Mehanizmi prebavila metanola ekstrakt Melastoma malabathricum listov

Mehanizmi prebavila metanola ekstrakta Melastoma malabathricum
zapusti
Abstract
Ozadje
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) je majhen grm z različnimi zdravili namene. Sedanja študija je bila izvedena za določitev gastroprotektivnih mehanizme metanola ekstrakta M. malabathricum
listi (MEMM) pri podganah.
Metode
mehanizmov ekstrakta z dne prebavila (50, 250, 500 mg /kg) smo preučevali z uporabo pilorus-vezavo v podganjem modelu, pri čemer so bile volumen, pH, prost in skupno kislost želodčnega soka in želodca vsebnost sten sluz določena. Izmerili smo tudi vpletenost endogenih dušikovega oksida (NO) in sulfhidrilna (SH) spojin v gastroprotektivni učinek MEMM. MEMM je podvržen antioksidant, protivnetno in fitokemikalija analiza in HPLC profiliranje.
Rezultati
MEMM vsebuje različne fito-sestavine s quercitrin opredeljena kot del njih. MEMM in quercitrin: i) znatno (p 0.05) znižajo količino in kislost želodčnega soka, medtem ko zvišanje pH in želodčne vsebine stena sluz .; ii) pomembno (p < 0,05) povečala raven SOD, GTP in GTR medtem značilno (p < 0,05) zmanjšati raven CAT, MPO in TBARS dejavnosti .; iii) deluje gastroprotektivnih dejavnost, ko so ocenjevali z-etanol povzroča razjede želodca testa, ki ga je obrnil z N G-nitro-l-arginin metil estrov (L-NAME; zaviralec NO sintaze) in N
- etilmaleimid (NEM, sulfhidrilne (SH) oken). MEMM zavrl lipoksigenaze (LOX) in ksantinoksidaze dejavnosti (XO) z najvišjo afiniteto za prvo medtem quercitrin pokazala veliko afiniteto za XO dejavnosti.
Sklepe
MEMM pokazal gastroprotektivnih dejavnost, deloma zaradi prisotnosti quercitrin, njegova antioksidant in protivnetne aktivnosti in s pomočjo modulacije NO in SH skupin.
Ključne besede
Melastoma malabathricum
Melastomaceae Metanol ekstrakt gastroprotektivnih mehanizme dušikov oksid sulfhidrilna skupina antioksidant protivnetno Ozadje
so razjed pogosta motnja celotnega gastrointestinalnega trakta. Za skoraj 8 do 10% svetovnega prebivalstva, peptične razjede prizadela, približno 5% pa jih trpi zaradi želodčnih razjed [1]. So razjede, ki vplivajo na prebavni sistem običajno poslabšuje nesorazmerje med destruktivnimi in obrambnih dejavnikov v želodcu [1]. Čeprav šteje kot multifaktorska bolezni, je splošno priznano, da so skoraj vsi peptične razjede povezan z okužbo s Helicobacter pylori
in večji terapevtski cilj je izkoreninjenje H. pylori
okužbo. Trenutno je prvo linijo zdravljenja razjede želodca usmerjena na izkoreninjenje H. pylori
okužbo in ponavadi temeljijo na postopku trojnega zdravljenja, ki je vključevala uporabo zaviralcev želodčne razjede (Tj histamina H 2 antagoniste, proton črpalka inhibitorje ali sukralfat in bizmutovih) v kombinaciji z dvema vrstama antibiotikov [2]. Vendar pa je dejstvo, da so razen H. pylori
različnih dejavnikov, ki lahko sprožijo želodca nastanek razjede ne smemo pozabiti [3]. Različni pristopi so bili uporabljeni za zdravljenje želodca, povezano s temi non-H. pylori
-povezana dejavniki, kot so zmanjšanje izločanje kisline in povečanje proizvodnje sluzi, vendar ti pristopi so bili šteti za zdravljenje v drugi liniji.
Kljub njihovi učinkovitosti pri izkoreninjenju H. pylori
, zdravljenje je zapleten in visokih stroškov, ki vključuje uporabo vsaj dveh antibiotikov v kombinaciji z inhibitorji želodčne kisline. Ta kombinacija pogosto povzroči številne neželene stranske učinke (to je odpornost na antibiotike, ponavljanje, slabost) [2,3]. Kljub temu, da so H. pylori
okužbe postopoma zmanjšal celotni večini industrializiranih državah, je opaziti postopno povečanje neuspeh H. pylori
zdravljenja za izkoreninjenje drugje [2]. To je še dodatno poslabšal, ki jih je združenje teh standardnih učinkovine proti rani z različnimi neželene učinke. Ob upoštevanju njihovih različnih neželenih učinkov in pojav odporne proti antibiotikom, H. pylori
sevov, iskanje novih in varnih non-antibiotike gastroprotektivnih zdravil iz naravnih virov, predvsem rastline, še naprej povečevala po vsem svetu [2, 4].
Ena izmed rastlin, ki se uporabljajo za zdravljenje želodčne razjede v Maleziji Melastoma malabathricum
L. (družina Melastomaceae). Lokalno znan malajščina kot "Senduduk
", M. malabathricum
najdemo v izobilju v Indijskem oceanu otok, po vsej južni in jugovzhodni Aziji, Tajvanu, Kitajska, južnem Tihem oceanu in v Avstraliji. Različni deli rastline, ki se uporabljajo v Malajski tradicionalnih zdravil za zdravljenje različnih bolezni pri listov, zlasti so bili uporabljeni za zdravljenje želodčnih razjed med drugim [5]. Znanstveno so poročali M. malabathricum
deli, da kažejo različne farmakološke aktivnosti [5-7]. Razen za njegove tradicionalne uporabe kot protiulkusno agenta, je bila M. malabathricum
izbran v tej študiji, ki temelji na dejstvu, da je eden od najbolj znanih zelišč v Malajski zdravila folklore, vendar je dobil premalo pozornosti med skupnosti. Poleg tega so poročali M. malabathricum
vsebuje visoko vsebnost skupne fenolne in izvajati visoko antioksidant in protivnetne aktivnosti [5-7], ki so pomembne pri mehanizmih antiulkusno nobene spojin /izvlečkov. Znano je, da želodcu, zlasti tistih, ki povzročijo z etanolom, ki je povezan z generacijo ROS. Etanol hitro prodre v želodčni sluznici, saj je sposobna, da solubiliziramo zaščitne sluzi in povzroči sproščanje hidro prostih radikalov in superoksidnega aniona. Ti prosti radikali povzročajo povečanje oksidativnega stresa v tkivih, ki v zameno, povečuje raven malondialdehida, marker povečane peroksidacije lipidov. Na splošno pa je, etanol povzroča škodljivih vplivov se odraža neposredno prek generacije reaktivnih metabolitov ali posredno preko aktiviranja druge mehanizme, ki na koncu sprožijo oksidativne poškodbe [7]. Zato, izvlečki /spojine z antioksidanti dejavnosti igrajo zelo pomembno vlogo pri lovljenju te proste radikale in zavira peroksidacijo lipidov. Namesto tega, M. malabathricum
so poročali, da izvajajo izredno antioksidativno aktivnost [7], zato obstaja sum, da imajo za zdravljenje peptične razjede potencial. Naša prej pregled metanola ekstrakta M. malabathricum
(MEMM) za protiulkusno možnosti proti etanol; in indometacin povzroča modelov želodca so poročali drugje [8]. MEMM je bilo ugotovljeno, da zmanjšajo-etanol povzroča, vendar še poslabša, indometacin povzroča, želodčne nastanek razjede. Sposobnost MEMM produkcije tako prebavila in protivnetne aktivnosti [5], je v nasprotju s tistim indometacin, ki deluje zgolj protivnetno aktivnost. Ta ugotovitev je moč sklepati, da je ekstrakt aktivira prebavila s pomočjo mehanizma, ki ni povezan s položajem anti-vnetja. Poleg tega lahko protivnetno aktivnost MEMM lahko razlikuje od tistega, ki ga indometacin vršijo. Pri čemer zaviralec obeh Coxs (tj COX-1 in COX-2), indometacin bolj selektivna za COX-1, ki je potreben za ohranjanje zaščitnega želodčne sluznice plašč [9]. Sposobnost MEMM naj okrepi-indometacin povzroča želodčne nastanek razjede predlaga, da bi MEMM inhibirajo tudi COX-1 tožbo in vplivajo na nastanek konstitutivni PG, ki pripomorejo k zaščiti sluznico želodca, med drugim. Po drugi strani pa bi sposobnost MEMM produkcije protivnetno delovanje lahko zaradi svoje sposobnosti, da inhibira COX-2-odvisni odziv, povezan s testom tačk edem področij-karagenan inducirane podgan [5; 9]. Razen, da bi MEMM tudi contrarily deluje z aktivacijo COX-2, kar poveča PGE 2 sinteze, ki so poročali, da izvajajo protivnetno aktivnost z vezanjem na enem od svojih receptorjev je PGE receptorja 4 (EP 4) [10]. Poleg tega PGE je znano, da je prekurzor za tvorbo ciklopentenon prostaglandinov (cyPG), ki izraža v protivnetno [11] 2. Poleg tega je sposobnost za aktiviranje PGE 2 sinteze, kar povečuje želodčne proizvodnja sluzi, lahko pride prek aktivacije EP 3 receptorje [10]. To lahko spet pomagalo razložiti sposobnost MEMM dokazati protivnetno delovanje, medtem ko ob istem času, izvaja antiulkusno aktivnost proti etanolom, vendar ne indometacin povzročene modela. Kljub teh predlogov, ni bil poskus, da se ugotovi možne mehanizme prebavila od MEMM, ki bi jih lahko uporabili za pojasnitev opazili zdravljenje peptične razjede dejavnost.
Ob upoštevanju zgoraj omenjeno poročilo [8], in še poročila, ki jih Hussain et al. [6], ki je ocenila za zdravljenje peptične razjede potencial vodnega ekstrakta M. malabathricum
uporabljajo samo en model želodca (tj modela-etanol povzroča), je bila sedanja preiskava modelov. Čeprav je M. malabathricum
ni bila uporabljena pri zdravljenju H. pylori
infekcije, ki je podprta s svojo slabo antibakterijsko aktivnostjo [12,13], tradicionalne uporabe naprave za zdravljenje želodca upravičuje raziskava prisotnost v upanju, da najdejo alternativno /naravni gastroprotektivnih sredstvo kot nadomestilo trenutno razpoložljivih droge in učinkom baring stranskih, ki se uporabljajo pri zdravljenju druge izbire. Ob upoštevanju tega dejstva upošteva sedanjo študijo, ki za preiskavo o možnih mehanizmih prebavila od MEMM uporabo različnih podganah modelov.
Metode
Kemikalije
Kemikalije, ki se uporabljajo v tej študiji so analitičnih ocen in so bili pripravljeni tik pred uporabo. so bili uporabljeni naslednji zdravila: ranitidin (Sigma-Aldrich, ZDA), quercitrin (Sigma-Aldrich, ZDA), absolutni etanol (Fischer Scientific, ZDA), N-etilmaleimid (NEM) (Sigma-Aldrich, ZDA), N G nitro-l-arginin metilestri (L-NAME) (Sigma-Aldrich, ZDA), karbenoksolon (CBX) (Sigma-Aldrich, ZDA) in dietil eter (Fischer Scientific, ZDA).
zbiranje in priprava Rastlinski material od MEMM
listov M. malabathricum
so bili zbrani med avgustom in septembrom 2010 iz Serdang, Selangor, Malezija in označene z botanik iz inštituta za Bioscience (IBS) Universiti Putra Malezije (UPM), Serdang, Selangor, Malezija. Dokazni vzorec, ACP-0017, je bila deponirana pri Herbarij na IBS, UPM, Malezija. Zemlja posušeni listi (40 g) smo namakali trikrat pri sobni temperaturi 24 ur z metanolom v razmerju 1:20 (w /v) in metanol supernatant uparili (40 ° C) pod znižanim tlakom, da suha posledico dobitek 12,8 g posušene in lepljiv metanol ekstrakt (odstotek prinesla je ≈ 32%).
Phytochemical pregled in HPLC analiza MEMM
fitokemikalija pregled in analiza HPLC MEMM je bila izvedena v skladu z že poročali metodo [ ,,,0],7]. Phytochemical pregled MEMM je bila izvedena za ugotavljanje prisotnosti flavonoidi, triterpeni, tanini, alkaloidi in saponinov v skladu z običajnimi protokoli, kot je opisan below.i) Flavonoidi
Približno 10,0 g MEMM smo kuhali posebej za 2 do 3 min v 100 ml vode v vodni kopeli. 3 ml filtrata, 3 ml kislega alkohola (etanol: voda: koncentrirano solno kislino v razmerju 1: 1: 1) smo dodali trden magnezij (1 cm) in 1 ml t-amil alkohola. Zmesi smo nato ugotovili za rose-oranžne ali kršijo barve change.ii) triterpene
Približno 1,0 g MEMM je ločeno izvleče 24 ur v etru. 1 ml filtrata smo uparili do suhega in ostanek ponovno raztopimo v nekaj kapljicami anhidrida ocetne kisline in nato nekaj kapljic žveplove kisline dodamo k raztopini. Zmesi smo nato ugotovili za zeleno barvo change.iii) Tanini
Približno 0,2 g MEMM je posebej kuhali v 5 ml vode. Zmesi smo ohladili in filtrirali. Nekaj ​​kapljic (3 kapljice) v višini 5% raztopine feriklorida so bile dodane filtrata in nato opazuje modro-črne oborine formation.iv) alkaloidi
Približno 0,5 g MEMM je ločeno kuhamo z 10 ml razredčene solne kisline (alkohola) v epruveti za 5 minut. Zmesi smo ohladili in naplavin pustimo, da se usede. Vseh supernatanta tekočine smo filtrirali v drugo epruveto in 1 ml vsakega filtrata smo dali v katero dodamo stresamo in opazovati videz oranžno-rdeče samem in oborino tri kapljice Dragendorffovim reagentom (kalijevega bizmutov jodida raztopini) formation.v) saponini
Približno 0,2 g MEMM stresamo z vodo in vztrajno peno opazili zmes.
analizo HPLC MEMM bila izvedena v skladu s prejšnjim poročilom [4 ], vendar z manjšimi spremembami. Na kratko smo MEMM (10 mg) suspendiramo v 1 ml metanola. Raztopino smo spustili skozi filtrirni vložek (velikost por 0,45 um) pred analizo. Filtriranega vzorca smo analizirali s pomočjo HPLC sistem, sestavljen iz Waters Delta 600 s 600 nadzornika, fotodiode diod (Waters 996). In Phenomenex Luna (5 um) (Torrance, CA, ZDA) kolona (4,6 mm notr x 250 mm). Dva topila označene kot A in B, so bili uporabljeni za elucijo sestavin. Stroškov je bil 0,1% vodne mravljinčne kisline in B je acetonitril. Začetni pogoji so bili 95% A in 5% B z linearnim gradientom doseže 25% B pri t
= 12 min in ta pogoj vzdržujemo 8 minut. B je zmanjšana nazaj v 15% t
= 22 min in vzdrževali pri tej pogoj za drugo 8 min (t
= 30 min). Na t
= 35 min, program vrne v začetno sestavo topila. Pretok Uporabili smo 1,0 ml /min, volumen injiciranja je bil 10 ul. Stolpec peč je bila določena pri 27 ° C in eluent smo opazovali pri 210, 254, 280, 300, 330 in 366 nm. smo analizirali retencijski časi, vrhov in UV spektri glavnih vrhov. Analiza HPLC je bila izvedena v Laboratoriju za fitomedicino, Zdravilne rastline Division, Forest Research Institute Malezije (Frimovem), Kepong, Malezija
poskusnih živalih
Sprague Dawley (180-200 g;. 10/08 stari tednov) so bili pridobljeni iz enote Veterinarske živali, Veterinarska fakulteta, Universiti Putra Malezija (UPM), Malezije in se hranijo pri sobni temperaturi (27 ± 2 ° C, 70-80% vlažnost; 12 h svetloba /tema cikla) ​​v Holdinška Enota živali, Fakulteta za medicino in zdravstvene vede, UPM. So bili dobavljeni s hrano in vodo ad libitum
od začetka poskusov. Protokol študije o tej študiji je bil odobren s hišo živali in uporabe odbora, Medicinska fakulteta in zdravstvene vede, UPM (etični odobritvi no: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00449). Podgane so bile obravnavane v skladu z veljavnimi smernicami UPM za nego laboratorijskih živali in etičnih smernic za preiskave eksperimentalne bolečine v zavestnih živali [14]. Vse poskuse smo izvedli med 09.30 in 18.30 uro za zmanjšanje učinkov sprememb v okolju. Na tešče je bila uporabljena 48 ur pred vse teste, kjer so podgane dovoljen dostop samo vodo.
Določanje možnih mehanizmov prebavila od MEMM
pilorus razjede-ligacijske povzroča
je pilorus ligacija izvedena v skladu z metoda, ki jo Shay et al. [15] z manjšimi spremembami. Trideset Podgane smo naključno razdelili v 5 skupin (n = 6). Skupina I (kontrola), smo obdelali z vozilom (10% DMSO), je skupina II (pozitivna kontrola, ranitidin), glede na 100 mg /kg (PO), skupina-III -IV in V. Podgane smo obdelali z MEMM (50, 250 in 500 mg /kg, v tem zaporedju). Pilorus ligacije smo izvedli 1 uro po dajanju testnih spojin v 48 urah tešče podgane. Ketamin HCl (100 mg /kg, intramuskularno) in ksilazina HCl (16 mg /kg, intramuskularno), so bili uporabljeni za Anestezirati podgane pred vezavo na pilorus. 2 cm dolg rez je bil vložen v trebuhu tik pod prsnico na anesteziranih podganah. Želodec je bil izpostavljen, in nit je bil sprejet po pilorično mišice zapiralke in vezani v tesen vozel. Paziti je treba, medtem ko vezanje vozel, da se prepreči, ki vključuje krvne žile v vozel. Trebuh je zašite, in koža se je očiščen vseh krvnih madežev ali krvavitve. Živali so bile žrtvovane 6 ur po tem, ko vezavo ga cervikalno dislokacijo. So bili odstranjeni
Določanje obsega, pH, prostih in skupnih kislin želodčne vsebine
želodcev in vsebina so odteče, zbrali in centrifugirali pri 2500 obratih na minuto 10 min. Obseg in pH želodčnega soka smo izmerili in podvrgli proste in skupne oceni kislost po metodi, ki jo Srivastavo et al opisan. [16]. Prosta kislost je bila določena s titracijo z 0,01 N natrijevega hidroksida (NaOH), s metiloranža reagentom, dokler se barva raztopine postala rumenkaste. Obseg luga dodamo opazili. Nato dodamo dve do tri kapljice fenolftaleina in raztopino titriramo, dokler se dokončno rožnate barve. Skupni obseg NaOH opazili kar je enako skupne kisline. Kislost je bila izračunana po naslednji formuli: $$ \\ mathrm {kislost} = \\ FRAC {\\ mathrm {zvezek} \\ kern0.5em \\ mathrm {o} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ krat \\ mathrm {normalnost} \\ kern0.5em \\ mathrm {o} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ krat 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Ocena želodčne vsebine stene sluzi
želodca vsebnost stena sluz smo določili po metodi, ki jo Corné et al opisan. [17] z manjšimi spremembami. Želodec je bil odprt ob večji ukrivljenosti, stehtali in potopimo v 10 ml 0,1% Alcian Blue v 0,16 M saharoze /0,05 M natrijevega acetata, pH 5,8 v teku 2 h. Pretirana barvilo smo nato odstranili z dvema zaporednima splakovanje v 0,25 M raztopini saharoze (vsaka 15 min). Preostalo barvilo kompleksiran z želodčno sluznico smo ekstrahirali z 0,5 M MgCl 2 za 2 uri in stresamo v presledkih 1 minuto v vsakem 30 min intervalom. Modra ekstrakt smo nato močno stresamo z enakim volumnom dietiletrom in dobljeno emulzijo smo centrifugirali pri 3600 obratih na minuto za 10 minut. Absorbanco (OD) Alcian Blue v vodnem sloju smo prebrali pri 580 nm s pomočjo spektrofotometra. Količina Alcian Blue izvleček na gram mokri želodca smo nato izračuna iz standardne krivulje.
-Etanol povzročena poškodba želodčne sluznice v L-IME predhodno obdelanih podgan
Vključevanje endogene NO pri moduliranje gastroprotektivnih-etanol inducirane aktivnost smo določili po metodi Andreo et al. [18], vendar z manjšimi spremembami. Samci podgan smo naključno razdelili v dvanajst skupin (n = 6) in postili 24 ur, vendar omogočiti prost dostop do vode. Nato so predhodno obdelani s fiziološko raztopino ali L-NAME (70 mg /kg, zaviralec NO sintaze) intraperitonealno (ip) in 30 min kasneje prejel živali vozilo (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (pozitivna kontrolna skupina) ali 500 mg /kg MEMM (PO). Eno uro po dajanju testnih raztopin smo želodcu povzročena z uporabo 5 ml /kg absolutnega etanola v vseh skupinah. Po drugi strani pa so L-arginin (200 mg /kg) dajemo 30 minut po slanem ali L-IME zdravljenje in, čemur 30 minut kasneje z dajanjem etanola. Vse podgane so bile žrtvovane 1 uro kasneje z izpostavljenostjo dietil etra. Želodec je bil odprt ob večji ukrivljenosti določiti območja razjede (UA), kot ga Balan et al opisan. [19]. Zaščita odstotek je bil izračunan po naslednji formuli: $$ \\ mathrm {Zaščita} \\ left (\\% \\ desno) = \\ FRAC {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {a} \\ \\ mathrm {nadzor} \\ H okvirju {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {a} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ H okvirju {-} \\ mathrm {zdraviti} \\ \\ mathrm {skupina} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {a} \\ \\ mathrm {nadzor} \\ right)} \\ krat 100 \\% $$-etanol povzroča želodčne sluznice v NEM predhodno zdravljeni, podgane
Da bi raziskali sodelovanje od sulfinil (SH) skupina pri modulaciji-etanola povzročene gastroprotektivni aktivnostjo, postopki opisal Andreo sod. [18] so bili sprejeti z manjšimi spremembami. Podgane smo naključno razdelili v 12 skupin (n = 6) in postili 24 ur, vendar omogočiti prost dostop do vode. Poskus začela s predobdelavo (i.p.) z slanico ali NEM (10 mg /kg), sulfinil (SH-) zaviralca. Trideset minut po polk predobdelave so bile podgane dajemo (PO) z nosilcem (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (pozitivna kontrolna skupina) ali 500 mg /kg MEMM čemur sledi dajanje 5 ml /kg etanola uro kasneje povzroči razjede želodca. Vse živali žrtvovali 1 ur po prejemu etanol z izpostavljenostjo dietiletrom. Želodec smo odstranili in želodca škoda je bila določena, kot je opisano zgoraj.
Biokemijsko analizo želodčnih tkiv PODJETJA
Po makroskopske analize, superoksid dismutaza (SOD) [20], katalaza (CAT) [21], mieloperoksidaze (MPO) [22], glutation peroksidaze (GTP) [23], glutation reduktaza (GTR) [24] in thiobarbituric kisline reaktivne snovi (TBARS) smo izmerili [25] encimske aktivnosti pri podganah v želodcu tkiva. Sluznico želodca je postrgamo iz antralnih dela želodca uporabo scrapper in shranimo pri 4 ° C biokemijske oceno. Razrezana želodčna sluznica podvrgli pripravo sluznice homogenizat (pH 7,2). Homogenat smo nato centrifugirali pri 3000 obratih na minuto za 10 minut in supernatant, pridobljen je bil uporabljen za analizo antioksidanta tipa o etanolom inducirane želodčne poškodbe sluznice. V vsaki antioksidativnih obrambnih testih smo ranitidina (100 mg /kg) -pretreated skupina šteje kot pozitivni kontrolni skupini.
Določitev SOD aktivnosti
aktivnost SOD bila določena na osnovi inhibicije nastajanja nikotinamid adenin dinukleotid, fenazina methosulfate in amino blue tetrazolijevega formazana [20]. Približno 0,5 ml tkivnega homogenata smo zmešali z 0,4 ml etanola in kloroform zmesi in centrifugira. Supernatantu, zmes testa (natrijev pirofosfat odbojnik (0,025 M, pH 8,3), nitroblue tetrazolij fenazina methosulphate in zmanjšano nikotinamidadenindinukleotid (NADH)) dodamo in inkubirali pri 30 ° C za 90 sekund. Reakcijo smo zaustavljeno z dodatkom ocetne kisline in zmešamo z n
butanol. Intenzivnost barve je razvil v butanolu smo izmerili pri 560 nm. Aktivnost SOD smo merili s stopnjo inhibicijo te reakcije in je izražena kot mM /min /mg proteina.
Določitev CAT aktivnosti
aktivnost CAT smo testirali kolorimetrično pri 620 nm kot z metodo opisano Sinha [21]. Reakcijsko zmes 1,5 ml, ki vsebujejo 1,0 ml fosfatnega pufra (0.01 M, pH 7,0), 0,4 ml 2,0 M H 2O 2, in 1,0 ml homogenata tkiva. Reakcijo smo ustavili z dodatkom 2,0 ml reagenta kisline dikromatnim-ocetne kisline (5% kalijevega dikromata in glacialne zmesi ocetne kisline v razmerju 1: 3). Rezultati so izraženi kot mM /min /mg proteina.
Določitev MPO aktivnost
aktivnost MPO bila izmerjena po metodi, ki jo Bradley et al opisan. [22], vendar z manjšimi spremembami. Homogenizirane Vzorce smo zamrznili in odtajane trikrat in centrifugiramo pri 1500 g 10 minut pri 40 ° C. Približno 100 ul v homogenizirano supernatanta dodamo 1,9 ml 10 mmol /L fosfatni pufer (pH 6,0) in 1,0 ml 1,5 mmol /LO-dianisidine hidroklorid, ki vsebuje 0,0005% (m /v) H 2O 2. Absorpcijo je bil ocenjen na 450 nm za UV spektrometra in dejavnosti MPO v želodcu tkivih je bil izražen kot p.molov /min /mg proteina.
Določitev GTP dejavnosti
bil Dejavnost GTP merjeno po metodi, ki jo Rotruck opisanem et al. [23] z manjšimi spremembami. Reakcijsko zmes, ki vsebuje 0,2 ml 0,4 M Tris - HCI pufer, pH 7,0, 0,1 ml 10 mM natrijevega azida, 0,2 ml homogenata tkiva (homogenizirano tkivo v 0,4 M Tris-HCl pufru, pH 7,0), 0,2 ml glutation in 0,1 ml 0,2 mM vodikovim peroksidom smo nato inkubirali pri sobni temperaturi 10 minut. Reakcijo smo zaustavljeno z dodatkom 0,4 ml 10% TCA in podvrženosti k postopku centrifugiranja. Supernatant smo določili vsebnost glutationa s pomočjo Ellmans reagenta (19,8 mg 5, 5 'dithiobisnitro benzojske kisline (DTNB) v 100 ml 0,1% natrijev nitrat). Molskega ekstinkcijski koeficient 6.22 x 103 f.lmol bila uporabljena za določitev aktivnosti GTP. Encimska aktivnost je bila izražena kot mednarodnih enot encimske aktivnosti /g proteina. Mednarodnih enot so izražene kot p.molov hidroperoksidi preoblikovanih /min /ml encima.
Določanje GTR dejavnosti
bil Stopnja GTR določi po metodi Ellmana [24]. Approximately1.0 ml supernatanta smo obdelali z 0,5 ml Ellmans reagenta (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro benzojske kisline (DTNB) v 100 ml 0,1% natrijevega nitrata) in 3,0 ml fosfatnega pufra (0,2 M, pH 8,0 ). Absorbanco odčitamo pri 412 nm in GTR aktivnost je bila izražena kot p.molov /min /mg tkiva.
Določitev vsebnosti TBARS
obsegu LPO bila izmerjena z analizo ravni TBARS v želodčni sluznici po do prejšnja metoda [25], vendar z manjšo spremembo. Do 0,5 ml homogenata tkiva, 1,5 ml 20% ocetne kisline, 0,2 ml SDS in 1,5 ml TBA dodamo. Zmes dopolnimo do 4 ml z destilirano vodo in segrevamo 1 uro pri 95 ° C. Po ohladitvi, dodamo 4,0 ml zmesi butanol-piridina in stresamo dobro. To zmes smo nato centrifugirali pri 4000 obratih na minuto za 10 minut. Organsko plast smo delo in njegova Absorbanco odčitamo pri 532 nm in rezultati so bili izraženi kot n mol /g proteina.
Oceno proteina
je vsebnost beljakovin v želodčnem tkivu ocenjene po metodi Lowry et al. [26], vendar z manjšimi spremembami. Vzorec tkiva in standardi (1,0 mg /ml volovskega seruma albumina dvojno destilirane vode) v različnih cevi smo obdelali z 5,0 ml reagenta mešanice (48% natrijevega kalijevega tartrata, 2% bakrovega sulfata in 3% natrijevega karbonata v 1:48 (v /v)). Nato Folin fenol reagent (1: 2) smo dodali k reakcijski zmesi in pustimo stati 30 minut pri sobni temperaturi. Optično gostoto smo prebrali pri 710 nm z uporabo vode kot slepi reagent.
Vitro protivnetno aktivnost MEMM
In-vitro učinek MEMM na dušikovega oksida
Cell kulture in stimulacijo
RAW 264.7 celična linija (murine monocitnega makrofagov) (Evropski zbirki celičnih kultur, Porton Down Velika Britanija) smo vzdrževali v DMEM dopolni z 10% FBS, 4,5 g glukoze /L, L-glutamin (2 mM), natrijev piruvat (1 mM), penicilin (50 U /ml) in streptomicina (50 ug /ml) in 5% CO 2 pri 37 ° C. Celice (4 x 10 5 celic /jamico) smo zasejali v 96 vdolbinicami in inkubirali 2 uri pri 37 ° C v CO 2 inkubator, ki omogoča pritrditev celic in nato sprožili z dražljaji (100 U /ml IFN-g in 5 ug /ml LPS), z ali brez prisotnosti MEMM v koncentraciji, ki variira med 12,5-100 ug /ml. DMSO (nosilec) je bil uporabljen za raztapljanje MEMM. Končna koncentracija DMSO je zagotovljeno, da je 0,1% v vseh kulturah. Celice smo nato inkubirali 17-20 ur pri 37 ° C v CO 2 inkubatorja. NO ugotovitev je bila izvedena z izpostavitvijo kultivirano supernatant pred testom Griess in celice ostanejo v vodnjaku smo testirali sposobnosti preživetja celic testu
nitrit določitev
koncentracija nitrita (NO 2 . - ) stabilno metabolit NO v gojitvenem mediju, določimo z uporabo testa Griess [27]. Enak volumen Griess reagenta smo zmešali z supernatanta kulture in razvijanje barve smo izmerili pri 550 nm. Količina nitrita v supernatanta kulture smo določili na osnovi standardne krivulje natrijevega nitrita (0-100 uM) sveže pripravljenega v deionizirani vodi. Odstotek inhibicije smo izračunali s pomočjo formule spodaj: $$ \\ mathrm {NE} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ kjer; je
* kontrola raven nitrit IFN-y /LPS-induciranih skupina
Cell preživetja
citotoksičnosti MEMM na kultiviranih celic je bila določena s testiranjem zmanjšanja 3. - (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolijevega bromida (MTT) [27]. Reagenti MTT (0,05 mg /ml) smo suspendirali v sterilni PBS, pH 7,0 in nato dodamo v vsako jamico ki sledi odstranitev supernatant. Temu je sledilo inkubaciji preostalih celic pri 37 ° C za 4 h, čemur sledi dodajanje 100 ul v 100% DMSO v vdolbinice za raztapljanje formazana soli oblikovane. Absorbanco smo izmerili pri 570 nm. Odstotek preživetja celic smo izračunali po naslednji formuli: $$ \\ mathrm {Cell} \\ \\ mathrm {preživetja} \\ left (\\% \\ desno) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {nadzor}} * \\ H okvirju {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {vzorec}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Roman metoda, digitalni genom skeniranje zazna KRAS amplifikacijo gena v želodcu raka: udeležba prekomerno divjim tipom KRAS v prodajnem signalizacijo in raka celice growth
• Analiza genomske profil želodca raka difuzna tipa