Mécanismes de gastroprotection d'extrait de méthanol de Melastoma malabathricum feuilles

Mécanismes de gastroprotection d'extrait de méthanol de Melastoma malabathricum
feuilles
Résumé
fond
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) est un petit arbuste avec diverses utilisations médicinales. La présente étude a été réalisée afin de déterminer les mécanismes gastroprotective d'extrait de méthanol de M. malabathricum
feuilles (MEMM) chez le rat.
Méthodes
mécanismes de gastroprotection de l'extrait (50, 250, 500 mg /kg) ont été étudiés en utilisant la ligature du pylore, dans le modèle de rat, dans lequel le volume, le pH et l'acidité libre totale du suc gastrique, et le contenu gastrique paroi du mucus ont été déterminées. L'implication du monoxyde d'azote (NO) et sulfhydryle (SH) des composés endogènes à l'effet de gastroprotection MEMM ont également été mesurés. MEMM a été soumis à l'antioxydant, les résultats des anti-inflammatoires et phytochimique analyse et HPLC profilage.
MEMM contenaient diverses phyto-constituants avec quercitrine étant identifié comme faisant partie d'entre eux. MEMM et quercitrine: i) de manière significative (p < 0,05) a réduit le volume et l'acidité du suc gastrique tout en augmentant le pH gastrique et le contenu mur de mucus .; ii) de manière significative (p < 0,05) a augmenté le niveau de SOD, GTP et GTR alors de façon significative (p < 0,05) a réduit le niveau de CAT, MPO et TBARS activités .; iii) exerce une activité gastroprotectrice lorsqu'elle est évaluée en utilisant le dosage de l'ulcère gastrique induite par l'éthanol, qui a été renversée par N G-nitro arginine-l-esters méthyliques (L-NAME, un inhibiteur de la NO-synthase) et de N
- éthylmaléimide (NEM; un groupe sulfhydryle (SH) bloqueur). MEMM inhibe la lipoxygénase (LOX) et de la xanthine oxydase (XO) activités avec la plus forte affinité pour l'ex-tout quercitrine a montré une grande affinité pour l'activité XO.
Conclusions
MEMM présentait une activité gastroprotective due en partie à la présence de quercitrine, ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires, et via la modulation de groupes NO et SH.
Mots-clés
Melastoma malabathricum
Melastomaceae méthanol extraient mécanismes Gastroprotecteurs oxyde nitrique groupe sulfhydryle Contexte Anti-inflammatoire antioxydant
les ulcères peptiques sont un trouble commun de l'ensemble du tractus gastro-intestinal. De près de 8 à 10% de la population mondiale affectée par les ulcères peptiques, environ 5% d'entre eux souffrent d'ulcères gastriques [1]. Les ulcères qui affectent le système gastro-intestinal sont généralement aggravés par une disproportion entre les facteurs destructeurs et défensifs dans l'estomac [1]. Bien que considéré comme une maladie multifactorielle, il est généralement admis que la quasi-totalité des ulcères peptiques sont liés à l'infection à Helicobacter pylori
et l'objectif thérapeutique majeur est d'éradiquer l'infection pylori
H.. Actuellement, le traitement médical de première ligne de l'ulcère gastrique est destiné à éradiquer l'infection de H. pylori et le plus souvent sur la base de la procédure de traitement triple, qui impliquait l'utilisation d'inhibiteurs de l'ulcère gastrique (Ie histamine H 2-antagonistes, proton Les inhibiteurs de la pompe ou du sucralfate et du bismuth) en association avec deux types d'antibiotiques [2]. Cependant, le fait qu'il existe divers facteurs autres que H. pylori
qui peuvent déclencher la formation de l'ulcère gastrique ne doit pas être ignorée [3]. Diverses approches ont été utilisées dans le traitement de l'ulcère gastrique associé à ces non-H. Les facteurs de la PI pylori tels que la réduction de la sécrétion acide et l'augmentation de la production de mucus, mais ces approches ont été considérées comme le traitement de deuxième ligne.
Malgré leur efficacité dans l'éradication de H. pylori
, le traitement est complexe et de coût élevé, impliquant l'utilisation d'au moins deux antibiotiques en combinaison avec des inhibiteurs d'acide gastrique. Cette combinaison provoque souvent plusieurs effets secondaires indésirables (par exemple la résistance aux antibiotiques, la récurrence, nausées) [2,3]. Malgré le fait que les infections de H. pylori ont progressivement diminué dans la majorité des pays industrialisés, une augmentation progressive de l'échec de H. pylori
éradication des traitements est observé ailleurs [2]. Ceci est encore aggraver par l'association de ces agents anti-ulcéreux standard avec divers effets secondaires indésirables. Compte tenu de leurs effets néfastes divers et l'apparition de résistance aux antibiotiques H. pylori
souches, la recherche de nouveaux et sûrs agents gastroprotective non antibiotiques provenant de sources naturelles, en particulier les plantes, continuent d'augmenter partout dans le monde [2, 4].
l'une des plantes qui sont utilisés pour traiter l'ulcère gastrique en Malaisie est Melastoma malabathricum
L. (famille Melastomaceae). Localement connu le malais 'Senduduk
', M. malabathricum
se trouve en abondance dans Indian Ocean Island, tout au long du Sud et l'Asie du Sud, Taiwan, la Chine, Océan Pacifique sud et en Australie. Diverses parties de la plante sont utilisées en médecine traditionnelle malais pour traiter une variété de maux avec les feuilles, en particulier, ont été utilisés pour traiter les ulcères gastriques chez les autres [5]. Scientifiquement, le M. malabathricum
parties ont été signalés à présenter diverses activités pharmacologiques [5-7]. Autre que pour son utilisation traditionnelle comme anti-ulcéreux, M. malabathricum
a été choisi dans la présente étude repose sur le fait qu'il est l'un des célèbres herbes dans le folklore malais médicinale, mais a reçu peu d'attention dans la communauté. De plus, M. malabathricum
a été rapporté pour contenir le contenu phénolique total élevé et d'exercer une forte teneur en antioxydants et anti-inflammatoires [5-7], qui sont importants dans les mécanismes de antiulcéreux de tous composés /extraits. Il est bien connu que l'ulcère gastrique, en particulier ceux qui induisent l'éthanol, est associée à la génération de ROS. L'éthanol pénètre rapidement la muqueuse gastrique comme il est capable de solubiliser les muqueuses de protection et provoque la libération de radicaux hydroperoxy-libres et l'anion superoxyde. Ces radicaux libres provoquent une augmentation du stress oxydatif dans les tissus, ce qui, à son tour, augmente le taux de malondialdéhyde, un marqueur de l'augmentation de la peroxydation des lipides. Dans l'ensemble, l'effet délétère induite par l'éthanol peut se manifester directement via la génération de métabolites réactifs ou indirectement par l'intermédiaire de l'activation d'autres mécanismes qui déclenchent enfin les dommages oxydatifs [7]. Par conséquent, les extraits /composés ayant une activité anti-oxydants jouent un rôle très important dans piégeant les radicaux libres et inhibent la peroxydation lipidique. Au lieu de cela, M. malabathricum
a été rapporté à exercer une activité antioxydante remarquable [7] et, par conséquent, on croit posséder antiulcéreux potentiel. Notre dépistage plus précoce de l'extrait de méthanol de M. malabathricum
(MEMM) pour antiulcéreux potentielle contre les modèles d'ulcère gastrique éthanol- et induite par l'indométhacine a été rapporté ailleurs [8]. MEMM a été trouvé pour atténuer induite par l'éthanol, mais aggravée, la formation d'ulcères gastriques induites par l'indométacine. La capacité de MEMM à exercer à la fois la gastroprotection et anti-inflammatoires [5] est contraire à celle de l'indométacine, qui n'exerce une activité anti-inflammatoire. Cette observation semble suggérer que l'extrait active gastroprotection par un mécanisme qui n'est associée à celle de l'anti-inflammation. Par ailleurs, l'activité anti-inflammatoire de MEMM pourrait éventuellement diffère de celle exercée par l'indométacine. Étant un inhibiteur de la COX deux (par exemple COX-1 et COX-2), l'indométacine est plus sélectif pour la COX-1, qui est nécessaire pour maintenir la couche protectrice de la muqueuse gastrique [9]. La capacité de MEMM à intensifier gastrique induite par la formation d'ulcères de l'indométhacine suggère que MEMM pourrait également inhiber la COX-1 et de l'action interférer avec la formation de PG constitutive qui aident à protéger la muqueuse gastrique, entre autres. D'autre part, la capacité de MEMM à exercer une activité anti-inflammatoire peut être due à sa capacité à inhiber la réponse de la COX-2-dépendants associés à l'essai patte de l'oedème du rat induit par la carraghénine [5, 9]. Autre que cela, MEMM pourrait aussi travailler au contraire en activant la COX-2, conduisant à une augmentation PGE 2 synthèse, qui a été rapporté à exercer une activité anti-inflammatoire en se liant à un de ses récepteurs, le récepteur PGE 4 (EP 4) [10]. Par ailleurs, la PGE 2 est connue pour être le précurseur pour la formation de Prostaglandines cyclopenténone (CYPG) qui exerce un anti-inflammatoire [11]. En outre, la capacité d'activer le PGE 2 synthèse, qui à son tour augmente la production de mucus gastrique, peut se produire via l'activation du PE 3 récepteurs [10]. Cela pourrait aider à expliquer à nouveau la capacité de MEMM de démontrer l'activité anti-inflammatoire tandis que, en même temps, exercer une activité anti-ulcéreux contre l'éthanol-, mais pas le modèle indométacine-induite. Malgré ces suggestions, aucune tentative n'a été faite pour déterminer les mécanismes possibles de gastroprotection de MEMM, qui pourraient être utilisés pour expliquer la antiulcéreux activité observée.
Tenant compte du rapport mentionné ci-dessus [8] et un autre des rapports faits par Hussain et al. [6], qui ont évalué le potentiel anti-ulcéreux de l'extrait aqueux de M. malabathricum
utilisant un seul modèle d'ulcère gastrique (à savoir le modèle induit par l'éthanol), l'étude actuelle étaient des dessins. Bien que M. malabathricum
n'a jamais été utilisé dans le traitement de l'infection de H. pylori, qui est soutenu par sa faible activité antibactérienne [12,13], l'utilisation traditionnelle de la plante pour le traitement de l'ulcère gastrique justifié la recherche de présence avec l'espoir de trouver un agent gastroprotective alternatif /naturel en remplacement des médicaments aux effets secondaires Baring actuellement disponibles utilisés dans le traitement de deuxième ligne. Prenant en compte ce fait, la présente étude visait à étudier les mécanismes possibles de gastroprotection de MEMM utilisant des modèles différents de rats.
Méthodes
Chimie
Les produits chimiques utilisés dans cette étude sont des qualités analytiques et avaient été préparés immédiatement avant utilisation. Les médicaments suivants ont été utilisés: ranitidine (Sigma Aldrich, USA), quercitrine (Sigma Aldrich, USA), l'éthanol absolu (Fischer Scientific, États-Unis), N-éthylmaléimide (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G esters méthyliques nitro-L-arginine (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), carbénoxolone (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) et de l'éther de diéthyle (Fischer Scientific, États-Unis).
matières végétales collecte et la préparation de MEMM
les feuilles de M. malabathricum
ont été recueillies entre Août et Septembre 2010 à partir de Serdang, Selangor, en Malaisie, et identifié par un botaniste de l'Institut de Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, Malaisie. Un spécimen de, ACP-0017, a été déposé à l'Herbier de l'IBS, UPM, Malaisie. Le sol de feuilles séchées (40 g) ont été trempées trois fois à la température ambiante pendant 24 h, avec du méthanol dans un rapport de 1:20 (p /v) et le surnageant de methanol a été évaporé (40 ° C) sous pression réduite à sec résultant en un rendement de 12,8 g séché et extrait de méthanol collant (pourcentage donné a été ≈ 32%).
criblage phytochimique et analyse HPLC MEMM
le criblage phytochimique et l'analyse HPLC du MEMM a été réalisée selon la méthode précédemment rapporté [ ,,,0],7]. criblage phytochimique de MEMM a été effectuée pour déterminer la présence de flavonoïdes, des triterpènes, des tanins, des alcaloïdes et des saponines selon les protocoles classiques comme below.i décrit) Flavonoïdes
Environ fait bouillir séparément 10,0 g de MEMM pendant 2 à 3 min dans 100 ml d'eau dans un bain d'eau. 3 ml du filtrat, 3 ml d'acide-alcool (éthanol: eau: acide chlorhydrique concentré dans un rapport de 1: 1: 1), le magnésium solide (1 cm) et 1 ml de t-amyl-alcool ont été ajoutés. Les mélanges ont ensuite été observés pour un violent change.ii de couleur rose-orange ou) Triterpènes
Environ 1,0 g de MEMM a été extrait séparément pendant 24 h dans de l'éther. 1 ml du filtrat a été évaporé à sec et on reprend le résidu dans quelques gouttes d'anhydride acétique, puis quelques gouttes d'acide sulfurique ont été ajoutés à la solution. Les mélanges ont ensuite été observés pour une couleur change.iii vert) Tanins
Environ 0,2 g de MEMM fait bouillir séparément dans 5 ml d'eau. Les mélanges ont été refroidis et filtrés. Quelques gouttes (3 gouttes) de 5% de solution de chlorure ferrique ont été ajoutés au filtrat et observés pour un précipité formation.iv bleu-noir) alcaloïdes
Environ 0,5 g de MEMM a été séparément bouilli avec 10 ml d'acide chlorhydrique dilué (alcoolique) dans un tube à essai pendant 5 min. Les mélanges ont été refroidis et les débris ont été autorisés à régler. Chacun des liquides de surnageant a été filtré dans un autre tube à essai et 1 ml de chaque filtrat a été pris dans laquelle trois gouttes de réactif de Dragendorff (de potassium, de bismuth solution d'iodure) ont été ajoutés, agités et on a observé l'apparition d'une tache rouge-orange et un précipité formation.v) saponines
Environ a été secoué 0,2 g de MEMM avec de l'eau et le mélange a été observée pour une mousse persistante.
l'analyse HPLC de MEMM a été réalisée selon le rapport précédent [4 ], mais avec de légères modifications. En bref, MEMM (10 mg) a été mis en suspension dans 1 ml de méthanol. La solution a été passée à travers une cartouche filtrante (diamètre des pores de 0,45 um) avant l'analyse. L'échantillon filtré a été analysé à l'aide du système HPLC constitué par le delta Waters 600 à 600 Controller, un détecteur à photodiode (Waters 996). Et un Phenomenex Luna (5 um) (Torrance, CA, USA) colonne (4,6 mm de diamètre intérieur x 250 mm). Deux solvants désignés par A et B ont été utilisés pour l'élution des constituants. A est l'acide formique aqueux à 0,1% et B est de l'acétonitrile. Les conditions initiales étaient respectivement de 95% de A et 5% de B avec un gradient linéaire atteignant 25% de B à t = 12 min
et cette condition est maintenue pendant 8 min. B a été réduit de retour à 15% à t
= 22 min et maintenue à cette condition pour un autre 8 min (t
= 30 min). A t
= 35 min, le programme revient à la composition du solvant initial. Le débit utilisé était de 1,0 ml /min et le volume d'injection était de 10 ul. Le four à colonne a été réglée à 27 ° C et l'éluant a été contrôlé à 210, 254, 280, 300, 330 et 366 nm. Les temps de rétention, les zones de pointe et les spectres UV des pics majeurs ont été analysés. L'analyse HPLC a été réalisée dans le laboratoire de Phytothérapie, plantes médicinales Division, Institut de recherche forestière de Malaisie (FRIM), Kepong, Malaisie Les rats Sprague Dawley mâles d'animaux
expérimentaux (180-200 g;. 8-10 semaines anciens) ont été obtenus à partir de l'unité vétérinaire animale, Faculté de médecine vétérinaire, Université Putra Malaysia (UPM), la Malaisie et conservés à température ambiante (27 ± 2 ° C; 70-80% d'humidité; 12 h cycle lumière /obscurité) dans l'Unité des animaux Tenir, Faculté de médecine et sciences de la santé, UPM. Ils ont été alimentés avec de la nourriture et de l'eau ad libitum
depuis le début des expériences. Le protocole d'étude de la présente étude a été approuvée par la Chambre des animaux et l'utilisation Comité, Faculté de médecine et sciences de la santé, UPM (approbation éthique no: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00449). Les rats ont été traités conformément aux lignes directrices actuelles UPM pour le soin des animaux de laboratoire et les directives éthiques pour les enquêtes de la douleur expérimentale chez des animaux conscients [14]. Toutes les expériences ont été menées entre 09.30 et 18.30 h pour minimiser les effets des changements environnementaux. Le jeûne a été appliqué pendant 48 heures avant les essais où les rats ont été autorisés à avoir accès à l'eau seulement.
Détermination des mécanismes possibles de gastroprotection de MEMM de l'ulcération induite par Pylore ligature
ligature du pylore a été réalisée selon la la méthode de Shay et coll. [15] avec de légères modifications. Trente rats ont été répartis au hasard en 5 groupes (n = 6). Groupe I (contrôle) a été traitée avec un véhicule (10% de DMSO), Groupe II (contrôle positif, ranitidine) a été administré à 100 mg /kg (po), Groupe III, -IV et-V, les rats ont été traités avec MEMM (50, 250 et 500 mg /kg, respectivement). Ligature du pylore a été effectué 1 heure après l'administration des composés d'essai sur des rats à jeun 48 h. Chlorhydrate de kétamine (100 mg /kg par voie intramusculaire) et de chlorhydrate de xylazine (16 mg /kg par voie intramusculaire) ont été utilisés pour anesthésier les rats avant la ligature du pylore. A 2 cm de long incision a été pratiquée dans l'abdomen juste en dessous du sternum, sur les rats anesthésiés. L'estomac a été exposé, et un fil a été passé autour du sphincter pylorique et attaché dans un noeud serré. On a pris soin tout attacher le noeud pour éviter impliquant des vaisseaux sanguins dans le nœud. L'abdomen a été suturée, et la peau a été nettoyée de toutes les taches de sang ou des saignements. Les animaux ont été sacrifiés 6 h après la ligature par dislocation cervicale.
Détermination du volume, pH, acidité libre et totale du contenu gastrique
Les estomacs ont été enlevés, et le contenu ont été drainées, recueillis et centrifugés à 2500 rpm pendant 10 min. Le volume et le pH du suc gastrique a été mesurée et a été soumis à l'estimation de l'acidité libre et totale selon la méthode décrite par Srivastava et al. [16]. l'acidité libre est déterminée par titrage avec 0,01 hydroxyde de sodium (NaOH) avec un réactif orange de méthyle jusqu'à ce que la couleur de la solution devient jaune. Le volume de substance alcaline ajoutée a été notée. Ensuite, deux à trois gouttes de phénolphtaléine a été ajouté et la solution a été titrée jusqu'à ce qu'une couleur rose définie apparaît. Le volume total de NaOH ajouté a été noté ce qui correspond à l'acidité totale. Acidité a été calculé selon la formule suivante: $$ \\ mathrm {Acidité} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {de} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normalité} \\ kern0.5em \\ mathrm {de} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Estimation de l'estomac contenu mur de mucus
gastrique contenu paroi de mucus a été déterminée par la méthode décrite par Corne et coll. [17] avec de légères modifications. L'estomac a été ouvert le long de la grande courbure, pesés et immergés dans 10 ml de 0,1% de bleu Alcian dans 0,16 M /0,05 M d'acétate de sodium, le saccharose, pH 5,8 pendant 2 h. La teinture en excès est ensuite éliminé par deux lavages successifs dans 0,25 M de solution de saccharose (15 min chacun). Le colorant restant complexé avec le mucus gastrique ont été extraits avec 0,5 M de MgCl 2 pendant 2 h et agité par intermittence pendant 1 min dans chaque intervalle de 30 minutes. L'extrait a ensuite été secoué bleu vigoureusement avec un volume égal d'éther diéthylique, et l'émulsion résultante a été centrifugée à 3600 rpm pendant 10 min. L'absorbance (DO) de bleu Alcian dans la couche aqueuse a été lue à 580 nm en utilisant un spectrophotomètre. La quantité de bleu alcian extrait par estomac humide gramme a ensuite été calculé à partir d'une courbe standard.
Lésion de la muqueuse gastrique induite par l'éthanol chez les rats prétraités L-NAME
La participation de NO endogène dans la modulation du gastroprotective induite par l'éthanol l'activité a été déterminée selon la méthode de Andreo et al. [18], mais avec de légères modifications. Des rats mâles ont été divisés au hasard en douze groupes (n = 6) et jeûné pendant 24 h, mais libre accès à l'eau. Ils ont ensuite été pré-traitées avec une solution saline ou de L-NAME (70 mg /kg; un inhibiteur de la NO synthase) par voie intrapéritonéale (ip) et 30 minutes plus tard, les animaux ont reçu le véhicule (10% de DMSO), 100 mg /kg CBX (positif groupe témoin) ou 500 mg /kg MEMM (po). Une heure après l'administration des solutions d'essai, l'ulcère gastrique a été induite en utilisant 5 ml /kg d'éthanol absolu dans tous les groupes. D'autre part, la L-arginine (200 mg /kg) a été administré 30 minutes après le traitement du sérum physiologique ou le L-NAME et, suivi 30 minutes plus tard par l'administration d'éthanol. Tous les rats ont été sacrifiés 1 heure plus tard par une exposition à de l'éther diéthylique. L'estomac a été ouvert le long de la grande courbure pour déterminer la surface de l'ulcère (UA) comme décrit par Balan et al. [19]. La protection de pourcentage a été calculé selon la formule suivante: $$ \\ mathrm {Protection} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {commande} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {traité} \\ \\ mathrm {groupe} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {commande} \\ right)} rats \\ fois 100 \\% $$ induite par l'éthanol-lésion de la muqueuse gastrique chez NEM prétraité
Pour étudier l'implication du groupe sulfhydryle (SH) dans la modulation de l'activité gastroprotectrice induite par l'éthanol, les procédures décrites par Andreo et al. [18] ont été adoptés avec de légères modifications. Les rats ont été divisés au hasard en 12 groupes (n = 6) et jeûné pendant 24 h, mais libre accès à l'eau. L'expérience a commencé avec prétraitement (i.p.) de sérum physiologique ou de NEM (10 mg /kg), un groupe sulfhydryle (SH) bloquant. Trente minutes après le régiment de pré-traitement, les rats ont été administrés (po) avec un véhicule (DMSO à 10%), 100 mg /kg CBX (groupe témoin positif) ou 500 mg /kg MEMM suivie par l'administration de 5 ml /kg d'éthanol une heure plus tard pour induire des ulcères gastriques. Tous les animaux ont été sacrifiés 1 heure après avoir reçu de l'éthanol par exposition à de l'éther diéthylique. L'estomac a été enlevé et les lésions gastriques a été déterminée comme décrit ci-dessus
. L'analyse biochimique des tissus de l'estomac
Après les analyses macroscopiques, superoxyde dismutase (SOD) [20], la catalase (CAT) [21], myéloperoxydase (MPO) [22], la glutathion peroxydase (GTP) [23], de la glutathion réductase (RTG) [24] et les substances réagissant avec l'acide thiobarbiturique (TBARS) [25] les activités enzymatiques dans les tissus de l'estomac du rat ont été mesurés. La muqueuse gastrique a été gratté de la partie antrale de l'estomac à l'aide d'un grattoir et stocké à 4 ° C pour l'estimation biochimique. Mis au rebut la muqueuse gastrique a été soumis à préparer l'homogénéisât muqueuse (pH 7,2). L'homogénat a été ensuite centrifugé à 3000 tpm pendant 10 minutes et le surnageant obtenu a été utilisé pour une analyse de type anti-oxydant induit par l'éthanol sur la muqueuse gastrique dommages. Dans tous les essais de défense antioxydant, la ranitidine (100 mg /kg) Groupe -pretreated a été considéré comme le groupe témoin positif.
Détermination de l'activité de la SOD
L'activité de la SOD a été déterminée sur la base de l'inhibition de la formation de nicotinamide adénine dinucléotide, phénazine méthosulfate et amino bleu tétrazolium formazan [20]. Environ 0,5 ml d'homogénat de tissu ont été mélangés avec 0,4 ml d'éthanol et le mélange de chloroforme et on centrifuge. Au surnageant, le mélange d'essai (tampon de pyrophosphate de sodium (0,025 M, pH 8,3), nitrobleu de tétrazolium, le méthosulfate de phénazine et le nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH)) ont été ajoutés et mis à incuber à 30 ° C pendant 90 s. La réaction a été arrêtée par l'addition d'acide acétique glacial et mélangé avec n
-butanol. L'intensité de la couleur développée dans le butanol a été mesurée à 560 nm. L'activité SOD a été mesurée par le degré d'inhibition de cette réaction et est exprimée en millimole /min /mg de protéine.
Détermination de l'activité CAT
l'activité de la CAT a été dosée par colorimétrie à 620 nm comme décrit par le procédé de Sinha [21]. Le mélange réactionnel de 1,5 ml contenant 1,0 ml de tampon phosphate (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml de 2,0 M H 2 O 2 et 1,0 ml de tissu homogénat. La réaction a été stoppée par l'addition de 2,0 ml de réactif de l'acide acétique bichromate (5% de dichromate de potassium et un mélange d'acide acétique glacial dans un rapport de 1: 3). Les résultats sont exprimés en millimoles /min /mg de protéine.
Détermination de l'activité MPO
L'activité de la MPO a été mesurée selon la méthode décrite par Bradley et al. [22] mais avec de légères modifications. Les échantillons homogénéisés ont été congelés et décongelés trois fois et on centrifuge à 1500 g pendant 10 min à 40 ° C. Environ 100 ul du surnageant homogénéisé a été ajouté à 1,9 ml de 10 mmol /L de tampon phosphate (pH 6,0) et 1,0 ml de 1,5 mmol /chlorhydrate de LO-dianisidine contenant 0,0005% (p /v) H 2 O 2. L'absorbance a été évaluée à 450 nm sur un spectrophotomètre UV et l'activité de la MPO dans les tissus gastriques a été exprimée en pmol /min /mg de protéine.
Détermination de l'activité de GTP
L'activité de GTP a été mesurée par la méthode décrite par Rotruck et al. [23] avec de légères modifications. Le mélange réactionnel, qui contenait 0,2 ml de 0,4 M, tampon Tris - HCl, pH 7,0, 0,1 ml de 10 l'azoture de sodium mM, 0,2 ml d'homogénat de tissu (homogénéise le tissu dans un tampon de 0,4 M de Tris-HCl, pH 7,0), 0,2 ml de glutathion et 0,1 ml de 0,2 mM de peroxyde d'hydrogène a été ensuite mis en incubation à température ambiante pendant 10 min. La réaction a été arrêtée par l'addition de 0,4 ml de TCA à 10% et la soumission au processus de centrifugation. Le surnageant a été analysé pour déterminer la teneur en glutathion en utilisant le réactif Ellmans (19,8 mg de 5, 5 'benzoïque dithiobisnitro (DTNB) dans 100 ml de nitrate de sodium à 0,1%). Un coefficient d'extinction molaire de 6,22 × 103 umoles a été utilisé pour déterminer l'activité de la GTP. L'activité enzymatique a été exprimée en unités internationales d'activité enzymatique /g de protéine. unités internationales sont exprimées en micromoles de hydroperoxydes transformées /min /ml d'enzyme.
Détermination de l'activité RTG The niveau de RTG a été déterminée par la méthode de Ellman [24]. Approximately1.0 ml de surnageant a été traitée avec 0,5 ml de réactif Ellmans (19,8 mg de 5, 5 'benzoïque dithiobisnitro (DTNB) dans 100 ml de nitrate de sodium à 0,1%) et 3,0 ml de tampon phosphate (0,2 M, pH 8,0 ). L'absorbance a été lue à 412 nm et l'activité RTG a été exprimée en pmol /min /mg de tissu.
Dosage des TBARS
L'étendue de la LPO a été mesurée en analysant les niveaux de TBARS dans la muqueuse gastrique selon l' méthode précédente [25], mais avec des modifications mineures. 0,5 ml d'homogénat de tissu, 1,5 ml d'acide acétique à 20%, 0,2 ml de SDS et 1,5 ml de TBA ont été ajoutés. Le mélange était composé de 4 ml avec de l'eau distillée et on chauffe pendant 1 heure à 95 ° C. Après refroidissement, on a ajouté 4,0 ml de mélange de butanol-pyridine et bien secoués. Ce mélange a été ensuite centrifugé à 4000 tpm pendant 10 min. La couche organique a été prélevé et son absorbance a été lue à 532 nm et les résultats ont été exprimés sous forme de protéines nmoles /g.
Estimation de la protéine
la teneur en protéines dans le tissu gastrique a été estimée selon la méthode de Lowry et Al. [26], mais avec de légères modifications. L'échantillon de tissu et les normes (1,0 mg /ml de sérum-albumine bovine dans de l'eau distillée deux fois) dans des tubes différents ont été traités avec 5,0 ml d'un mélange réactif (48% de tartrate de potassium, de sodium, de sulfate de cuivre à 2% et du carbonate de sodium à 3% en 1h48 (v /v)). Ensuite Folin réactif au phénol (1: 2) a été ajouté au mélange réactionnel et on le laisse reposer pendant 30 min à température ambiante. La densité optique a été lue à 710 nm en utilisant l'eau comme réactif à blanc.
In vitro l'activité anti-inflammatoire de MEMM
In-vitro effet de MEMM sur l'oxyde nitrique
culture cellulaire et la stimulation The RAW 264.7 lignée cellulaire (macrophages monocytaires murines) (European Collection of Cell cultures, Porton Down, Royaume-Uni) a été maintenue dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 4,5 g /L de glucose, L-glutamine (2 mM), du pyruvate de sodium (1 mM), de la pénicilline (50 U /ml) et streptomycine (50 ug /ml) et 5% de CO 2 à 37 ° C. Les cellules (4 x 10 5 cellules /puits) ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits et incubées pendant 2 h à 37 ° C dans un CO 2 incubateur pour permettre la fixation des cellules, puis déclenché avec stimuli (100 U /ml d'IFN-g et de 5 pg /ml de LPS) avec ou sans la présence d'MEMM dans la concentration comprise entre 12,5 à 100 pg /ml. DMSO (véhicule) a été utilisé pour dissoudre le MEMM. La concentration finale de DMSO a été assurée à 0,1% dans toutes les cultures. Les cellules ont été ensuite incubées pendant 17-20 h à 37 ° C dans un CO 2 incubateur. NO détermination est effectuée en soumettant le surnageant de culture sur le dosage de Griess et les cellules restantes dans le puits ont été testées pour le dosage de la viabilité des cellules
détermination de la concentration de nitrite
de nitrite (NO 2 . - ), un métabolite stable de NO dans le milieu de culture, a été déterminée en utilisant le dosage de Griess [27]. Un volume égal de réactif de Griess a été mélangé avec le surnageant de culture et le développement de la couleur a été mesurée à 550 nm. La quantité de nitrites dans le surnageant de culture a été déterminée en se basant sur la courbe d'étalonnage d'un nitrite de sodium (0-100 uM) fraîchement préparée dans de l'eau déminéralisée. Pourcentage de la NO inhibition a été calculé en utilisant la formule suivante: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ où;
* Le contrôle est le niveau de l'IFN-γ /induite par le LPS groupe
viabilité cellulaire nitrite
La cytotoxicité de MEMM sur les cellules en culture a été déterminée par dosage de la réduction de 3. - (4,5-diméthyl-2-thiazolyl) -2,5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) [27]. Les réactifs de MTT (0,05 mg /ml) ont été mises en suspension dans du PBS stérile, pH 7,0 et ensuite ajoutés dans chaque puits à la suite de l'élimination du surnageant. Ceci a été suivi par l'incubation des cellules restantes à 37 ° C pendant 4 h, suivi par l'addition de 100 ul de DMSO à 100% dans les puits pour dissoudre les sels de formazan formés. L'absorbance a été mesurée à 570 nm. Le pourcentage de viabilité des cellules a été calculée selon la formule suivante: $$ \\ mathrm {cellule} \\ \\ mathrm {viabilité} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {commande}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {échantillon}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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