande formel: $$ \\ mathrm {Protection} \\ vänster (\\% \\ höger) = \\ frac {\\ vänster (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontroll} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {behandlas} \\ \\ mathrm {grupp} \\ right)} {\\ vänster (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontroll} \\ right)} \\ gånger 100 \\% $$ Etanol-inducerade gastrointestinala skada i NEM förbehandlade råttor
att undersöka medverkan av sulfhydryl (SH) -grupp vid modulering av etanol-inducerad magskyddande aktivitet, de förfaranden som beskrivs av Andreo et al. [18] antogs med smärre ändringar. Råttorna delades slumpmässigt in i 12 grupper (n = 6) och fastade i 24 timmar men fick fri tillgång till vatten. Experimentet började med förbehandling (i.p.) av saltvatten eller NEM (10 mg /kg), en sulfhydryl (SH) blockerare. Trettio minuter efter förbehandlingen regiment råttorna administrerades (po) med vehikel (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positiv kontrollgrupp) eller 500 mg /kg MEMM följt av administration av 5 ml /kg etanol en timme senare för att framkalla magsår. Alla djur avlivades 1 timme efter att ha fått etanol genom exponering för dietyleter. Magen avlägsnades och gastrisk skada bestämdes såsom beskrivits ovan.
Biokemisk analys av magen vävnader
Efter de makroskopiska analyser, superoxiddismutas (SOD) [20], katalas (CAT) [21], myeloperoxidas (MPO) [22], glutationperoxidas (GTP) [23], glutationreduktas (GTR) [24] och tiobarbitursyra reaktiva ämnen (TBARS) [25] enzymaktivitet i råttans mage vävnader mättes. Magslemhinnan skrapades från antral delen av magen med användning av en scrapper och lagrades vid 4 ° C för biokemisk uppskattning. Den skrotade magslemhinnan underkastades förbereda den mukosala homogenatet (pH 7,2). Homogenatet centrifugerades sedan vid 3000 rpm under 10 min och den erhållna supernatanten användes för analys av antioxidant typ på etanol-inducerad gastrisk mukosal skada. I alla antioxidantförsvars analyser, var ranitidin (100 mg /kg) -pretreated grupp betraktas som den positiva kontrollgruppen.
Bestämning av SOD-aktivitet
aktiviteten av SOD bestämdes baserat på inhiberingen av bildandet av nikotinamid-adenin dinukleotid, fenazinmetosulfat och amino tetrazolium formazan [20]. Ungefär 0,5 ml av vävnadshomogenat blandades med 0,4 ml etanol och kloroform-blandning och centrifugerades. Till supernatanten, analysblandningen (natriumpyrofosfat-buffert (0,025 M, pH 8,3), nitroblå tetrazolium, fenazinmetosulfat och reducerad nikotinamidadenindinukleotid (NADH)) tillsattes och inkuberades vid 30 ° C under 90 s. Reaktionen avbrutits genom tillsats av isättika och blandades med n
butanol. Intensiteten hos den färg som utvecklas i butanol mättes vid 560 nm. SOD-aktiviteten mättes genom graden av hämning av denna reaktion och uttrycks som mmol /min /mg protein.
Bestämning av CAT-aktivitet
Aktiviteten hos CAT analyserades kolorimetriskt vid 620 nm såsom beskrivits genom metoden enligt Sinha [21]. Reaktionsblandningen av 1,5 ml innehållande 1,0 ml fosfatbuffert (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml av 2,0 M H 2O 2 och 1,0 ml vävnadshomogenat. Stoppades reaktionen genom tillsats av 2,0 ml av dikromat-ättiksyra reagens (5% kaliumdikromat och isättika blandning i förhållandet 1: 3). Resultat uttrycks som mmol /min /mg protein.
Bestämning av MPO-aktivitet
aktiviteten av MPO mättes i enlighet med metoden beskriven av Bradley et al. [22] men med smärre ändringar. De homogeniserade proven frystes och tinades tre gånger och centrifugerades vid 1500 g under 10 min vid 40 ° C. Ungefär 100 | il av den homogeniserade supernatanten tillsattes till 1,9 ml av 10 mmol /L fosfatbuffert (pH 6,0) och 1,0 ml av 1,5 mmol /LO-dianisidin-hydroklorid innehållande 0,0005% (vikt /volym) H 2O 2. Absorbansen utvärderades vid 450 nm på en UV-spektrofotometer och MPO-aktivitet i gastriska vävnader uttrycktes som umol /min /mg protein.
Bestämning av GTP-aktivitet
Aktiviteten av GTP uppmättes genom metoden beskriven av Rotruck et al. [23] med smärre ändringar. Reaktionsblandningen, som innehöll 0,2 ml av 0,4 M, Tris - HCl-buffert, pH 7,0, 0,1 ml av 10 mM natriumazid, 0,2 ml vävnadshomogenat (homogenis vävnaden i 0,4 M Tris-HCl-buffert, pH 7,0), 0,2 ml glutation och 0,1 ml 0,2 mM väteperoxid inkuberades sedan vid rumstemperatur under 10 min. Reaktionen avbrutits genom tillsats av 0,4 ml 10% TCA och underkastelse till centrifugeringsprocessen. Supernatanten analyserades för glutation innehåll genom att använda Ellmans reagens (19,8 mg av 5, 5'-dithiobisnitro bensoesyra (DTNB) i 100 ml 0,1% natriumnitrat). En molära extinktionskoefficienten av 6.22 x 103 | j, mol användes för att bestämma aktiviteten av GTP. Enzymaktiviteten uttrycktes som internationella enheter av enzymatisk aktivitet /g protein. Internationella enheter uttrycks som xmol hydroperoxider transformerade /min /ml enzym.
Bestämning av GTR aktivitet
Nivån på GTR bestämdes enligt metoden av Ellman [24]. Approximately1.0 ml av supernatanten behandlades med 0,5 ml Ellmans reagens (19,8 mg av 5, 5'-dithiobisnitro bensoesyra (DTNB) i 100 ml 0,1% natriumnitrat) och 3,0 ml fosfatbuffert (0,2 M, pH 8,0 ). Absorbansen avlästes vid 412 nm och den GTR aktiviteten uttrycktes som | j, mol /min /mg vävnad.
Bestämning av TBARS innehåll
Omfattningen av LPO mättes genom att analysera nivåer av TBARS i magslemhinnan enligt den föregående metod [25], men med mindre modifiering. Till 0,5 ml vävnadshomogenat, 1,5 ml av 20% ättiksyra, 0,2 ml av SDS och 1,5 ml TBA tillsattes. Blandningen gjordes upp till 4 ml med destillerat vatten och upphettades under 1 timme vid 95 ° C. Efter kylning tillsattes 4,0 ml butanol-pyridin blandning tillsattes och skakades väl. Denna blandning centrifugerades sedan vid 4000 rpm under 10 min. Det organiska skiktet togs och dess absorbans avlästes vid 532 nm och resultaten uttrycktes som n mol /g protein.
Uppskattningen av protein
Proteinhalten i den gastriska vävnaden beräknades i enlighet med metoden enligt Lowry et al. [26] men med smärre ändringar. Tissueprovet och de standarder (1,0 mg /ml bovint serumalbumin i dubbeldestillerat vatten) i olika rör behandlades med 5,0 ml reagensblandning (48% -ig kalium-tartrat, 2% kopparsulfat och 3% natriumkarbonat i 01:48 (volym /volym)). Sedan Folin fenolreagens (1: 2) tillsattes till reaktionsblandningen och fick stå under 30 min vid rumstemperatur. Den optiska densiteten avlästes vid 710 nm med vatten som reagensblank.
In vitro anti-inflammatoriska aktiviteten hos MEMM
In-vitro effekten av MEMM på kväveoxid
Cellodling och stimulering
RAW 264,7 cellinje (murina monocytiska makrofager) (European CoUection of cell Cultures, Porton Down, UK) upprätthölls i DMEM kompletterat med 10% FBS, 4,5 g /L glukos, L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), penicillin (50 U /ml) och streptomycin (50 | j, g /ml) och 5% CO 2 vid 37 ° C. Cellerna (4 x 10 5 celler /brunn) såddes ut i en 96-brunnsplatta och inkuberades under 2 h vid 37 ° C i en CO 2 inkubator för att möjliggöra vidhäftning av celler, och sedan utlöses med stimuli (100 U /ml av IFN-g och 5 pg /ml av LPS) med eller utan närvaro av MEMM i koncentration i intervallet mellan 12,5 till 100 ^ g /ml. DMSO (vehikel) användes för att lösa upp MEMM. Den slutliga koncentrationen av DMSO var säkerställd för att vara 0,1% i alla kulturer. Cellerna inkuberades sedan under 17-20 h vid 37 ° C i en CO 2 inkubator. NO-bestämning utfördes genom att underkasta den odlade supernatanten mot Griess analys och cellerna som finns kvar i brunnen testades för cellviabilitet assay
Nitrit bestämning
Koncentrationen av nitrit (NO 2 . - ), en stabil metabolit av NO i odlingsmedium, bestämdes med användning av Griess-analys [27]. En lika stor volym Griess reagens blandades med odlingssupernatanten och färgutvecklingen mättes vid 550 nm. Kvantiteten av nitrit i odlingssupernatanten bestämdes baserat på standardkurvan av ett natriumnitrit (0-100 pM) nyframställd i avjoniserat vatten. Andel av NO hämning beräknades genom att använda följande formel: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ där;
* kontroll är nitritnivån av IFN-γ /LPS-inducerad grupp
Cellviabiliteten
Cytotoxiciteten hos MEMM på de odlade cellerna bestämdes genom att analysera en minskning av tre. - (4,5-dimetyl-2-tiazolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) [27]. MTT-reagens (0,05 mg /ml) suspenderades i steril PBS, pH 7,0 och tillsattes sedan till varje brunn efter avlägsnande av supernatanten. Detta följdes av inkubation av de återstående cellerna vid 37 ° C under 4 h följt av tillsats av 100 | il av 100% DMSO i brunnarna för att lösa upp formazan salter bildade. Absorbansen mättes vid 570 nm. Den procentuella andelen av cellviabilitet beräknades enligt följande formel: $$ \\ mathrm {Cell} \\ \\ mathrm {viabilitet} \\ vänster (\\% \\ höger) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {kontroll}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {prov}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• En ny metod, upptäcker digital genom scanning KRAS genamplifiering i gastric cancer: inblandning av överuttryckt vildtyp KRAS i nedströms signalering och cancercelltillväxt
• Genomisk profilanalys av diffus typ gastric cancer