Mechanismen van gastroprotection methanol extract van Melastoma malabathricum leaves

Mechanismen van gastroprotection methanol extract van Melastoma malabathricum
verlaat
Abstracte achtergrond
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) is een kleine struik met verschillende medicinale toepassingen.
Deze studie werd uitgevoerd om de mechanismen gastrobeschermende methanol extract van M. malabathricum
bladeren (MEMM) bij ratten te bepalen. Werkwijzen
mechanismen van gastroprotection Het extract's (50, 250, 500 mg /kg) werden bestudeerd met behulp van de pylorus-ligatie in rat model, waarin volume, pH, vrij en totaal zuurgraad van maagsap en maagwand slijm inhoud bepaald. De betrokkenheid van endogene stikstofoxide (NO) en sulfhydryl (SH) verbindingen gastrobeschermende het effect van MEMM werden ook gemeten. MEMM werd onderworpen aan antioxidant, anti-inflammatoire en fytochemische analyse en HPLC profilering.
Resultaten
MEMM bevatte verschillende fyto-vluchtige bestanddelen die quercitrin geïdentificeerd als deel daarvan. MEMM en quercitrin: i) significant (p < 0,05) verlaagde het volume en de zuurgraad van maagsap tegelijk de pH en maagwand slijm inhoud .; ii) significant (p < 0,05) steeg het niveau van de SOD, GTP en GTR, terwijl significant (p < 0,05) het niveau van CAT, MPO en TBARS activiteiten verminderd .; iii) uitgeoefend maagbeschermende activiteit wanneer vastgesteld met behulp van ethanol geïnduceerde maagzweer assay die werd omgekeerd door N G-nitro-L-arginine methyl esters (L-NAME, een remmer van NO synthase) en N Catawiki - ethylmaleimide (NEM, een sulfhydryl (SH) blocker). MEMM remde de lipoxygenase (LOX) en xanthine-oxidase (XO) met de grootste affiniteit voor het voormalige terwijl quercitrin vertoonden hoge affiniteit voor XO activiteit.
Conclusies
MEMM vertoonde een maagbeschermende activiteit deels de aanwezigheid van quercitrine, haar anti-oxidant en anti-inflammatoire activiteiten, en via de modulatie van NO en SH-groepen.
Sleutelwoorden
Melastoma malabathricum
Melastomaceae Methanol extract gastrobeschermende mechanismen Stikstofmonoxide sulfhydrylgroep antioxidant anti-inflammatoire Achtergrond
maagzweren zijn een veel voorkomende aandoening van het gehele maagdarmkanaal. Van bijna 8 tot 10% van de wereldbevolking getroffen door maagzweren, ongeveer 5% van hen lijdt aan maagzweren [1]. De zweren die het maagdarmkanaal beïnvloeden gewoonlijk verergerd door een wanverhouding tussen destructieve en defensieve factoren in de maag [1]. Hoewel beschouwd als multifactoriële ziekte, wordt algemeen erkend dat bijna alle maagzweren zijn verbonden met de infectie van Helicobacter pylori Kopen en grote therapeutische doel de H. pylori-infectie
roeien. Momenteel is de eerste lijn medische behandeling van maagzweren gericht op het uitroeien van H. pylori
infectie en meestal gebaseerd op triple behandelingsmethode, die het gebruik van maagzweren remmers (zoals histamine H 2-antagonisten betrokken, proton pomp remmers of sucralfaat en bismuth) in combinatie met twee soorten antibiotica [2]. Toch moet het feit dat er andere dan H. pylori
verschillende factoren die gastrische ulceratie kan leiden niet worden genegeerd [3]. Verschillende benaderingen zijn gebruikt bij de behandeling van maagzweren in verband met de niet-H. pylori
gerelateerde factoren, zoals het verminderen van maagzuursecretie en het verhogen slijmproductie maar deze benaderingen zijn beschouwd als de tweede lijns behandeling.
Ondanks hun effectiviteit in het uitroeien van H. pylori
, de behandeling is complex en hoge kosten, die het gebruik van ten minste twee antibiotica in combinatie met maagzuurremmers. Deze combinatie zorgt ervoor dat vaak meerdere ongewenste neveneffecten (dat wil zeggen antibioticaresistentie, herhaling, misselijkheid) [2,3]. Hoewel H. pylori infecties
geleidelijk af gedurende de meeste geïndustrialiseerde landen wordt een geleidelijke toename van falen van H. pylori uitroeiing
behandelingen elders waargenomen [2]. Dit wordt verder verslechteren door de wijze waarop deze standaard tegen zweren agenten met verschillende ongewenste neveneffecten. Gelet op hun verschillende bijwerkingen en de aanwezigheid van antibiotica-resistente H. pylori stammen
, de zoektocht naar nieuwe en veilige niet-antibiotische maagbeschermende middelen uit natuurlijke bronnen, in het bijzonder planten, blijven wereldwijd [2 toenemen, 4].
Eén van de planten die worden gebruikt voor de behandeling van maagzweren in Maleisië Melastoma malabathricum
L. (familie Melastomaceae). Plaatselijk bekend om het Maleis als 'Senduduk
', is M. malabathricum
overvloedig in heel Zuid- en Zuidoost-Azië, Taiwan, China, Zuid-Pacifische Oceaan en Australië in de Indische Oceaan eiland. Diverse delen van de plant worden gebruikt in Maleis traditionele medicijnen van verschillende aandoeningen met de bladeren te behandelen, met name, zijn gebruikt om maagzweren te behandelen onder andere [5]. Wetenschappelijk gezien zijn de M. malabathricum
delen gemeld aan verschillende farmacologische activiteiten [5-7] vertonen. Anders dan bij het traditionele gebruik als middel tegen zweren, werd M. malabathricum
gekozen in de huidige studie gebaseerd op het feit dat het een van de bekende kruiden in het Maleis medicinale folklore, maar kreeg gebrek aan aandacht van de gemeenschap. Bovendien heeft M. malabathricum
gemeld aan hoge totale gehalte fenol bevatten en uit te oefenen een hoge anti-oxidant en anti-inflammatoire activiteiten [5-7], die belangrijk zijn in de mechanismen van antiulcer van elke verbindingen /extracten. Het is algemeen bekend dat maagzweren, met name induceren van ethanol, wordt gebruikt ROS generatie. Ethanol snel doordringt het maagslijmvlies als het in staat om de slijmerige oplosbaar en veroorzaakt de afgifte van hydroperoxy-vrije radicalen en superoxide anion. Deze vrije radicalen veroorzaken een toename van oxidatieve stress in de weefsels, die op zijn beurt, verhoogt het niveau van malondialdehyde, een marker van verhoogde lipide peroxidatie. Kortom, ethanol-geïnduceerde schade wordt berokkend direct manifesteren via generatie van reactieve metabolieten of indirect via andere mechanismen activeren die uiteindelijk leiden tot oxidatieve schade [7]. Vandaar, extracten /verbindingen met anti-oxidanten activiteiten spelen een zeer belangrijke rol in het wegvangen van de vrije radicalen en remmen lipidenperoxidatie. In plaats hiervan heeft M. malabathricum
gerapporteerd dat een opmerkelijke antioxidant activiteit [7] en derhalve wordt aangenomen dat tegen zweren potentieel bezitten uitoefenen. Onze eerdere screening methanol extract van M. malabathricum
(MEMM) voor tegen zweren bieden tegen ethanol- en indomethacine geïnduceerde maagzweer modellen zijn elders gerapporteerd [8]. MEMM bleek-ethanol geïnduceerde verzwakken, maar verergerd-indomethacine geïnduceerde, maagzweer formatie. Het vermogen van MEMM zowel de gastroprotection en ontstekingsremmende activiteiten uitoefenen [5] is in tegenstelling tot die van indomethacine, waarvan slechts uitgeoefend ontstekingswerende werking. Deze waarneming lijkt te suggereren dat het extract gastroprotection activeert via een mechanisme dat niet is gekoppeld aan die van anti-inflammatie. Bovendien kunnen de anti-ontstekingsactiviteit van MEMM eventueel verschilt van degene die wordt uitgeoefend door indomethacine. Omdat een remmer van zowel Coxs (d.w.z. COX-1 en COX-2), indomethacine selectiever voor COX-1, die is vereist voor het handhaven van de beschermende maagslijmvlies laag [9]. Het vermogen van MEMM naar indomethacine geïnduceerde gastrische ulceratie intensiveren stelt MEMM ook mogelijk remde COX-1 werking en interfereren met de vorming van PG constitutieve die bijdragen aan het maagslijmvlies onder anderen. Aan de andere kant kan het vermogen van MEMM ontstekingsremmende activiteit vertonen vanwege zijn vermogen om de COX-2-afhankelijke respons geassocieerd met poot oedeemtest de carrageenan geïnduceerde rat remt [5, 9]. Anders dan dat zou MEMM ook tegenstelling werken door het activeren van COX-2, waardoor PGE verhogen 2 synthese, die werd gemeld ontstekingsremmende activiteit vertonen door binding aan één van zijn receptoren, de PGE receptor 4 (EP 4) [10]. Bovendien PGE 2 is bekend dat de precursor voor de vorming van prostaglandines cyclopentenon (cyPG) uitoefent die anti-inflammatoire [11] zijn. Bovendien is het vermogen om de PGE 2 synthese, waardoor de maag slijmproductie toeneemt activeren, kan gebeuren door de activering van het EP 3 receptoren [10]. Dit kan weer helpen verklaren het vermogen van MEMM ontstekingsremmende activiteit vertonen terwijl tegelijkertijd uitoefenen zwerenwerende werkzaamheid tegen ethanol-, maar niet indomethacine geïnduceerde model. Ondanks deze suggesties is geen poging gedaan om de mogelijke mechanismen van gastroprotection van MEMM, die kunnen worden gebruikt om de activiteit waargenomen tegen zweren verklaren bepalen.
Gezien het bovengenoemde verslag [8] en andere meldingen van Hussain et al. [6], die de middelen tegen ulcera potentieel van waterig extract van M. malabathricum beoordeeld
met behulp van slechts één model van maagzweren (dat wil zeggen ethanol-geïnduceerde model), het huidige onderzoek waren ontwerpen. Hoewel M. malabathricum
nooit is gebruikt bij de behandeling van H. pylori
infectie, die wordt ondersteund door de slechte antibacteriële activiteit [12,13], het traditionele gebruik van de installatie voor de behandeling van maagzweren gerechtvaardigd de aanwezigheid onderzoek met hoop op het vinden van een alternatieve /natuurlijke gastrobeschermende middel als een vervanging van de momenteel beschikbare neveneffect baring drugs gebruikt in de tweede lijn behandeling. Rekening daarmee rekening, deze studie gericht op het onderzoeken van de mogelijke mechanismen van gastroprotection van MEMM gebruik van verschillende modellen ratten.
Methods
Chemicaliën
De chemicaliën die in deze studie zijn analytische status en was voorbereid onmiddellijk voor gebruik. De volgende geneesmiddelen werden gebruikt: ranitidine (Sigma-Aldrich, USA), quercitrine (Sigma-Aldrich, USA), absolute ethanol (Fischer Scientific, USA), N-ethylmaleimide (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G nitro-L-arginine methyl esters (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), carbenoxolon (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) en diethylether (Fischer Scientific, USA).
plantenmaterialen en bereidingsmethodes van MEMM Ondernemingen de bladeren van M. malabathricum
werden verzameld tussen augustus en september 2010 van Serdang, Selangor, Maleisië, en geïdentificeerd door een botanicus van het Institute of Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, Maleisië. Een voucher specimen, ACP-0017, is gedeponeerd bij het Herbarium van de IBS, UPM, Maleisië. De gemalen gedroogde bladeren (40 g) werden drie maal bij kamertemperatuur geweekt gedurende 24 uur met methanol in de verhouding van 1:20 (w /v) methanol en de supernatant werd verdampt (40 ° C) onder verlaagde druk droog waardoor een opbrengst van 12,8 g gedroogd en kleverig methanol extract (percentage werd opgeleverd ≈ 32%).
fytochemische screening en HPLC analyse van MEMM Ondernemingen de fytochemische screening en HPLC analyse van MEMM werd uitgevoerd volgens de eerder beschreven werkwijze [ ,,,0],7]. Fytochemische screening van MEMM werd uitgevoerd om de aanwezigheid van flavonoïden, triterpenen, looistoffen, alkaloïden en saponinen te bepalen volgens de gebruikelijke protocollen zoals beschreven below.i) Flavonoïden
Ongeveer 10,0 g MEMM werd afzonderlijk gekookte 2 tot 3 minuten in 100 ml water in een waterbad. Tot 3 ml van het filtraat, 3 ml zuur-alcohol (ethanol: water: geconcentreerd zoutzuur in de verhouding 1: 1: 1), vaste magnesium (1 cm) en 1 ml van t-amyl alcohol toegevoegd. De mengsels werden vervolgens waargenomen voor een roze-oranje of schenden kleur change.ii) Triterpenes
Ongeveer 1,0 g MEMM werd afzonderlijk gewonnen gedurende 24 uur in ether. 1 ml van het filtraat werd afgedampt tot droog en het residu opnieuw opgelost in enkele druppels azijnzuuranhydride en enkele druppels zwavelzuur aan de oplossing toegevoegd. De mengsels werden vervolgens waargenomen voor een groene kleur change.iii) Tannines
Ongeveer 0,2 g MEMM werd afzonderlijk gekookt in 5 ml water. De mengsels werden afgekoeld en gefiltreerd. Een paar druppels (3 druppels) 5% ferrichloride-oplossing werden aan het filtraat toegevoegd en gecontroleerd op een blauw-zwarte neerslag formation.iv) alkaloïden
Ongeveer 0,5 g MEMM werd afzonderlijk gekookt met 10 ml verdund zoutzuur (alcoholische) in een reageerbuis gedurende 5 min. De mengsels werden afgekoeld en het puin werd bezinken. Elk van de bovenstaande vloeistoffen werd gefiltreerd in een reageerbuis en 1 ml van elk filtraat werd genomen waarin drie druppels Dragendorff reagens (kalium- bismut jodiumoplossing) werd toegevoegd, geschud en geobserveerd voor het optreden van een oranje-rode vlek en een precipitaat formation.v) Saponinen
Ongeveer 0,2 g MEMM werd geschud met water en het mengsel werd waargenomen voor een blijvende schuim. Ondernemingen de HPLC analyse van MEMM werd uitgevoerd volgens het vorige verslag [4 ], maar met lichte wijzigingen. Kortom, MEMM (10 mg) werd gesuspendeerd in 1 ml methanol. De oplossing werd door een filterpatroon (poriëngrootte van 0,45 pm) voorafgaand aan analyse. Het gefiltreerde monster werd geanalyseerd met de HPLC-systeem dat bestaat uit de Waters Delta 600 met 600 Controller, fotodiode array detector (Waters 996). En een Phenomenex Luna (5 urn) (Torrance, CA, USA) kolom (4,6 mm i.d. x 250 mm). Twee oplosmiddelen aangeduid als A en B werden gebruikt voor elutie van de bestanddelen. A was 0,1% waterig mierenzuur en B was acetonitril. Initiële omstandigheden waren 95% A en 5% B met een lineaire gradiënt bereikt 25% B
t = 12 min en deze toestand werd gedurende 8 min gehandhaafd. B werd opnieuw verlaagd tot 15% bij t = 22 min
en op deze toestand nog eens 8 minuten (t
= 30 min). Op t = 35 min
het programma terug naar de oorspronkelijke oplosmiddelsamenstelling. Het debiet gebruikt was 1,0 ml /min en de injectie volume was 10 ul. De kolomoven werd ingesteld op 27 ° C en het eluent werd gevolgd bij 210, 254, 280, 300, 330 en 366 nm. De retentietijden en piekoppervlakken en UV-spectra van de hoofdpieken werden geanalyseerd. . De HPLC-analyse werd uitgevoerd in het Laboratorium voor Phytomedicine, geneeskrachtige planten Division, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Maleisië
Proefdieren
Mannelijke Sprague Dawley ratten (180-200 g verricht; 10/08 weken oud) werden verkregen van het Veterinair Animal Unit, Faculteit Diergeneeskunde, Universiti Putra Malaysia (UPM), Maleisië en bij kamertemperatuur (27 ± 2 ° C bewaard; 70-80% luchtvochtigheid, 12 uur licht /donker-cyclus) in de Animal Holding Unit, Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen, UPM. Ze werden voorzien van voedsel en water ad libitum
vanaf het begin van de experimenten. De studie protocol van de huidige studie werd goedgekeurd door de Animal House en gebruik Comite, Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen, UPM (Ethische goedkeuring nr: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00.449). De ratten werden behandeld in overeenstemming met de huidige UPM richtlijnen voor de verzorging van proefdieren en de ethische richtlijnen voor onderzoek van experimentele pijn bij dieren bij bewustzijn [14]. Alle experimenten werden uitgevoerd tussen 09.30 en 18.30 uur om de effecten van veranderingen in het milieu te minimaliseren. Vasten is toegepast gedurende 48 uur voorafgaand aan alle assays, waarbij de ratten toegang mochten alleen water.
Bepaling van de mogelijke mechanismen van gastroprotection van MEMM
pylorus-ligatie geïnduceerde ulcera
pylorus ligatie uitgevoerd volgens werd uitgevoerd de methode van Shay et al. [15] met lichte wijzigingen. Dertig ratten werden willekeurig verdeeld in 5 groepen (n = 6). Groep-I (controle) werd behandeld met drager (10% DMSO), groep II (positieve controle, ranitidine) werd bij 100 mg /kg (po), groep III-IV en V-ratten werden behandeld met MEMM (50, 250 en 500 mg /kg, respectievelijk). Pylorus ligatie werd uitgevoerd 1 uur na toediening van de testverbindingen op 48 uur gevaste ratten. Ketamine HCl (100 mg /kg, intramusculair) en xylazine HCl (16 mg /kg, intramusculair) gebruikt om de ratten verdoven vóór ligatie van de pylorus. Een 2 cm incisie werd gemaakt in de buik net onder het borstbeen aan verdoofde ratten. De maag werd blootgesteld, en een draad werd doorgegeven rond de pylorus sluitspier en vastgebonden in een strakke knot. Er werd genomen terwijl het binden van de knoop te vermijden waarbij de bloedvaten in de knoop. De buik werd gehecht, en de huid werd ontdaan van elke bloed vlekken of bloeden. De dieren werden opgeofferd 6 uur na ligatie door cervicale dislocatie.
Bepaling van volume, pH, vrij en totaal zuurgehalte van maaginhoud
De magen werden verwijderd, en de inhoud werd afgevoerd, verzameld en gecentrifugeerd bij 2500 rpm gedurende 10 min. Het volume en de pH van het maagsap werd gemeten en werd onderworpen aan vrij en totaal zuur schatting volgens de werkwijze beschreven door Srivastava e.a. methode. [16]. Vrije vetzuren werd bepaald door titratie met 0,01 N natriumhydroxide (NaOH) met methyloranje reagens tot de kleur van de oplossing geel werd. Het volume van alkali toegevoegd waargenomen. Vervolgens 2:58 druppels fenolftaleïne toegevoegd en de oplossing werd getitreerd tot een duidelijke roze kleur weergegeven. Het totale volume van NaOH werd genoteerd en dit komt overeen met de totale zuurgraad. Zuurgraad werd berekend aan de hand van de volgende formule: $$ \\ mathrm {zuurgraad} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {van} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ tijden \\ mathrm {normaliteit} \\ kern0.5em \\ mathrm {van} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ tijden 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Schatting van de maagwand slijm inhoud
maagwand slijm werd bepaald door de door Corne e.a. methode. [17] met lichte wijzigingen. De maag werd geopend langs de grotere kromming, gewogen en ondergedompeld in 10 ml 0,1% Alcian Blue in 0,16 M sucrose /0,05 M natriumacetaat, pH 5,8 gedurende 2 uur. De overmatige kleurstof werd daarna verwijderd door twee opeenvolgende spoelingen in 0,25 M sucrose-oplossing (15 min elk). De resterende kleurstof gecomplexeerd met het maagslijmvlies werden geëxtraheerd met 0,5 M MgCl 2 gedurende 2 uur en met tussenpozen geschud 1 min op elke 30 minuten interval. De blauwe extract werd vervolgens krachtig geschud met een gelijk volume diethylether en de resulterende emulsie werd gecentrifugeerd bij 3600 rpm gedurende 10 min. De absorptie (OD) van Alcian Blue in de waterige laag werd afgelezen bij 580 nm met een spectrofotometer. De hoeveelheid Alcian Blue uittreksel per gram natte maag werd vervolgens berekend uit een standaard curve.
-Ethanol veroorzaakte maagslijmvlies laesie in L-NAME pre-behandelde ratten
De betrokkenheid van endogene NO in het moduleren van de ethanol-geïnduceerde gastroprotectieve activiteit werd bepaald volgens de werkwijze Andreo et al. [18], maar met lichte wijzigingen. Mannelijke ratten werden willekeurig verdeeld over twaalf groepen (n = 6) en 24 uur gevast maar vrije toegang tot water. Zij werden vervolgens voorbehandeld met zoutoplossing of L-NAME (70 mg /kg, een remmer van NO synthase) intraperitoneaal (ip) en 30 min later ontvingen de dieren drager (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positieve controlegroep) of 500 mg /kg MEMM (po). Een uur na de toediening van testoplossingen werd maagzweer geïnduceerd middels 5 ml /kg absolute ethanol in alle groepen. Anderzijds, L-arginine (200 mg /kg) werd toegediend 30 minuten na zoutoplossing of L-NAME behandeling en gevolgd 30 minuten later door de ethanol toediening. Alle ratten werden 1 uur later opgeofferd door blootstelling aan diethylether. De maag werd geopend langs de grotere kromming aan de ulcus gebied (UA) zoals beschreven door Balan et al bepalen. [19]. De bescherming percentage werd berekend aan de hand van de volgende formule: $$ \\ mathrm {Protection} \\ links (\\% \\ right) = \\ frac {\\ links (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {controle} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {behandeld} \\ \\ mathrm {groep} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {controle} \\ right)} \\ tijden 100 \\% $$-Ethanol veroorzaakte maagslijmvlies laesie in NEM pre-behandelde ratten Belgique Om te onderzoeken de betrokkenheid van sulfhydryl (SH) groep in de modulatie van ethanol-geïnduceerde maagbeschermende activiteit, de procedures beschreven door Andreo et al. [18] werden met lichte wijzigingen aangenomen. De ratten werden willekeurig verdeeld in 12 groepen (n = 6) en 24 uur gevast maar vrije toegang tot water. Het experiment begon met voorbehandeling (i.p.) of zoutoplossing of NEM (10 mg /kg), een sulfhydryl (SH) blocker. Dertig minuten na de voorbehandeling regiment werden de ratten waaraan (po) met drager (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positieve controlegroep) of 500 mg /kg MEMM gevolgd door toediening van 5 ml /kg ethanol een uur later maagzweren induceert. Alle dieren werden opgeofferd 1 uur na ethanol blootstelling aan diethylether. De maag werd verwijderd en maagschade werd bepaald zoals hierboven beschreven
. Biochemische analyse van maag weefsels
Na macroscopische analyses, superoxide dismutase (SOD) [20], catalase (CAT) [21], myeloperoxidase (MPO) [22], glutathion peroxidase (GTP) [23], glutathion reductase (GTR) [24] en thiobarbiturinezuur reactieve substanties (TBARS) [25] enzymactiviteiten in de rat maag weefsels werden gemeten. Het maagslijmvlies werd afgeschraapt van de antrale gedeelte van de maag met een scrapper en biochemische bepaling bewaard bij 4 ° C. De afgedankte maagslijmvlies werd aan de mucosale homogenaat (pH 7,2) te bereiden. Het homogenaat werd gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 10 minuten en de verkregen supernatant werd gebruikt voor de analyse van antioxidant tekst op ethanol geïnduceerde gastrische mucosale schade. In alle assays antioxidant werd ranitidine (100 mg /kg) -pretreated groep beschouwd als de positieve controlegroep.
Bepaling van SOD activiteit Ondernemingen De activiteit van SOD werd bepaald gebaseerd op de remming van de vorming van nicotinamide adenine dinucleotide, fenazinemethosulfaat en amino tetrazolium formazan [20]. Ongeveer 0,5 ml van weefsel homogenaat werd gemengd met 0,4 ml ethanol en chloroform mengsel en gecentrifugeerd. Aan het supernatant testmengsel (natriumpyrofosfaat buffer (0,025 M, pH 8,3), nitroblauwtetrazolium, fenazine methosulfaat en verminderde nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)) werd gedurende 90 s toegevoegd en geïncubeerd bij 30 ° C. De reactie werd gearresteerd door de toevoeging van ijsazijn en gemengd met n-butanol
. De intensiteit van de ontwikkelde kleur in butanol werd gemeten bij 560 nm. SOD activiteit werd gemeten door de mate van remming van deze reactie en wordt uitgedrukt als mmol /min /mg eiwit.
Bepaling van CAT-activiteit Ondernemingen De activiteit van CAT werd colorimetrisch bepaald bij 620 nm zoals beschreven door de werkwijze van Sinha [21]. Het reactiemengsel van 1,5 ml bevattende 1,0 ml fosfaatbuffer (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml 2,0 M H 2O 2 en 1,0 ml weefselhomogenaat. De reactie werd gestopt door de toevoeging van 2,0 ml azijnzuur dichromaat-reagens (5% kaliumdichromaat en ijsazijn in een verhouding van 1: 3). Resultaten worden uitgedrukt als mmol /min /mg eiwit.
Bepaling van MPO activiteit Ondernemingen De activiteit van MPO werd gemeten volgens de werkwijze beschreven door Bradley et al methode. [22], maar met lichte wijzigingen. De gehomogeniseerde monsters werden ingevroren en ontdooid drie maal en gecentrifugeerd bij 1500 g gedurende 10 minuten bij 40 ° C. Ongeveer 100 ul van het gehomogeniseerde supernatant werd toegevoegd aan 1,9 ml 10 mmol /l fosfaatbuffer (pH 6,0) en 1,0 ml 1,5 mmol /LO-dianisidine hydrochloride bevattende 0,0005% (w /v) H 2O 2. De absorptie werd bepaald bij 450 nm op een UV-spectrofotometer en de MPO-activiteit in maag weefsels werd uitgedrukt als pmol /min /mg eiwit.
Bepaling van GTP activiteit
Activiteit van GTP werd gemeten volgens de werkwijze van Rotruck et al. [23] met lichte wijzigingen. Het reactiemengsel, dat 0,2 ml bevatte 0,4 M, Tris - HCl-buffer, pH 7,0, 0,1 ml 10 mM natriumazide, 0,2 ml weefsel homogenaat (gehomogeniseerd het weefsel in 0,4 M Tris-HCl-buffer, pH 7,0), 0,2 ml glutathion en 0,1 ml van 0,2 mM waterstofperoxide werd vervolgens geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Het reactiemengsel werd aangehouden door de toevoeging van 0,4 ml 10% TCA en onderwerping aan de centrifugatieproces. Het supernatant werd getest op glutathionengehalte met Ellmans reagens (19,8 mg van 5, 5'-dithiobisnitro benzoëzuur (DTNB) in 100 ml 0,1% natriumnitraat). Een molaire extinctiecoëfficiënt van 6,22 x 103 umol werd gebruikt om de activiteit van GTP bepalen. De enzymactiviteit werd uitgedrukt in internationale eenheden enzymactiviteit /g eiwit. Internationale eenheden worden uitgedrukt in umol hydroperoxiden getransformeerde /min /ml enzym.
Bepaling van GTR activiteit
De hoeveelheid GTR werd bepaald met de methode van Ellman [24]. Approximately1.0 ml supernatant werd behandeld met 0,5 ml van Ellmans reagens (19,8 mg van 5, 5'-dithiobisnitro benzoëzuur (DTNB) in 100 ml 0,1% natriumnitraat) en 3,0 ml fosfaatbuffer (0,2 M, pH 8,0 ). De absorptie werd afgelezen bij 412 nm en de GTR activiteit werd uitgedrukt als pmol /min /mg weefsel.
Bepaling van TBARS gehalte
de omvang van LPO werd gemeten door het analyseren van het niveau van TBARS in het maagslijmvlies volgens de vorige methode [25], maar met een kleine wijziging. Aan 0,5 ml van weefselhomogenaat, 1,5 ml 20% azijnzuur, 0,2 ml SDS en 1,5 ml TBA toegevoegd. Het mengsel werd aangevuld tot 4 ml met gedestilleerd water en gedurende 1 uur bij 95 ° C. Na afkoeling werd 4,0 ml butanol-pyridine toegevoegd en goed geschud. Dit mengsel werd vervolgens gecentrifugeerd bij 4000 rpm gedurende 10 min. De organische laag werd gehouden en de absorptie werd afgelezen bij 532 nm en de resultaten werden uitgedrukt als mol /g eiwit.
Schatting eiwit
het eiwitgehalte in het maagweefsel werd geschat volgens de methode van Lowry et al. [26], maar met lichte wijzigingen. Het weefselmonster en de standaarden (1,0 mg /ml Bovine serum albumine in dubbel gedestilleerd water) in verschillende buisjes werden behandeld met 5,0 ml reagens mengsel (48% natrium kalium tartraat, 2% kopersulfaat en 3% natriumcarbonaat in 1:48 (v /v)). Vervolgens Folin fenol reagens (1: 2) werd aan het reactiemengsel toegevoegd en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur staan. De optische dichtheid werd afgelezen bij 710 nm met water als blanco.
In vitro anti-inflammatoire werking van MEMM
in vitro effect van MEMM op stikstofoxide
Celkweek en stimulatie
RAW 264,7 cellijn (murine monocytische macrofagen) (European Collection of Cell Cultures, Porton down UK) werd gehandhaafd in DMEM aangevuld met 10% FBS, 4,5 g /l glucose, L-glutamine (2 mM), natriumpyruvaat (1 mM), penicilline (50 U /ml) en streptomycine (50 gg /ml) en 5% CO 2 bij 37 ° C. De cellen (4 x 10 5 cellen /putje) werden geënt in een 96-wells plaat en gedurende 2 uur bij 37 ° C in een CO 2 incubator om de hechting van cellen mogelijk maken, en vervolgens geactiveerd met stimuli (100 U /ml IFN-g en 5 ug /ml LPS) met of zonder de aanwezigheid van MEMM in de concentratie die varieert tussen 12,5-100 ug /ml. DMSO (voertuig) werd gebruikt om de MEMM lossen. De eindconcentratie van DMSO werd gegarandeerd 0,1% in alle culturen. Cellen werden vervolgens gedurende 17-20 uur bij 37 ° C in een CO 2 incubator. De NO bepaling werd uitgevoerd door het gekweekte supernatant onderwerpen tegen het Griess assay en de resterende cellen in het putje werden getest op cellevensvatbaarheid assay
Nitriet bepaling
de concentratie van nitriet (NO 2 . - ), een stabiele metaboliet van NO in kweekmedium werd bepaald met de Griess assay [27]. Een gelijk volume Griess reagens werd gemengd met het kweeksupernatant en de kleurontwikkeling werd gemeten bij 550 nm. De hoeveelheid nitriet in het kweeksupernatant werd bepaald op basis van de standaardcurve van natriumnitriet (0-100 pM) vers bereid in gedeïoniseerd water. Percentage van de NO remming werd berekend met behulp van de volgende formule: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ waarbij;
* controle is het nitriet niveau van IFN-γ /LPS-geïnduceerde groep
Cell levensvatbaarheid
De cytotoxiciteit van MEMM op de gekweekte cellen werd bepaald door het testen van de reductie van 3. - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) [27]. De MTT reagens (0,05 mg /ml) werden gesuspendeerd in steriele PBS, pH 7,0 en werd vervolgens aan elk putje na het verwijderen van het supernatant. Dit werd gevolgd door de incubatie van het overgebleven cellen bij 37 ° C gedurende 4 uur gevolgd door de toevoeging van 100 pl 100% DMSO in de putten om de formazan zouten gevormd lossen. De absorptie werd gemeten bij 570 nm. Het percentage levensvatbaarheid van de cellen werd berekend volgens de volgende formule: $$ \\ mathrm {Cell} \\ \\ mathrm levensvatbaarheid {} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {controle}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {sample}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Een nieuwe methode, digitaal genoom scannen detecteert KRAS genamplificatie bij maagkanker: betrokkenheid van overexpressie wild-type KRAS in downstream signalering en kankercel growth
• Genomische profiel analyse van diffuse-type maag cancers