Mechanizmai gastroprotection metanolio ekstrakto Melastoma malabathricum leaves

mechanizmų gastroprotection metanolio ekstrakto Melastoma malabathricum
palieka
tezės
Background
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) yra nedidelis krūmas su įvairių vaistų naudojimo. Šis tyrimas buvo
atliekami siekiant nustatyti gastritas mechanizmus metanolio ekstrakto M. malabathricum pervežimas lapai (MEMM) žiurkėms. Metodai Viesbutis The ekstraktą mechanizmų gastroprotection (50, 250, 500 mg /kg) buvo tiriami naudojant fazė prievartyje-perrišimas žiurkių modelį, kuriame tūris, pH nemokama ir bendrasis rūgštingumas, skrandžio sulčių ir skrandžio sienelės gleivinės turinys buvo nustatytas. Į endogeninę azoto oksido (NO) ir sulfhidrilas (SH) junginių gastroprotektinio poveikio MEMM dalyvavimas taip pat buvo matuojamas. MEMM buvo atliktas į antioksidantas, rezultatai
MEMM priešuždegiminių ir phytochemical analizė ir HPLC profiliavimas.
Pateikta įvairių fitosanitarijos komponentų, quercitrin identifikuojamos kaip dalis jų. MEMM ir quercitrin: i) žymiai (p < 0,05) sumažino apimtis ir skrandžio sulčių rūgštingumą, o didinant pH ir skrandžio sienelės gleivių turinys .; ii) žymiai (p < 0,05) padidėjo SOD, GTP ir GTR lygį tuo pačiu žymiai (p < 0,05) sumažino CAT, MPO ir TBARS veiklos lygį, .; iii) darė gastritas veiklą, kai vertinama naudojant etanolio sukeliamo skrandžio opa tyrimą, kuris buvo atstatomi N G-nitro-L-argininas metilo esterių (L-pavadinimas; NO sintezės inhibitorius) ir N UAB - ethylmaleimide (NEM; sulfhidrilo (SH) blokatorius). MEMM slopino lipoksigenazę (lox) ir ksantino oksidazės (XO) veikla, su aukščiausios afinitetas buvęs, o quercitrin parodė didelį afinitetą XO veiklos.
Išvadas
MEMM eksponuojami gastritas veikla iš dalies dėl į quercitrin akivaizdoje, jos antioksidantas ir anti-uždegiminių veikla, o per NO ir SH grupių moduliavimą.
Raktiniai žodžiai
Melastoma malabathricum
Melastomaceae Metanolis išgauti gastritas mechanizmus Azoto oksidas sulfhidrilines grupė antioksidantas priešuždegiminiai faktai
opos yra bendra sutrikimas visą virškinimo trakte. Iš beveik 8-10% iš pasaulio gyventojų paveiktos skrandžio opos, maždaug 5% iš jų kenčia nuo skrandžio opos [1]. Į opos, kurios turi įtakos virškinimo sistemą paprastai apsunkina neproporcingas destruktyvių ir gynybinių veiksnių skrandyje [1]. Nors laikoma daugiaveiksnio liga, tai yra visuotinai pripažinta, kad beveik visi pepsinės opos yra susijęs su Helicobacter pylori
ir didžiausią terapinį tikslą infekcijos išnaikinti H. pylori
infekcija. Šiuo metu pirmos eilės gydymo skrandžio opa yra skirta panaikinti H. pylori
infekcija ir paprastai grindžiama triguba valymo procedūrą, kuri dalyvauja skrandžio opos inhibitorių vartojimą (ty histamino H 2-antagonistai, protonų siurblio inhibitoriai, arba sukralfatas ir bismuto) kartu su dviejų tipų antibiotikų [2]. Tačiau tai, kad yra ir kitų, nei H. pylori
įvairių veiksnių, kurie gali sukelti skrandžio opa formavimas neturėtų būti ignoruojami [3]. Įvairūs metodai buvo naudojami skrandžio opa, susijusios su tos ne H gydymui. pylori
"susiję veiksniai, tokie kaip sumažinti rūgšties sekreciją ir didinti gleivių gamybą, tačiau šie metodai buvo laikomi antros eilės gydymui.
Nepaisant jų veiksmingumo H. pylori pašalinti
, gydymas yra sudėtingas ir Brangios, įtraukiant ne mažiau kaip dviejų antibiotikų vartojimas kartu su skrandžio rūgšties inhibitoriais. Šis derinys dažnai sukelia keletą nepageidaujamą šalutinį poveikį (pvz atsparumą antibiotikams, pasikartojimo, pykinimas) [2,3]. Nepaisant to, kad H. pylori
infekcijos pamažu sumažėjo visoje išsivysčiusiose šalyse dauguma, palaipsniui didinti nesėkme H. pylori
likvidavimo procedūros pastebima ir kitur [2]. Tai yra dar viena pablogės šių standartinių priešopinius agentų su įvairių nepageidaujamų šalutinių poveikių asociacijos. Atsižvelgiant į jų įvairių neigiamų padarinių ir antibiotikams atsparių H. pylori
padermių atsiradimo, ieškant naujų ir saugių ne antibiotikų gastritas agentų iš natūralių šaltinių, ypač augalai, toliau didės visame pasaulyje [2, 4].
Vienas iš augalų, kurie naudojami gydyti skrandžio opa Malaizijoje yra Melastoma malabathricum
L. (šeimos Melastomaceae). Vietoje žinoma malajiečių kaip "Senduduk
" M. malabathricum
randama gausiai Indijos vandenyno sala, visoje Pietų ir Pietryčių Azijoje, Taivane, Kinijoje, Pietų Ramusis vandenynas ir Australija. Įvairios augalo dalys yra naudojami malajiečių tradicinių vaistų gydyti negalavimų su lapų įvairovė, visų pirma, buvo naudojamas gydyti skrandžio opas, be kita ko [5]. Moksliškai M. malabathricum
dalys buvo pranešta eksponuoti įvairių farmakologinių veiklą [5-7]. Išskyrus savo tradicinės naudoti kaip priešopinius agentas M. malabathricum
buvo pasirinkta šio tyrimo, remiantis tuo, kad jis yra vienas iš žinomų žolelių malajiečių vaistinio folkloro, bet gavo dėmesio stoką tarp bendruomenės. Be to, M. malabathricum
buvo pranešta, kad yra didelis bendras fenolio turinį ir daryti aukštos antioksidantas ir anti-uždegiminių veikla [5-7], kurie yra svarbus priešopinius bet junginių /ekstraktų mechanizmus. Ji yra gerai žinoma, kad skrandžio opa, ypač sukelti etanoliu, yra susijęs su ROS kartos. Etanolis greitai įsiskverbia į skrandžio gleivinę, nes ji gali soliubilizuotų apsaugines gleives ir sukelia hydroperoxy-laisvuosius radikalus ir superoksido anijono išsiskyrimą. Šie laisvieji radikalai sukelti į oksidacinio streso padidėjimas audiniuose, kuris savo ruožtu, padidina malondialdehido lygį, padidėjusio lipidų peroksidacijos žymeklį. Apskritai, etanolis sukeltas žalingas poveikis gali pasireikšti tiesiogiai per kartos reaktyviųjų metabolitų arba netiesiogiai per aktyvinimo kitais mechanizmais, kurie galiausiai sukelti oksidacinį žalą [7]. Taigi, ekstraktai /junginiai su antioksidantais veiklos vaidina labai svarbų vaidmenį prapūtimo tuos laisvuosius radikalus ir slopina lipidų peroksidacijos. Vietoj to, M. malabathricum
buvo pranešta daryti nepaprastą antioksidacinį aktyvumą [7], todėl, kaip manoma, turi priešopinius potencialą. Mūsų anksčiau atranka metanolio ekstrakto M. malabathricum
(MEMM) už priešopinius potencialo prieš etanolį ir indometacino sukelta skrandžio opa modelių buvo pranešta kitur [8]. MEMM buvo nustatyta, kad sumažinti etanolio-sukeltas, bet apsunkina indometacino-sukeltas, skrandžio opa išsidėstymą. Iš MEMM galintys išvystyti tiek gastroprotection ir anti-uždegiminių veiklą [5] yra priešingai, kad indometacinas,, kuris tik kuria anti-uždegimo aktyvumą. Šis pastebėjimas, atrodo, rodo, kad ekstraktas aktyvina gastroprotection per mechanizmą, kuris nėra susietas su, kad anti-uždegimas. Be to, priešuždegiminis aktyvumas MEMM galbūt skyrėsi nuo pavaizduoto daromo indometacino. Yra jų abiejų Coxs (t.y. COX-1 ir COX-2) inhibitorius, indometacino yra daugiau selektyvus COX-1, kuris reikalingas išlaikyti apsauginį skrandžio gleivinės sluoksnį [9]. Iš MEMM gebėjimas intensyviau indometacino sukelta skrandžio opa formavimas rodo, kad MEMM taip pat gali nuslopinti COG-1 veiksmas ir kištis į steigiamąjį PG formavimo kad padės apsaugoti skrandžio gleivinę ir kt. Kita vertus, MEMM galintys išvystyti priešuždegiminį veiklą gali būti dėl jos gebėjimas slopinti COX-2-priklausomą atsaką, susietą su karageninas sukeltos žiurkės JV edema kriterijaus [5; 9]. Išskyrus, kad MEMM taip pat gali dirbti priešingai aktyvuojant, COX-2, todėl padidinti PGE 2 sintezė, kurią pranešta daryti priešuždegiminiu veiklą, prisijungdamas prie vienos iš jo receptorius, The PGE receptorių 4 (EP 4) [10]. Be to, PGE 2 buvo žinoma, kad už ciklopentenono prostaglandinų (cyPG), kad daro anti-uždegiminių [11] formavimo pirmtakas. Be to, galimybė įjungti PGE 2 sintezę, kuris savo ruožtu didina skrandžio gleivių gamybą, gali atsirasti per EP 3 receptorių [10] aktyvacijos. Tai gali vėl padėti paaiškinti MEMM gebėjimą pademonstruoti anti-uždegimo aktyvumą, o, tuo pačiu metu, daro priešopinius veiklą prieš etanolį, bet ne indometacino sukeltas modelį. Nepaisant šių pasiūlymų ne bandymas buvo atliktas siekiant nustatyti galimus mechanizmus gastroprotection iš MEMM, kurie gali būti naudojami paaiškinti pastebėtą priešopinius veiklą.
Atsižvelgiant į pirmiau minėtą ataskaitą [8] ir kitą, Hussain ataskaitos ir kt. [6], kuris įvertino priešopinius potencialą vandeninio ekstrakto M. malabathricum
naudojant tik vieną modelį skrandžio opa (t etanolio sukeliamo modelis), dabartinis tyrimas buvo dizaino. Nors M. malabathricum
niekada nebuvo naudojamas H. pylori
infekcija, kurią remia savo prastos antibakteriniu veiklos [12,13], tradicinio naudojimo augalų dėl skrandžio opa gydymo pateisinamas gydymo buvimas tyrimai su viltimi rasti alternatyvų /natūralus gastritas agentas, kaip pakeisti į šiuo metu turimų šalutinis poveikis-Baring narkotikų naudojamų antros eilės gydymui. Atsižvelgiant į šį faktą, dabartinį tyrimą, kurio tikslas ištirti dėl galimų mechanizmų gastroprotection iš MEMM naudojant modelius įvairių žiurkėms.
Metodai
Chemija
naudojami šiame tyrime chemikalai yra analitinių klasėse ir buvo parengtas iš karto prieš naudojimą. buvo naudojami šie vaistai: ranitidinas (Sigma-Aldrich, JAV), quercitrin (Sigma-Aldrich, JAV), absoliutus etanolis (Fischer mokslo, JAV), N-ethylmaleimide (NEM) (Sigma-Aldrich, JAV), N G -nitro-L-argininas metilo esteriai (L-PAVADINIMAS) (Sigma-Aldrich, JAV), karbenoksolonas (CBX) (Sigma-Aldrich, JAV) ir dietilo eteris (Fischer mokslo, JAV).
augalinės medžiagos surinkimas ir paruošimas iš MEMM
lapų M. malabathricum
buvo renkami tarp rugpjūčio ir rugsėjo, nuo 2010 m Serdang, Selangor, Malaizija, ir atpažįstami pagal botanikas nuo biologijos instituto (IBS), Universiti Putra Malaizija (UPM) Serdangas, Selangor, Malaizija. Kuponą pavyzdys, ACP-0017, buvo deponuotas ties TVM, UPM, Malaizija Herbariumas. Grunto džiovinti lapai (40 g) buvo panardinti tris kartus kambario temperatūroje 24 h su metanolio į 1:20 santykiu (m /t) ir metanolio supernatantas išgarintas (40 ° C), esant sumažintam slėgiui iki sausumo todėl iš 12,8 g derlius džiovinamas ir lipnus metanolis ekstraktas (procentais davė buvo ≈ 32%).
phytochemical atranka ir HPLC analizė MEMM
phytochemical atranka ir HPLC analizė MEMM buvo atliktas pagal anksčiau pranešė metodas [ ,,,0],7]. Phytochemical atranka MEMM buvo atliktas siekiant nustatyti flavonoidų, triterpenų, taninų, alkaloidų ir saponinų buvimą pagal įprastinių protokolų, kaip aprašyta below.i) Flavonoidai
Maždaug 10,0 g MEMM buvo virti atskirai nuo 2 iki 3 min 100 ml vandens labai vandens vonioje. 3 ml filtrato, 3 ml rūgšties-alkoholio (etanolio: Vanduo: koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties santykiu nuo 1: 1: 1), kietas magnio (1 cm), 1 ml t-amilo-alkoholio buvo pridėta. Tuomet mišiniai buvo pastebėtas rose oranžinės arba pažeidžia spalvų change.ii) triterpenų
Maždaug 1,0 g MEMM buvo išgauti atskirai 24 h eteryje. 1 ml filtrato buvo išgarinamas iki sausumo, o liekana ištirpinama keletą lašų acto rūgšties anhidrido ir tada kelis kartus lašuose sulfato rūgšties buvo pridėta į tirpalą. Tuomet mišiniai buvo pastebėtas už žalios spalvos change.iii) Taninai
Maždaug 0,2 g MEMM buvo atskirai virti 5 ml vandens. Mišiniai buvo atšaldomas ir filtruojamas. Keli lašai (3 lašų) yra 5% geležies chlorido tirpalo buvo įtraukta į filtrato ir stebėti mėlyna-juoda nuosėdų formation.iv) alkaloidai
Maždaug 0,5 g MEMM buvo atskirai virti su 10 ml praskiesta druskos rūgštimi (alkoholio) į mėgintuvėlį 5 min. Mišiniai buvo atšaldomas ir nuolaužos buvo leista nusistovėti. Kiekvienas paviršinio skysčių filtruojamas į kitą mėgintuvėlį ir buvo priimtas į kurią buvo įtraukta, sukrėtė ir pastebėjo už oranžinės-raudonos dėmės ir nuosėdos išvaizdos trys lašai Dragendorfo reagentu (kalio bismuto jodido tirpalo) 1 ml kiekvieno filtrato formation.v) saponinai
Maždaug 0,2 g MEMM buvo sumaišomas su vandeniu ir mišinys buvo pastebėtas už nuolatinį puta.
HPLC analizė MEMM buvo atlikta pagal ankstesnėje ataskaitoje [4 ] bet su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, MEMM (10 mg), buvo sustabdytas 1 ml metanolio. Tirpalas praleistas per filtravimo kasetės (porų dydis 0,45 mkm) prieš analizę. Filtruotas mėginys buvo analizuojamas naudojant HPLC sistemą, susidedančią iš vandenų Delta 600 600 kontrolierius, fotodiodo matricos detektoriumi (vandenys 996). Ir Phenomenex Luna (5 mkm) (Torrance, Kalifornija, JAV), kolonėlė (4,6 mm vidinio skersmens × 250 mm). Du tirpikliai šį elementą žymi kaip A ir B buvo naudojami eliuavimo iš sudedamųjų dalių. A. buvo 0,1% vandeninio skruzdžių rūgšties ir B buvo acetonitrilo. Pradinės sąlygos buvo 95% A ir 5% B produktą su gradiento pasiekė B esant t
= 12 min 25% ir ši sąlyga buvo išlaikyta 8 min. B buvo sumažintas atgal iki 15% esant t pervežimas = 22 min palaikoma ši sąlyga kitam 8 min (t pervežimas = 30 min). Esant t
= 35 min, programa grąžintas į pradinę tirpalo sudėtį. Srautas buvo naudojamas 1,0 ml /min injekcijos tūris buvo 10 mikrol. Stulpelis krosnis buvo nustatytas 27 ° C, o eliuentas buvo stebimas 210, 254, 280, 300, 330 ir 366 nm bangos ilgiui. buvo analizuojami pagal sulaikymo trukmes, smailių plotai ir UV spektrai iš pagrindinių viršūnių. HPLC analizė buvo atlikta atsižvelgiant į Phytomedicine, Vaistiniai augalai skyrius, miško tyrimų institutas Malaizija (FRIM), Kepong, Malaizija
eksperimentinių gyvūnų
Vyras Sprague Dawley žiurkės (180-200 g laboratorijos. 8-10 savaičių) buvo gauti iš veterinarijos gyvūnų skyriaus, Veterinarinės medicinos fakultetas, Universiti Putra Malaizija (UPM), Malaizija ir saugomi pagal kambario temperatūroje (27 ± 2 ° C; 70-80% drėgnumo; 12 val šviesa /tamsa ciklu) gyvūnų laikymo skyrius, medicinos fakultetas ir sveikatos mokslų UPM. Jie buvo tiekiami su maistu ir vandeniu ad libitum
iš eksperimentams pradžioje. Tyrimo protokolas Šio tyrimo buvo patvirtintas Gyvūnų namai ir naudojimo komitetas Medicinos fakulteto ir sveikatos mokslų, UPM (Etikos patvirtinimo numeris: UPM /FPSK /pads /BR-UUH /00449). Žiurkės buvo tvarkomi laikantis dabartinių UPM gaires dėl laboratorinių gyvūnų ir etikos gairių priežiūrą tyrimų eksperimentinės skausmas Sąmonę turinčių gyvūnų [14]. Visi eksperimentai buvo atliekami tarp 09.30 ir 18.30 val siekiant sumažinti aplinkos pokyčių poveikį. Pasninkas buvo taikomas 48 val anksto visiems tyrimams, kur žiurkės buvo leista susipažinti tik su vandeniu.
Nustatymas galimas mechanizmų gastroprotection iš MEMM
fazė prievartyje ligavimo sukeltos opų
fazė prievartyje perrišimas buvo atliekamas pagal Iš Shay et al metodas. [15] su nedideliais pakeitimais. Trisdešimt žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į 5 grupes (n = 6). Grupė-I (reguliuojamas) buvo gydomi transporto priemonės (10% DMSO), grupė-II (teigiama kontrolė, ranitidinas) buvo suteiktas 100 mg /kg kūno svorio (PO), grupė-II, III,-iv ir-V, žiurkės buvo gydomi MEMM (50, 250 ir 500 mg /kg kūno svorio, atitinkamai). Fazė prievartyje ligavimo buvo atliktas 1H po to, kai bandymų junginių 48 h nevalgiusius žiurkės administravimo. Ketamino HCl (100 mg /kg kūno svorio, į raumenis) ir ksilazinas HCl (16 mg /kg kūno svorio, į raumenis) buvo naudojamas Anestezēt žiurkes prieš ligavimui fazė prievartyje. 2 cm ilgio pjūvis buvo atliktas pilvo tiesiog žemiau krūtinkaulio apie anestezuotoms žiurkėms. Skrandis buvo veikiami, ir sriegis buvo priimtas aplink prievarčio sfinkterio ir sąlygotosios į įtemptą mazgas. Pasirūpinta, o susiejimas mazgas išvengti įtraukiant kraujagysles mazgas. Pilvas buvo susiūtas, ir oda buvo nuvalyti bet kokius kraujo dėmės ar kraujavimas. Gyvūnai buvo paaukota 6 h po perrišimas pagal slankstelių dislokaciją.
Nustatymas tūrio, pH, laisvo ir bendro rūgštingumo skrandžio turiniu Viesbutis The skrandžiams buvo pašalintas, o turinys buvo išsikrovęs, surinkti ir centrifuguojamas 2500 aps 10 min. Apimtis ir pH skrandžio sulčių buvo matuojamas ir buvo atliktas laisvo ir bendro rūgštingumo vertinimo pagal metodą, aprašytą Srivastava et al. [16]. Laisvųjų rūgščių buvo nustatytas titruojant, su 0,01 N natrio hidroksido (NaOH) su metiloranžinio reagento, kol tirpalo spalva tapo gelsvas. Šarmo įpilta buvo pažymėta. Tada du tris lašus fenolftaleino buvo įtraukta ir tirpalas titruojamas kol pasirodys neabejotinas rausvos spalvos. Bendras tūris NaOH pridėtinės buvo pažymėta, ir tai atitinka bendrą rūgštingumą. Rūgštingumas buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: $$ \\ textrm {rūgštingumo} = \\ frac {\\ textrm {tomas} \\ kern0.5em \\ textrm {iš} \\ kern0.5em \\ textrm {NaOH} \\ times \\ textrm {normalumas} \\ kern0.5em \\ textrm {iš} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ kartų 100} {0,1} \\ textrm {m} \\ textrm {e} \\ textrm {Q} /1 $$ įvertinimas skrandžio sienos gleivių kiekis
Skrandžio sienelę gleivių turinys buvo nustatytas taikant metodą, aprašytą Corne et al. [17] su nedideliais pakeitimais. Skrandžio buvo atidarytas išilgai didesnio kreivumo, pasverti, ir panardintas į 10 ml 0,1% Alcian mėlynos 0,16 M sacharozės /0,05 M natrio acetato, pH 5.8 2 h. tada per didelis dažų buvo pašalintas nuo dviejų iš eilės skalavimų 0,25 M sacharozės tirpale (15 min kiekvienas). Likusi dažų kompleksinis junginys su skrandžio gleivių buvo ekstrahuojamas 0,5 M MgCl 2 2 val ir purtomas su pertrūkiais tam tikrų 1 min kiekvienoje 30 min intervalu. tada mėlyna ekstraktas buvo stipriai kratoma su tokio paties tūrio dietilo eterio ir dėl to emulsija buvo centrifuguojamas esant 3600 apsisukimų per minutę 10 min. Absorbcija (OT) Alcian mėlynos vandeninio sluoksnio buvo skaityti 580 nm, naudojant spektrofotometru. Iš Alcian Blue kiekis išgauti vienam gramui šlapio skrandžio tada buvo apskaičiuojamas iš standartinės kreivės.
Etanolis sukeltas skrandžio gleivinės pažeidimas L-name iš anksto žiurkes Viesbutis The endogeninio NO dalyvavimas moduliuoja etanolio sukeliamo gastritas veiklą nulėmė pagal Andreo et al metodu. [18], bet su nedideliais pakeitimais. Vyrai žiurkės buvo atsitiktiniu būdu suskirstytos į dvylika grupių (n = 6) ir badavusios 24 h, tačiau leidžiama laisvai patekti į vandens. Jie buvo tada iš anksto apdorotas su fiziologiniu tirpalu arba L-vardas (70 mg /kg; NO sintazės inhibitoriaus) į pilvo ertmę (IP) ir 30 min vėliau, gautas gyvūnai transporto priemonė (10% DMSO), 100 mg /kg kūno svorio CBX (teigiamas kontrolinė grupė) arba 500 mg /kg, MEMM (PO). Ir vieną valandą po bandymo sprendimų administravimo, skrandžio opa buvo sukeltas naudojant 5 ml /kg absoliučiame etanolyje visose grupėse. Kita vertus, L-argininas (200 mg /kg kūno svorio dozė), 30 minutės po fiziologinio tirpalo arba L-PAVADINIMAS gydymui ir, po 30 min vėliau etanolio administravimo. Visi žiurkės buvo paaukotas 1 val vėliau ekspozicija dietilo eteriu. Skrandžio buvo atidarytas išilgai didesnio kreivumo, siekiant nustatyti, kad opa plotas (UA), kaip aprašyta pagal Balan et al. [19]. Procentinis apsauga buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: $$ \\ mathrm {apsauga} \\ kairę (\\% \\ dešinėje) = \\ frac {\\ kairę (\\ textrm {U} \\ textrm {a} \\ \\ textrm {kontrolė} \\ hbox {-} \\ textrm {U} \\ textrm {a} \\ \\ textrm {p} \\ textrm {R} \\ textrm {e} \\ hbox {-} \\ textrm {elgiamasi} \\ \\ textrm {grupė} \\ right)} {\\ kairę (\\ textrm {U} \\ textrm {a} \\ \\ textrm {kontrolė} \\ right)} \\ kartų 100 \\% $$ Etanolis sukeltas skrandžio gleivinės pažeidimas ir NEM anksto žiurkes
ištirti dalyvavimas iš sulfhidrilines (SH) grupei priklausančių etanolio-sukeltas gastroprotektinio veiklos moduliavimo, procedūros aprašyta Andreo ir kt. [18] buvo priimtos su nedideliais pakeitimais. Žiurkėms buvo atsitiktiniu būdu suskirstytos į 12 grupių (n = 6) ir badavusios 24 h, tačiau leidžiama laisvai patekti į vandens. Eksperimentas prasidėjo paruošiamasis apdorojimas (i.p.) druskingo ar NEM (10 mg /kg), su sulfhidrilines (SH-) blokatorius. Trisdešimt minutės po to, kai iš anksto gydymo pulko, žiurkės buvo skiriami (PO) su transporto priemonės (10% DMSO), 100 mg /kg kūno svorio CBX (teigiamas kontrolinė grupė) arba 500 mg /kg MEMM, ir po to 5 ml /kg etanolio administravimo valanda vėliau sukelti skrandžio opų. Visi gyvūnai buvo paaukotas 1 val gavusi Etanolio poveikiui dietilo eteriu. Skrandis buvo pašalintas ir skrandžio žala buvo nustatyta, kaip aprašyta aukščiau.
Biocheminės analizės skrandžio audinių
Po Makroskopiniu analizes, superoksido dismutazės (SOD) [20], katalazės (CAT) [21], myeloperoxidase (MPO) [22], glutationo peroksidazės (GTF) [23], glutationo reduktazės (VTT) [24] ir tiobarbitūro rūgšties reaguojančios medžiagos (TBARS) [25] fermentų veikla žiurkėms skrandžio audinių buvo matuojamas. Skrandžio gleivinės buvo mėšlą iš antralinių dalį skrandžio, naudojant scrapper ir saugomi 4 ° C temperatūroje biocheminių nustatymui. Atsisakyti skrandžio gleivinės buvo atliktas paruošti gleivinės homogenatą (pH 7,2). tada Homogenatas centrifuguojamas esant 3000 apsisukimų per minutę 10 min ir gautas supernatantas buvo naudojamas antioksidantų tipo analizės etanolio kiekio sukeltas skrandžio gleivinės pažeidimas. Visose antioksidantų apsaugos tyrimų, ranitidinas (100 mg /kg kūno svorio) -pretreated grupė buvo laikomas teigiamu kontroliniu grupės.
Nustatymas SOD aktyvumo
SOD aktyvumą buvo nustatomas, remiantis nikotinamido adenino formavimo slopinimo dinukleotidas, fenazino methosulfate ir amino mėlyna tetrazolio formazano [20]. Maždaug 0,5 ml audinių homogenato buvo sumaišyti su 0,4 ml etanolio ir chloroformo mišinyje ir centrifuguojamas. Supernatanto, tyrimas mišinys (natrio pirofosfatas buferis (0,025 M, pH 8,3), nitrotetrazolio tetrazolio, fenazino methosulphate ir sumažinta nikotinamido adenino dinukleotido (NADH)) buvo pridėta ir inkubuojami 30 ° C temperatūroje 90 s. Reakcija buvo sustabdyta pridėjus ledinės acto rūgšties ir maišyti su n
-butanol. Spalvotų sukurta butanolio intensyvumas buvo matuojamas esant 560 nm bangos ilgiui. SOD aktyvumas buvo matuojamas pagal inhibavimo šiai reakcijai laipsnis ir yra išreikštas millimole /min /mg baltymo.
Nustatymas CAT veiklos
jos kačių veiklą buvo tirta kolorimetriškai 620 nm bangos ilgiui, kaip aprašyta metodo Sinha [21]. Reakcijos mišinys 1,5 ml, kurių sudėtyje yra 1,0 ml fosfato buferinio tirpalo (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml 2,0 M H 2O 2 ir 1,0 ml audinio homogenato. Reakcija buvo sustabdė 2,0 ml dichromato-acto rūgšties reagento (5% kalio dichromatu ir ledine acto rūgšties mišinio santykiu nuo 1: 3). Rezultatai išreiškiami millimole /min /mg baltymo.
Nustatymas MPO veiklos
OF MPO aktyvumas buvo matuojamas pagal aprašytą metodą Bradley et al. [22], bet su nedideliais pakeitimais. Homogenizuoto mėginiai buvo užšaldyti ir atšildyti tris kartus ir centrifuguojamas 1500 g 10 min 40 ° C temperatūroje. Maždaug 100 pL homogenizuoto supernatanto buvo įtraukta į 1,9 ml 10 mmol /l fosfato buferio (pH 6,0) ir 1,0 ml 1,5 mmol /LO-dianisidine hidrochloridas, kurio sudėtyje yra 0,0005% (m /t) H 2O 2. Absorbcija buvo įvertinta 450 nm dėl UV spektrofotometru ir MPO veiklos skrandžio audinių buvo išreikštas μmoles /min /mg baltymo.
Nustatymas GTP veiklos
GTP aktyvumas buvo matuojamas aprašytą metodą Rotruck ir kt. [23] su nedideliais pakeitimais. Reakcijos mišinys, kuriame yra 0,2 ml 0,4 M, tri - HCl buferis, pH 7,0, 0,1 ml 10 mM natrio azido, 0,2 ml audinių homogenato (homogenizuotas audinį 0,4 M Tris-HCl buferiniame tirpale, pH 7,0), 0,2 ml glutationo ir 0,1 ml 0,2 mM vandenilio peroksido tada buvo inkubuojamos kambario temperatūroje 10 min. Reakcija buvo sustabdyta pridėjus 0,4 ml 10% TBS ir paklusnumą to į centrifugavimo proceso. Supernatantas buvo tirta už glutationo kiekis naudojant Ellmans reagento (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro benzoinės rūgšties (DTNB) 100 ml 0,1% natrio nitrato). Moliniu ekstinkcijos koeficientą 6.22 × 103 mikromoliai buvo naudojamas siekiant nustatyti GTP veiklą. Fermento aktyvumą ir buvo išreikštas tarptautinių vienetų fermentų aktyvumo /g baltymų. Tarptautiniai vienetai išreiškiami taip μmoles apie hydroperoxides transformuotų /min /ml fermento.
Nustatymas GTR veiklos Viesbutis The iš GTR lygis buvo nustatomas pagal Ellman metodas [24]. Approximately1.0 ml supernatanto buvo gydomi 0,5 ml Ellmans reagento (19,8 mg iš 5, 5'-dithiobisnitro benzoinės rūgšties (DTNB) 100 ml 0,1% natrio nitrato) ir 3,0 ml fosfatinio buferinio tirpalo (0,2 M, pH 8,0 ). Absorbcija buvo skaityti 412 nm ir GTR veikla buvo išreikštas μmoles /min /mg audinio.
Nustatymas TBARS turinio
iš lipidų peroksidacijos tiek, kiek buvo matuojamas analizuojant TBARS lygį skrandžio gleivinės, pagal Ankstesnis metodas [25], bet su nedidelėmis pataisomis. Iki 0,5 ml audinių homogenato, 1,5 ml 20% acto rūgšties, 0,2 ml SDS ir 1,5 ml TBA buvo pridėta. Mišinys buvo pagamintas iki 4 ml distiliuoto vandens ir kaitinamas 1 valandą, esant 95 ° C temperatūroje. Po aušinimo, 4,0 ml butanolio-piridino mišinio buvo įtraukta ir gerai sukratyti. tada šis mišinys centrifuguojamas esant 4000 apsisukimų per minutę 10 min. Organinis sluoksnis buvo imtasi, ir jo optinis tankis buvo skaityti 532 nm ir rezultatai buvo išreikštas n mol /g baltymų.
Apskaičiavimas baltymų
Baltymų kiekis skrandžio audinio buvo apskaičiuota pagal Lowry et metodu Al. [26], bet su nedideliais pakeitimais. Audinių mėginys ir standartai (1,0 mg /ml jaučio serumo albuminas dvigubas distiliuotame vandenyje) skirtingose ​​vamzdžių buvo gydomi 5,0 ml reagento mišinio (48% natrio kalio tartrato, 2% vario sulfato ir 3% natrio karbonato 1:48 (v /v)). Tada Folin fenolis reagentas (1: 2) buvo įtraukta į reakcijos mišinį ir leidžiama nusistovėti 30 min kambario temperatūroje. Optinis tankis buvo skaityti 710 nm, naudojant vandenį kaip tuščiasis reagentas.
In vitro priešuždegiminis aktyvumas MEMM
In vitro poveikį MEMM apie azoto oksido pervežimas ląstelių kultūroje, stimuliacijos Viesbutis The RAW 264.7 ląstelių linija (pelių monocitine makrofagai) (Europos rinkimas ląstelių kultūrų, Porton žemyn, JK) buvo stabilus DMEM papildytas 10% FBS, 4,5 g /l gliukozės, L-glutaminas (2 mm), natrio piruvato (1 mm), penicilino (50 V /ml) ir streptomicino (50 mikrogramų /ml) ir 5% CO 2 37 ° C temperatūroje. Ląstelės (4 × 10 5 ląstelių /gerai) buvo pasėjamos į 96-šulinėlių plokštelės ir inkubuojami 2 h, esant 37 ° C temperatūroje, CO 2 inkubatorių, kad būtų galima ląstelių priedą, ir tada aktyvuojamas dirgiklius (IFN-g 100 V /ml ir 5 mikrogramai /ml LPS) su ar be jo MEMM buvimą koncentracijos svyruoja tarp 12,5-100 mikrogramai /ml. DMSO (transporto priemonė) buvo naudojamas, kad ištirptų MEMM. buvo užtikrintas galutinė koncentracija DMSO būti 0,1% visose kultūrose. tada ląstelės buvo inkubuojamos 17-20 h, esant 37 ° C temperatūroje, CO 2 inkubatorių. NO nustatymas buvo atliktas pajungiant kultūringas plūduriuojančio skysčio prieš Griess tyrimo ir ląstelės likę šulinio buvo išbandytas ląstelių gyvybingumo tyrimą
Nitritinė ryžtą
nitritų koncentracija (NO 2 . - ), stabili metabolitas NO ir mitybinės terpės, buvo nustatoma naudojant Griess tyrimą [27]. Tokį patį tūrį Griess reagentu buvo sumaišyti su kultūros supernatanto ir spalvos išryškinimo buvo matuojamas esant 550 nm bangos ilgiui. Nitrito kiekis kultūros supernatanto buvo nustatomas remiantis standartine kreive iš natrio nitrito (0-100 mikromolių) šviežiai paruošto į dejonizuoto vandens. Procentas NO slopinimas buvo apskaičiuojamas pagal formulę žemiau: $$ \\ textrm {NE} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ kur;
* kontrolė yra nitritai lygis IFN-gama /LPS sukeltos GROUP UAB ląstelių gyvybingumas
iš MEMM citotoksiškumo apie išaugintų ląstelių buvo nustatytas tiriant iš 3 sumažėjimas. - (4,5-dimetil-2-tiazolilas) -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromidas (MTT) [27]. MTT reagentai (0,05 mg /ml) buvo sustabdytos steriliu PBS,, pH 7,0 ir po to pridedama į kiekvieną šulinėlį po to, pašalinant supernatantą. Tai buvo po to likusių ląstelių inkubacijos 37 ° C temperatūroje iki 4 h, po kurio 100 pL 100% DMSO to į šulinius, kad ištirptų formazano druskos, susidariusios. Absorbcija buvo matuojamas esant 570 nm bangos ilgiui. Ląstelių gyvybingumo procentinę dalį buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: $$ \\ textrm {Mobilusis} \\ \\ textrm {gyvybingumas} \\ kairę (\\% \\ dešinėje) = \\ frac {\\ textrm {P} {\\ textrm {D}} _ {\\ textrm {kontrolė}} * \\ hbox {-} \\ textrm {P} {\\ textrm {D}} _ {\\ textrm {pavyzdys}}} {\\ textrm {P} {\\ textrm {D}} _ Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Naujų metodas, skaitmeninis genomo nuskaitymo aptinka KRAS geno amplifikacija skrandžio vėžio: dalyvavimą ekspresija laukinio tipo KRAS į vartotojų signalizacijos ir vėžio ląstelių augimą
• Genomo aprašymą analizė difuzinis tipo skrandžio vėžio