Механизмы gastroprotection метанола экстракт листьев меластома малабарская

Механизмы gastroprotection метанола экстракта меластома малабарская
листьев
Абстрактный фон

меластома малабарская
L. (Melastomaceae) представляет собой небольшой кустарник с различными использования в медицинских целях. Настоящее исследование было проведено с целью определения гастрозащитных механизмов метанола экстракта М. malabathricum
листьев (MEMM) у крыс.
Методы
механизмы экстракта из gastroprotection в (50, 250, 500 мг /кг) были изучены с помощью привратника-лигирование в крысиной модели, где объем, pH, свободный и общая кислотность желудочного сока и содержание желудка стенки слизи были определены. Были измерены также Участие эндогенной окиси азота (NO), и сульфгидрильные (SH) соединений в гастропротекторного эффекта MEMM. MEMM подвергали антиоксиданта,
противовоспалительное и фитохимических анализ и ВЭЖХ анализ. Результаты
MEMM содержали различные фито-компоненты с кверцитрин идентифицируется как часть их. MEMM и кверцитрин: я) существенно (р &л; 0,05) уменьшение объема и кислотности желудочного сока при одновременном повышении рН и желудочного содержимого стенки слизи .; б) существенно (р &л; 0,05) повышение уровня СОД, ГТФ и GTR при этом существенно (р &л; 0,05) снижение уровня CAT, MPO и TBARS деятельности .; III), оказываемое гастропротекторный активность при оценке с использованием этанола-индуцированной язвенной болезни желудка анализа, который было отменено N G-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME, ингибитор NO-синтазы) и N
- этилмалеимид (NEM, сульфгидрильную (SH) блокатор). MEMM ингибирует липоксигеназы (LOX) и ксантиноксидазы деятельности (XO) с самым высоким сродством к бывшим в то время как кверцитрин показали высокое сродство к XO активности.
Выводы
MEMM демонстрировали гастропротекторный активность частично объясняется наличием кверцитрина, его антиоксидантным и противовоспалительной активностью, а также с помощью модуляции NO и SH групп.
Ключевые слова
меластома малабарская
Melastomaceae Метанол экстракт гастропротекторного механизмы окись азота сульфгидрильных группа антиоксидант противовоспалительные фон
Язвенная язвы распространенное заболевание всего желудочно-кишечного тракта. Из почти 8 до 10% мирового населения, пострадавшего от язвенной болезни, примерно 5% из них страдают от язвы желудка [1]. Язвы, которые влияют на желудочно-кишечную систему, как правило, усугубляется несоразмерность деструктивных и защитных факторов в желудке [1]. Несмотря на то, рассматривается как многофакторное заболевание, как правило, признается, что почти все пептической язвы связаны с инфекцией Helicobacter Pylori
и главной терапевтической целью является искоренение H. Pylori
инфекции. В настоящее время в первой линии медицинского лечения язвенной болезни желудка направлена ​​на искоренение H. Pylori
инфекции и, как правило, на основе тройной процедуры лечения, которая включает использование ингибиторов желудочной язвой (т.е. гистаминовые H <югу> 2-антагонисты, протонов накачать ингибиторы или сукральфат и висмут) в сочетании с двумя типами антибиотиков [2]. Тем не менее, тот факт, что существуют и другие, чем хеликобактерной
различные факторы, которые могут вызвать образование язвы желудка не следует игнорировать [3]. Различные подходы были использованы при лечении язвы желудка, связанные с этими не-Н. Pylori
такие факторы, о связанных как снижение секреции кислоты и увеличивая выработку слизи, но эти подходы рассматривались в качестве терапии второй линии.
Несмотря на свою эффективность в ликвидации H. Pylori
, лечение является сложным и высокая стоимость, включающий использование по крайней мере двух антибиотиков в сочетании с ингибиторами желудочной кислоты. Такое сочетание часто вызывает несколько нежелательных побочных эффектов (т.е. устойчивость к антибиотикам, рецидив, тошнота) [2,3]. Несмотря на то, что H. Pylori
инфекции постепенно сужался на протяжении большинства промышленно развитых стран, постепенное увеличение недостаточности антихеликобактерной
ликвидации лечения наблюдается в других местах [2]. Это еще больше ухудшат ассоциацией этих стандартных противоязвенных агентов с различными нежелательными побочными эффектами. С учетом их разнообразных побочных эффектов и возникновения H. Pylori
штаммов, устойчивых к антибиотикам, поиск новых и безопасных без антибиотиков гастрозащитных веществ из природных источников, в частности, растения, продолжают расти во всем мире [2, 4].
Одна из растений, которые используются для лечения язвы желудка в Малайзии меластома малабарская
L. (семейство Melastomaceae). Локально известно малайцем как "Senduduk
', М. malabathricum
встречается в изобилии в Индийском океане острове, по всей Южной и Юго-Восточной Азии, Тайваня, Китая, Южной части Тихого океана и Австралии. Различные части растения используются в традиционных малайских лекарственных средств для лечения различных заболеваний с листьями, в частности, были использованы для лечения язвы желудка среди других [5]. С научной точки зрения, то М. malabathricum
части, как сообщается, проявляют различные фармакологические активности [5-7]. Помимо своей традиционной использования в качестве противоязвенного агента, М. malabathricum
был выбран в настоящем исследовании, на основании того, что он является одним из самых известных трав в Малайском лекарственного фольклора, но получил недостаток внимания среди сообщества. Кроме того, М. malabathricum
Сообщалось, что содержат большое общее содержание фенольных и оказывать высокой антиоксидантной и противовоспалительной активностью [5-7], которые играют важную роль в механизмах противоязвенная любых соединений /экстрактов. Хорошо известно, что язва желудка, в частности, индуцируют этанолом, связано с образованием активных форм кислорода. Этанол быстро проникает в слизистую оболочку желудка, как он способен растворять защитные слизистый и вызывает высвобождение гидропероксиалкенкарбоновой свободных радикалов и супероксид-аниона. Эти свободные радикалы вызывают увеличение окислительного стресса в тканях, что, в свою очередь, повышает уровень малонового диальдегида, маркера повышенной перекисного окисления липидов. В целом, этанол-индуцированную вредное воздействие может проявляться непосредственно через генерации активных метаболитов или опосредованно через активацию других механизмов, которые в конечном счете вызывают окислительное повреждение [7]. Следовательно, экстракты /соединения с активностью антиоксидантов играют очень важную роль в этих продувочного свободные радикалы и ингибировать перекисное окисление липидов. Вместо этого, М. malabathricum
Сообщалось, что оказывает замечательный антиоксидантной активностью [7], и, следовательно, как полагают, обладают противоязвенной потенциалом. Наш ранее скрининг метанола экстракта M. malabathricum
(MEMM) для противоязвенной потенциала против этанол- и индометацин-индуцированной модели язвенной болезни желудка было сообщено в другом месте [8]. MEMM был найден ослаблена этанол-индуцированную, но при отягчающих обстоятельствах, желудочный образование язвы индометацин-индуцированной. Способность MEMM оказывать как gastroprotection и противовоспалительной активностью [5] В отличие от этого индометацина, которое только оказывал противовоспалительное действие. Это наблюдение позволяет предположить, что экстракт активизирует gastroprotection с помощью механизма, который не связан с, что анти-воспаления. Кроме того, противовоспалительное активность MEMM, возможно, возможно, отличалась от той, оказываемого индометацина. Являясь ингибитором обоих Coxs (т.е. ЦОГ-1 и ЦОГ-2), индометацин является более селективным по отношению СОХ-1, который необходим для поддержания защитной слизистой оболочки желудка слой [9]. Способность MEMM интенсифицировать формирование язвенной болезни желудка индометацин-индуцированной предположить, что MEMM может также ингибировать ЦОГ-1 действие и препятствуют образованию конститутивной PG, которые помогают защитить слизистую оболочку желудка среди других. С другой стороны, способность MEMM оказывать противовоспалительное действие может быть из-за его способности ингибировать ЦОГ-2-зависимый ответ, связанный с тестом отека лапы каррагенан-индуцированного крыс [5; 9]. Кроме этого, MEMM также может работать Противоположно путем активации ЦОГ-2, что приводит к увеличению PGE <суб> 2 синтеза, о котором сообщалось оказывают противовоспалительную активность путем связывания с одним из его рецепторов, рецептор ПГЕ 4 (ЕР <к югу от> 4) [10]. Кроме того, ПГЕ <суб> 2, как известно, является предшественником для формирования циклопентенона простагландинов (cyPG), который оказывает противовоспалительное [11]. Кроме того, способность активировать PGE <суб> 2 синтеза, который, в свою очередь, увеличивает выработку слизи в желудке, может происходить посредством активации EP <подразделам> 3 рецепторов [10]. Это может снова помочь объяснить способность MEMM демонстрировать противовоспалительную активность в то время как, в то же время, оказывают противоязвенной активностью против этанол-, но не индометацин-индуцированной модели. Несмотря на эти предложения, ни одной попытки не было сделано, чтобы определить возможные механизмы gastroprotection из MEMM, которые могут быть использованы для объяснения наблюдаемого противоязвенной активностью.
Принимая во внимание вышеупомянутый доклад [8], а другой доклады, сделанные Хуссейн и другие. [6], которые оценивали противоязвенного потенциал водного экстракта М. malabathricum
используя только одну модель язвенной болезни желудка (т.е. этанол-индуцированной модели), текущее исследование были конструкции. Хотя М. malabathricum
никогда не была использована при лечении инфекции H. Pylori
, которая поддерживается его плохой антибактериальной активностью [12,13], традиционного использования растения для лечения язвенной болезни желудка оправдано исследование присутствия с надеждой найти альтернативный /натуральный гастропротекторный агент в качестве замены имеющихся в настоящее время воздействие обнажая препаратов побочных, используемых в терапии второй линии. Принимая во внимание этот факт, настоящее исследование с целью изучить на возможных механизмах gastroprotection из MEMM с использованием различных моделей крыс.
Методы
Химические вещества
Химические вещества, используемые в настоящем исследовании, аналитических оценок и были подготовлены непосредственно перед использованием. Были использованы следующие препараты: ранитидин (Sigma Aldrich, США), кверцитрин (Sigma Aldrich, США), абсолютный этанол (Fischer Scientific, США), N-этилмалеимид (NEM) (Sigma-Aldrich, США), N G -нитро-L-аргинина метиловый эфир (L-NAME) (Sigma-Aldrich, США), карбеноксолон (CBX) (Sigma-Aldrich, США) и диэтиловый эфир (Fischer Scientific, США).
сбор растительного сырья и подготовка из MEMM
листьев M. malabathricum
были собраны в период с августа по сентябрь 2010 года с Серданг, Селангор, Малайзия, и были определены ботаник из Института биологических наук (IBS), Universiti Putra Малайзии (ОНД), Серданг, Селангор, Малайзия. Чековый образец, ACP-0017, был депонирован в Гербарии IBS, ОНД, Малайзии. Наземные сухих листьев (40 г) пропитывали три раза при комнатной температуре в течение 24 ч с метанолом в соотношении 1:20 (вес /объем), и метанол слой выпаривали (40 ° С) при пониженном давлении досуха в результате чего что соответствует выходу 12,8 г сушат и липким метанол экстракт (процент дали был ≈ 32%).
фитохимический скрининг и ВЭЖХ-анализ MEMM
Фитохимические скрининг и ВЭЖХ-анализ MEMM проводили в соответствии с ранее описанным способом [ ,,,0],7]. Фитохимическое скрининг MEMM проводилось с целью определения наличия флавоноиды, тритерпены, дубильные вещества, алкалоиды и сапонины в соответствии с обычными протоколами, как описано below.i) Флавоноиды


Около 10,0 г MEMM была отдельно вареные в течение от 2 до 3 мин в 100 мл воды в водяной бане. К 3 мл фильтрата 3 мл кислотного спирта (этанол: вода: концентрированная соляная кислота в соотношении 1: 1: 1) добавляли твердый магний (1 см) и 1 мл трет-амилового спирта. Смеси затем наблюдали за розово-оранжевого или нарушающей цвета change.ii) Тритерпены


Примерно 1,0 г MEMM был отдельно экстрагируют в течение 24 ч в эфире. 1 мл фильтрата выпаривают досуха, а остаток снова растворяют в нескольких каплях уксусного ангидрида, а затем несколько капель серной кислоты добавляли к раствору. Смеси затем наблюдали для зеленого цвета change.iii) таннины


Примерно 0,2 г MEMM была отдельно отваривают в 5 мл воды. Смеси охлаждали и фильтровали. Несколько капель (3 капли) 5% -ного раствора хлорида трехвалентного железа добавляли к фильтрату и наблюдали за сине-черный осадок formation.iv) Алкалоиды


Примерно 0,5 г MEMM была отдельно сваренный с 10 мл разбавленной соляной кислоты (спиртового) в пробирке в течение 5 мин. Смеси охлаждали и мусор давали отстояться. Каждый из надосадочной жидкости фильтровали в другую пробирку и 1 мл каждого фильтрата было принято, в который добавляли три капли реагента Dragendorff (в калия висмут йодистого раствора), встряхивают и наблюдают появление оранжево-красного пятна и осадка formation.v) Сапонины


Примерно 0,2 г MEMM встряхивают с водой, и смесь наблюдали за стойкой пене.
анализ ВЭЖХ MEMM проводили в соответствии с предыдущим докладе [4 ], но с небольшими изменениями. Вкратце, MEMM (10 мг) суспендируют в 1 мл метанола. Раствор пропускали через патрон фильтра (размер пор 0,45 мкм) до анализа. Отфильтрованный образец анализировали с использованием ВЭЖХ-системы, состоящей из Delta Waters 600, 600 контроллер, фотодиодным детектором (Waters 996). И Phenomenex Luna (5 мкм) (Торранс, штат Калифорния, США) колонка (4,6 мм внутренний диаметр × 250 мм). Два растворители обозначенные как А и В были использованы для элюирования компонентов. А была 0,1% -ного водного раствора муравьиной кислоты и В был ацетонитрил. Начальные условия 95% А и 5% В с линейным градиентом достигает 25% B при Т =
12 мин, и это состояние поддерживали в течение 8 мин. В была уменьшена обратно до 15% при Т = 22
мин и выдерживают при этих условиях в течение еще 8 мин (т
= 30 мин). При Т =
35 мин, программа возвращается к исходному составу растворителя. Скорость потока использовали 1,0 мл /мин и объем ввода 10 мкл. Колонку печь была установлена ​​на уровне 27 ° С и элюент контролировали при 210, 254, 280, 300, 330 и 366 нм. Время удерживания, площади пиков и УФ-спектры основных пиков были проанализированы. Анализ ВЭЖХ проводили в лаборатории фитомедицины, лекарственных растений Отдел, НИИ леса Малайзии (Frim), Kepong, Малайзия
экспериментальных животных
самцов Sprague Dawley крыс (180-200 г; 8-10. недель) были получены из отдела ветеринарной животных, факультет ветеринарной медицины, Университет Путра Малайзии (ОНД), Малайзии и выдерживают при комнатной температуре (27 ± 2 ° с; влажность 70-80%; 12 ч свет /темнота цикла) в Холдинг животноводческого, факультет медицины и наук о здоровье, УПМ. Они были обеспечены пищей и водой в неограниченном количестве
с начала экспериментов. Изучение протокола настоящего исследования был одобрен Палатой и использованию животных комитета факультета медицины и наук о здоровье, ОНД (Ethical утверждение №: УПМ /FPSK /КОВРИКИ /BR-UUH /00449). Крысы были обработаны в соответствии с действующими руководящими принципами UPM по уходу за лабораторными животными и этических принципов для исследований экспериментальной боли в сознании животных [14]. Были проведены все эксперименты между 09.30 и 18.30 ч для сведения к минимуму воздействия изменений окружающей среды. Голодание применялся в течение 48 ч до всех анализов, в котором крысы были разрешен доступ только к воде.
Определение возможных механизмов gastroprotection из MEMM
привратника лигирования индуцированных изъязвлением
привратника лигирование было проведено в соответствии с метод, с помощью Шей и др. [15], с небольшими изменениями. Тридцать крыс случайным образом разделены на 5 групп (N = 6). Группа-I (контроль) обрабатывали наполнителем (10% ДМСО), Группа II (положительный контроль, ранитидин) принимался в дозе 100 мг /кг (перорально), III группы, -IV и-V, крыс обрабатывали MEMM (50, 250 и 500 мг /кг, соответственно). Привратника лигирования проводили через 1 ч после введения испытуемых соединений на 48 часов голоданию крыс. Кетамин HCl (100 мг /кг, внутримышечно) и ксилазин HCl (16 мг /кг, внутримышечно), были использованы для анестезию крыс перед лигированием привратника. Предусмотрено наличие 2 см длиной надрез в брюшной полости чуть ниже грудины на анестезированных крыс. Желудок был разоблачен, и нить пропускают вокруг пилорического сфинктера и завязаны в тугой узел. Были приняты меры, в то время как связывать себя узами брака, чтобы избежать вовлечения кровеносных сосудов в узле. Живот зашивали, а кожа была очищена от каких-либо пятен крови или кровотечения. Животных забивали через 6 ч после перевязки шейным смещением.
Определение объема, рН, свободной и полной кислотности желудочного содержимого
желудки были удалены, и содержимое сливают, собирали и центрифугировали при 2500 оборотах в минуту в течение 10 мин. Измеряли объем и рН желудочного сока и подвергали свободной и полной оценки кислотности в соответствии с методом, описанным Сриваставы и соавт. [16]. Свободная кислотность определяют титрованием с 0,01 н раствором гидроксида натрия (NaOH) с метилоранжа реагентом, пока цвет раствора не стал желтоватый. Объем щелочи Добавили отмечено. Затем добавляют две-три капли фенолфталеина и раствор титруют до тех пор, пока не появится определенный розовый цвет. Общий объем NaOH добавляют было отмечено, что соответствует общей кислотности. Кислотность рассчитывается по следующей формуле: $$ \\ mathrm {кислотностью} = \\ гидроразрыва {\\ mathrm {тома} \\ kern0.5em \\ mathrm {из} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ раз \\ mathrm {нормальность} \\ kern0.5em \\ mathrm {из} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ раз 100} {0,1} \\ mathrm {т} \\ mathrm {е} \\ mathrm {д} /1 $$ Оценка желудочного содержимого стенки слизистого
Желудочный содержание стенки слизью определяли по методу, описанному Корн и соавт. [17], с небольшими изменениями. Желудок был открыт вдоль большой кривизны, взвешивают и погружают в 10 мл 0,1% -ного Альциановый сини в 0,16 М сахарозы /0,05 М ацетата натрия, рН 5,8 в течение 2 ч. Чрезмерная краситель затем удаляли с помощью двух последовательных промывок в 0,25 М растворе сахарозы (15 мин каждый). Оставшийся краситель образует комплекс с желудочной слизи экстрагировали 0,5 М MgCl <суб> 2 в течение 2 ч и встряхивают с перерывами в течение 1 мин в каждом 30-минутного интервала. Синий экстракт затем энергично встряхивают с равным объемом диэтилового эфира, и полученную эмульсию центрифугируют со скоростью 3600 оборотов в минуту в течение 10 мин. Оптическую плотность (ОП) Альциановый синего в водном слое считывали при 580 нм с использованием спектрофотометра. Количество Альциановый синего экстракта на грамм влажного желудка затем рассчитывали по стандартной кривой.
Этанол слизистой желудка поражение в L-NAME, предварительно обработанных крыс
Участие эндогенного NO в модуляции Этанол-индуцированной гастропротекторного активность определяли в соответствии с методом Андрео и соавт. [18], но с небольшими изменениями. Использовали самцов крыс были случайным образом разделены на двенадцать групп (n = 6) и голодали в течение 24 ч, но свободный доступ к воде. Затем они были предварительно обработаны физиологическим раствором или L-NAME (70 мг /кг, ингибитор NO-синтазы) внутрибрюшинно (IP) и через 30 мин, полученные животные транспортного средства (10% ДМСО), 100 мг /кг CBX (положительный контрольная группа) или 500 мг /кг MEMM (п.о.). Через один час после введения тестируемых растворов, язва желудка индуцировали с помощью 5 мл /кг абсолютного этанола во всех группах. С другой стороны, L-аргинин (200 мг /кг) вводили, 30 мин после того, как физиологический раствор или L-NAME лечения и, а затем 30 мин путем введения этанола. Все крысы были умерщвлены 1 ч позже воздействием диэтилового эфира. Желудок был открыт вдоль большой кривизны, чтобы определить области язвы (UA), как описано Балан и др. [19]. Процент защиты был рассчитан по следующей формуле: $$ \\ mathrm {Защита} \\ влево (\\% \\ справа) = \\ гидроразрыва {\\ влево (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {управление} \\ HBox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {р} \\ mathrm {г} \\ mathrm {е} \\ HBox {-} \\ mathrm {лечение} \\ \\ mathrm {группа} \\ справа)} {\\ влево (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {управление} \\ справа)} \\ раз 100 \\% $$ Этанол-индуцированного поражения слизистой оболочки желудка в NEM предварительно обработанных крыс
Чтобы исследовать участие сульфгидрильных (SH) группы в модуляции этанол-индуцированной активности гастропротекторного, методикам, описанным Андрео и др. [18] были приняты с незначительными изменениями. Крысы были случайным образом разделены на 12 групп (n = 6) и голодали в течение 24 ч, но свободный доступ к воде. Эксперимент начался с предварительной обработкой (внутрибрюшинно) физиологического раствора или NEM (10 мг /кг), сульфогидрилсодержащим (SH-) блокатор. Тридцать минут после того, как полка предварительной обработки крыс вводили (перорально) с носителем (10% ДМСО), 100 мг /кг CBX (положительный контроль) или 500 мг /кг MEMM с последующим введением 5 мл /кг этанола час спустя, чтобы вызвать язвы желудка. Все животные были умерщвлены через 1 ч после приема этанола воздействием диэтилового эфира. Удаляли желудок и повреждение желудка определяли как
описано выше. Биохимический анализ тканей желудка
После макроскопические анализы, супероксиддисмутаза (СОД) [20], каталазы (САТ) [21], активность миелопероксидазы (МРО) [22], глутатионпероксидазы (GTP) [23], глутатион-редуктазы (GTR) [24] и реактивных соединений тиобарбитуровой кислоты (ТБК) [25] активности ферментов в тканях желудка крысы были измерены. Слизистой оболочки желудка соскабливают из антрального отдела желудка с использованием скребок и хранят при температуре 4 ° С для биохимической оценки. Слом слизистая оболочка желудка была подвергнута подготовке слизистого гомогената (рН 7,2). Затем гомогенат центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин и полученный супернатант использовали для анализа антиоксидантной типа на этаноле индуцированное повреждение слизистой оболочки желудка. Во всех анализах антиоксидантными обороны, ранитидин (100 мг /кг) -pretreated группа рассматривалась в качестве положительной контрольной группы.
Определение активности СОД
Активность СОД определяли на основании ингибирования образования никотинамид аденин динуклеотид, феназинметосульфат и аминокислотного тетразолия формазана [20]. Приблизительно 0,5 мл гомогената ткани смешивают с 0,4 мл этанола и хлороформа смесь и центрифугируют. К надосадочной жидкости, смесь для анализа (пирофосфат натрия буфера (0,025 М, рН 8,3), тетразола, феназинметосульфата и восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH)) добавляли и инкубировали при 30 ° С в течение 90 сек. Реакцию останавливали добавлением ледяной уксусной кислоты и смешивают с н-бутанола
. Интенсивность цвета, разработанной в бутанола измеряли при 560 нм. СОД активность определяли степень ингибирования этой реакции, и выражается в ммоль /мин /мг белка.
Определение активности CAT
Активность КАТ анализировали колориметрическим методом при длине волны 620 нм, как описано методом Синха [21]. Реакционную смесь 1,5 мл раствора, содержащего 1,0 мл фосфатного буфера (0,01 М, рН 7,0), 0,4 мл 2,0 М Н <суб> 2O <суб> 2 и 1,0 мл гомогената ткани. Реакцию останавливали добавлением 2,0 мл кислотного реагента бихромата-уксусная (5% бихромата калия и ледяной смеси уксусной кислоты в соотношении 1: 3). Результаты выражены в виде ммоль /мин /мг белка.
Определение активности МРО
Активность МРО определяли в соответствии со способом, описанным Брэдли и др. [22], но с небольшими изменениями. Гомогенизированные образцы замораживают и оттаивают в течение трех раз, и центрифугировали при 1500 г в течение 10 мин при 40 ° C. Примерно 100 мкл гомогенизированного супернатанта добавляли 1,9 мл 10 ммоль /л фосфатного буфера (рН 6,0) и 1,0 мл 1,5 ммоль /ЛО-дианизидин гидрохлорид, содержащий 0,0005% (вес /об) Н <суб> 2O <суб> 2. Оптическую оценивали при 450 нм на УФ-спектрофотометре и активность МРО в желудочном тканях был выражен в виде мкмолей /мин /мг белка.
Определение активности GTP
Активность GTP измеряли по методу, описанному Rotruck и другие. [23], с небольшими изменениями. Реакционную смесь, которая содержала 0,2 мл 0,4 М Трис - буфер HCl, рН 7,0, 0,1 мл 10 мМ азида натрия, 0,2 мл гомогената ткани (усредненной ткани в 0,4 М Трис-HCl, рН 7,0), 0,2 мл глутатиона и 0,1 мл 0,2 мМ пероксида водорода затем инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Реакцию останавливали добавлением 0,4 мл 10% ТСА и подчинением процесса центрифугирования. Супернатант анализировали на содержание глутатиона с помощью Ellmans реагента (19.8 мг 5, 5'-dithiobisnitro бензойной кислоты (ДТНБ) в 100 мл 0,1% нитрата натрия). Молярный коэффициент экстинкции 6,22 × 103 мкмоль использовали для определения активности GTP. Высказывалось активность фермента в международных единицах ферментативной активности /г белка. Международные единицы выражены как мкмоля гидроперекисей трансформированных /мин /мл фермента.
Определение активности GTR
Уровень GTR был определен методом Ellman [24]. Approximately1.0 мл надосадочной жидкости обрабатывали 0,5 мл реагента Ellmans (19,8 мг 5, 5'-dithiobisnitro бензойной кислоты (ДТНБ) в 100 мл 0,1% нитрата натрия) и 3,0 мл фосфатного буфера (0,2 М, рН 8,0 ). Оптическую плотность считывали при 412 нм и выражали НТР активность как мкмолей /мин /мг ткани.
Определение содержания TBARS
от степени ПОЛ измеряли с помощью анализа уровней ТБК в слизистой оболочке желудка в соответствии с предыдущий метод [25], но с незначительными изменениями. К 0,5 мл гомогената ткани, 1,5 мл 20% -ной уксусной кислоты, 0,2 мл SDS и 1,5 мл ТВА были добавлены. Смесь доводили до 4 мл дистиллированной воды и нагревали в течение 1 ч при температуре 95 ° С. После охлаждения добавляют 4,0 мл бутанола-пиридина и смесь хорошо взбалтывают. Затем эту смесь центрифугировали при 4000 оборотах в минуту в течение 10 мин. Органический слой отдел ли и его абсорбцию при 532 нм, и результаты выражали в виде н моль /г белка.
Оценки белок
оценивалась Содержание белка в желудочной ткани в соответствии с методом Lowry ЕТ и др. [26], но с небольшими изменениями. Образец ткани и стандарты (1,0 мг /мл бычьего сывороточного альбумина в дважды дистиллированной воде) в различных пробирках обрабатывали 5,0 мл реактива смеси (48% тартрата калия натрия, 2% сульфата меди и 3% -ным раствором карбоната натрия в 1:48 (об /об)). Затем Фолин фенол реагент (1: 2) добавляют к реакционной смеси, и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность считывали при 710 нм с использованием воды в качестве реагента бланка.
В пробирке противовоспалительной активности MEMM
Экстракорпоральное эффекта MEMM на оксид азота
клеточной культуре и стимуляции
Необработанные 264,7 линия клеток (мышиные моноцитов макрофаги) (Европейская коллекция культур клеток, Портон Даун, Великобритания) был выдержан в среде DMEM, дополненной 10% ФБС, 4,5 г /л глюкозы, L-глутамина (2 мМ), пируват натрия (1 мМ), пенициллин (50 ед /мл) и стрептомицин (50 мкг /мл) и 5% СО <суб> 2 при 37 ° С. Клетки (4 × 10 5 клеток /лунку) засевали в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° С в СО <суб> 2 инкубатор, чтобы позволить прикрепление клеток, а затем срабатывает с стимулы (100 ед /мл ИФН-г и 5 мкг /мл LPS) с или без присутствия MEMM в концентрации от 12.5-100 мкг /мл. ДМСО (транспортное средство) используют для растворения MEMM. Конечная концентрация ДМСО была обеспечена до 0,1% во всех культурах. Затем клетки инкубировали в течение 17-20 ч при 37 ° С в СО <суб> 2 инкубаторе. NO определение не проводили, подвергая культивируемых супернатант против анализа Грисса и клетки, остающиеся в скважине были протестированы на жизнеспособность клеток анализа
нитритов определение
Концентрация нитрита (NO <югу> 2 . - ), стабильный метаболит NO в культуральной среде, определяли с помощью анализа Griess [27]. Равный объем реагента Грисса смешивали с культурального супернатанта и развитие окраски измеряли при длине волны 550 нм. Количество нитрита в культуральной надосадочной жидкости определяли на основании стандартной кривой нитрита натрия (0-100 мкМ) свежеприготовленного в деионизированной воде. Процент ингибирования NO рассчитывали по следующей формуле: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ где;
* контроль уровень нитритов IFN-gamma /LPS-индуцированной группы
жизнеспособности клеток
цитотоксичности MEMM на культуре клеток определяли путем анализа сокращения 3. - (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид (МТТ) [27]. МТТ реагенты (0,05 мг /мл) суспендировали в стерильном PBS, рН 7,0, а затем добавляли в каждую лунку после удаления надосадочной жидкости. За этим последовала инкубация остальных клеток при 37 ° С в течение 4 ч с последующим добавлением 100 мкл 100% ДМСО в лунки для растворения формазана соли, образованные. Измеряли оптическую плотность при длине волны 570 нм. Процент жизнеспособности клеток рассчитывали по следующей формуле: $$ \\ mathrm {Cell} \\ \\ mathrm {жизнеспособность} \\ влево (\\% \\ справа) = \\ гидроразрыва {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {управление}} * \\ HBox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {пример}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Новый метод, цифровое сканирование генома обнаруживает усиление гена KRAS в рака желудка: вовлечение гиперэксп…
• Геномный анализ профиля диффузного типа желудочной cancers