Mechanismen der Gastroprotektion von Methanol-Extrakt aus Melastoma Malabathricum leaves

Mechanismen der Gastroprotektion von Methanol-Extrakt aus Melastoma Malabathricum
verlässt
Zusammenfassung
Hintergrund
Melastoma Malabathricum
L. (Melastomaceae) ist ein kleiner Strauch mit verschiedenen medizinische Anwendungen. Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um die magen Mechanismen der Methanol-Extrakt von M. malabathricum
Blätter (MEMM) bei Ratten zu bestimmen.
Methoden
Die Mechanismen der Extrakt von Gastroprotektion (50, 250, 500 mg /kg) mit der Pylorus-Ligatur in Rattenmodell wurden untersucht, wobei Volumen, pH-Wert, freiem und Gesamtsäuregehalt von Magensaft und Magenwand Schleim Inhalt bestimmt. Die Beteiligung von endogenem Stickstoffmonoxid (NO) und Sulfhydryl (SH) -Verbindungen in der gastroprotektiven Wirkung von MEMM wurden ebenfalls gemessen. MEMM zum Antioxidans unterzogen wurde, entzündungshemmende und phytochemical Analyse und HPLC-Profilerstellung.
Ergebnisse | MEMM enthielten verschiedene Phyto-Bestandteile mit Quercitrin als Teil von ihnen identifiziert. MEMM und Quercitrin: i) signifikant (p < 0,05) reduziert das Volumen und die Säure von Magensaft, während der pH und Magenwand Schleim Gehalt zu erhöhen .; ii) signifikant (p < 0,05) erhöhte sich das Niveau von SOD, GTP und GTR während signifikant (p < 0,05), um das Niveau von CAT, MPO und TBARS Aktivitäten reduziert .; iii) ausgeübt gastroprotektive Aktivität bei Verwendung des Ethanol-induzierten Magengeschwüren Test bewertet, die durch N G-nitro-L-Arginin-Methylester (L-NAME umgekehrt wurde, ein Inhibitor der NO-Synthase) und N
- Ethylmaleimid (NEM; a Sulfhydryl (SH) blocker). MEMM hemmte die Lipoxygenase (LOX) und Xanthin-Oxidase (XO) Aktivitäten mit der höchsten Affinität für das frühere während Quercitrin hohe Affinität für XO-Aktivität zeigte.
Schlussfolgerungen
MEMM eine gastroprotektive Aktivität zeigten zum Teil auf das Vorhandensein von Quercitrin, seine antioxidative und entzündungshemmende Aktivitäten und über die Modulation von NO und SH-Gruppen.
Schlüsselwörter Melastoma malabathricum
Melastomaceae Methanol Gastroprotektiver Mechanismen Stickstoffmonoxid Sulfhydrylgruppe Antioxidant Anti-inflammatory Hintergrund extrahieren
Verdauungs- Geschwüre sind eine häufige Erkrankung des gesamten Magen-Darm-Trakt. Von fast 8 bis 10% der Weltbevölkerung von Magengeschwüren betroffen, etwa 5% von ihnen von Magengeschwüren leiden [1]. Die Geschwüre, die den Magen-Darm-System betreffen, werden in der Regel durch ein Mißverhältnis zwischen destruktiven und defensiven Faktoren im Magen [1] noch verschärft. Obwohl als multifaktorielle Erkrankung betrachtet, ist es allgemein anerkannt, dass fast alle Magengeschwüre auf eine Infektion mit Helicobacter pylori
und dem therapeutischen Ziel verbunden sind, ist die H. pylori
Infektion zu beseitigen. Derzeit ist die First-Line-medizinische Behandlung von Magengeschwüren gezielt bei Eradikation von H. pylori-Infektion
und basieren in der Regel auf Triple-Behandlungsverfahren, die die Verwendung von Magengeschwür-Inhibitoren (Ie Histamin-H 2-Antagonisten beteiligt, Proton Pumpeninhibitoren oder Sucralfat und Wismut) in Kombination mit zwei Arten von Antibiotika [2]. Die Tatsache jedoch, dass es verschiedene andere Faktoren als H. pylori
die Magengeschwürsbildung auslösen kann, sollte nicht außer Acht gelassen werden [3]. Es wurden verschiedene Ansätze bei der Behandlung von Magengeschwüren, die mit jenen Nicht-H verwendet. pylori
-related Faktoren wie die Säuresekretion zu reduzieren und die Schleimproduktion zu erhöhen, aber diese Ansätze wurden als Second-Line-Behandlung betrachtet.
Trotz ihrer Wirksamkeit zur Eradikation von H. pylori
, die Behandlung ist komplex und von hohe Kosten, was die Verwendung von mindestens zwei Antibiotika in Kombination mit Magensäure-Inhibitoren beteiligt sind. Diese Kombination führt oft mehrere unerwünschte Nebenwirkungen (das heißt Antibiotikaresistenz, Wiederholung, Übelkeit) [2,3]. Trotz der Tatsache, dass H. pylori-Infektionen
allmählich im ganzen meisten industrialisierten Ländern zurückgegangen, eine schrittweise Erhöhung der Ausfall von H. pylori-Eradikation
Behandlungen wird an anderer Stelle beobachtet werden [2]. Dies wird auch durch die Assoziierung dieser Standard antiulcer Agenten mit verschiedenen unerwünschten Nebenwirkungen verschlechtern. Unter Berücksichtigung ihrer vielfältigen Nebenwirkungen und das Auftreten von Antibiotika-resistenten H. pylori-Stämme
, die Suche nach neuen und sicheren nicht-antibiotischen gastroprotektiver Arzneimittel aus natürlichen Quellen, insbesondere Pflanzen, auch weiterhin in der ganzen Welt zu erhöhen [2, 4].
Eine der Pflanzen, die verwendet werden, Magengeschwür in Malaysia zu behandeln, ist Melastoma malabathricum
L. (Familie Melastomaceae). Vor Ort auf der malaiischen bekannt als "Senduduk
', M. malabathricum
ist reichlich in den Indischen Ozean Island, in ganz Süd- und Südostasien, Taiwan, China, Südpazifik und Australien. Verschiedene Teile der Pflanze werden in Malay traditionelle Medizin verwendet, um eine Vielzahl von Beschwerden mit den Blättern zu behandeln, insbesondere, wurden verwendet, Magengeschwüren unter anderem [5] zu behandeln. Wissenschaftlich sind die M. malabathricum
Teile wurden verschiedene pharmakologische Wirkungen zeigen berichtet [5-7]. Anders als für die traditionelle Verwendung als Antiulkusmittel wurde M. malabathricum
in der vorliegenden Studie basiert auf der Tatsache gewählt, dass sie eine der berühmten Kräuter in Malay Heil Folklore ist, erhielt aber Mangel an Aufmerksamkeit in der Gemeinschaft. Außerdem M. malabathricum
wurde berichtet hohen Gesamtphenolgehalt enthalten und hohe antioxidative und entzündungshemmende Aktivitäten [5-7] auszuüben, die in den Mechanismen der antiulcer aller Verbindungen /Extrakte wichtig sind. Es ist bekannt, dass Magengeschwüren, insbesondere solche, die durch Ethanol induziert wird mit ROS-Erzeugung verbunden ist. Ethanol dringt rasch die Magenschleimhaut, wie es ist in der Lage, die Schutz Schleimhaut zu solubilisieren und verursacht die Freisetzung von hydroperoxy-freie Radikale und Superoxidanion. Diese freien Radikale verursachen eine Erhöhung des oxidativen Stress in den Geweben, die wiederum erhöht den Grad der Malondialdehyd, einem Marker der Lipidperoxidation erhöht. Insgesamt kann Ethanol-induzierten schädlichen Effekt direkt über Erzeugung von reaktiven Metaboliten oder indirekt andere Mechanismen über die Aktivierung manifestiert werden, die schließlich oxidative Schäden auslösen [7]. Daher Extrakte /Verbindungen mit Antioxidantien-Aktivität spielen eine sehr wichtige Rolle diese freien Radikale in Abfangen und Lipidperoxidation hemmen. Anstelle dieser, M. malabathricum
wurde eine bemerkenswerte antioxidative Aktivität [7] und daher auszuüben berichtet, wird angenommen, Antiulcer-Potential zu besitzen. Unsere frühere Screening von Methanol-Extrakt von M. malabathricum
(MEMM) für antiulcer Potential gegen Ethanol- und Indometacin-induzierten Magengeschwür Modelle wurde an anderer Stelle berichtet [8]. MEMM wurde gefunden Ethanol-induzierte zu dämpfen, aber Indomethacin-induzierten Magengeschwürbildung verschlimmert. Die Fähigkeit von MEMM auszuüben sowohl die Gastroprotektion und entzündungshemmende Aktivitäten [5] steht im Gegensatz zu der von Indomethacin, die nur anti-inflammatorische Aktivität ausübten. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass der Extrakt Gastroprotektion durch einen Mechanismus aktiviert, der nicht zu der anti-Entzündung verbunden ist. Außerdem könnte die anti-inflammatorische Aktivität von MEMM möglicherweise von der durch Indomethacin ausgeübt unterschied. ein Inhibitor der beiden COXs sein (d.h. COX-1 und COX-2), Indomethacin ist selektiver für COX-1, die für die Aufrechterhaltung der Schutz Magenschleimhaut Schicht erforderlich ist [9]. Die Fähigkeit von MEMM Indomethacin-induzierten Magengeschwürbildung zu intensivieren, legt nahe, dass MEMM könnte auch COX-1-Wirkung gehemmt und mit der Bildung von konstitutiven PG interferieren, die die Magenschleimhaut unter anderem zu schützen. Auf der anderen Seite wurde die Fähigkeit von MEMM entzündungshemmende Aktivität ausüben könnte aufgrund seiner Fähigkeit, die COX-2-abhängige Antwort mit dem Carrageenan-induzierten Ratten Pfotenödem Test assoziiert zu hemmen [5; 9]. Other than that, MEMM auch konträr PGE durch die Aktivierung von COX-2, was zu einer Erhöhung könnte funktionieren 2-Synthese, die berichtet wurde, zu einem ihrer Rezeptoren, die PGE-Rezeptor 4 (EP durch Bindung anti-inflammatorische Aktivität auszuüben 4) [10]. Darüber hinaus hat PGE 2 bekannt, die Vorläufer für die Bildung von Prostaglandinen cyclopentenon (CypG) zu sein, die anti-inflammatory [11] ausübt. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, die PGE 2 Synthese, die wiederum erhöht die Magenschleimproduktion zu aktivieren, kann durch die Aktivierung der EP 3 -Rezeptoren [10] auftreten. Dies kann wiederum dazu beitragen, die Fähigkeit der MEMM erklären zu zeigen entzündungshemmende Aktivität, während, zur gleichen Zeit, Antiulcer-Aktivität gegen die Ethanol- ausüben, aber nicht Indomethacin-induzierten Modell. Trotz dieser Vorschläge wurde kein Versuch unternommen, die möglichen Mechanismen der Gastroprotektion von MEMM zu bestimmen, die verwendet werden könnte, um die beobachtete Antiulkuswirksamkeit zu erklären.
Unter Berücksichtigung der oben genannten Bericht [8] und andere Berichte, hergestellt von Hussain et al. [6], der das antiulcer Potential wässriger Extrakt von M. malabathricum
mit nur einem Modell von Magengeschwüren (das heißt Ethanol-induzierten Modell), die aktuelle Untersuchung Entwürfe wurden bewertet. Obwohl M. malabathricum
hat nie in der Behandlung von H. pylori-Infektion
verwendet worden, die durch ihre schlechte antibakterielle Aktivität unterstützt wird [12,13], die traditionelle Verwendung der Anlage zur Behandlung von Magengeschwüren gerechtfertigt die Anwesenheit Forschung mit Hoffnung auf eine alternative /natürliche magenMittel als Ersatz für den derzeit verfügbaren Nebeneffekt-entblössen Medikamente in der Second-Line-Behandlung eingesetzt zu finden. unter Verwendung von verschiedenen Ratten-Modellen.
Methoden
Chemicals
Die Chemikalien in dieser Studie verwendeten analytischen Qualitäten Unter dieser Tatsache Rechnung, die vorliegende Studie zielte darauf ab über die möglichen Mechanismen der Gastroprotektion von MEMM zu untersuchen und war vorbereitet worden unmittelbar vor der Verwendung. Die folgenden Medikamente wurden verwendet: Ranitidin (Sigma Aldrich, USA), Quercitrin (Sigma Aldrich, USA), absolutem Ethanol (Fischer Scientific, USA), N-Ethylmaleimid (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G nitro-l-Arginin-Methyl-Ester (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), Carbenoxolon (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) und Diethylether (Fischer Scientific, USA).
Pflanzenmaterialien Sammlung und Vorbereitung von MEMM, die Blätter von M. malabathricum
wurden zwischen August und September 2010 von Serdang, Selangor, Malaysia, und die von einem Botaniker aus dem Institut für Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM) gesammelt, Serdang, Selangor, Malaysia. Ein Belegprobe, ACP-0017, wurde am Herbarium des IBS, UPM, Malaysia hinterlegt. Die gemahlenen getrockneten Blätter (40 g) wurden im Verhältnis von 1:20 mit Methanol für 24 h dreimal bei Raumtemperatur durchtränkt (w /v) und die Methanolüberstand wurde eingedampft (40 ° C) unter vermindertem Druck bis zur Trockne, was zu eine Ausbeute von 12,8 g getrocknet und klebrigen Methanol-Extrakt (Prozentsatz ergab ≈ 32% wurde).
phytochemical Screening und HPLC-Analyse von MEMM
die phytochemical Screening und die HPLC-Analyse von MEMM wurde nach der zuvor beschriebenen Methode durchgeführt [ ,,,0],7]. Phytochemischen Screening von MEMM wurde ausgeführt, um das Vorhandensein von Flavonoiden, Triterpene, um zu bestimmen, Gerbstoffe, Alkaloide und Saponine nach den üblichen Protokollen wie beschrieben below.i) Flavonoide
Etwa 10,0 g MEMM separat gekocht für 2 bis 3 min in 100 ml Wasser in einem Wasserbad. Bis 3 ml des Filtrats wurden 3 ml Säure-Alkohol (Ethanol: Wasser: Konzentrierte Chlorwasserstoffsäure im Verhältnis von 1: 1: 1), feste Magnesium (1 cm) und 1 ml t-Amyl-Alkohol zugesetzt waren. Die Mischungen wurden dann beobachtet für eine Rose-orange oder verletzen Farbe change.ii) Triterpene
Etwa 1,0 g MEMM getrennt wurde 24 h in Ether extrahiert. 1 ml des Filtrats wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand in mehrere Tropfen Essigsäureanhydrid gelöst und dann mit einigen Tropfen Schwefelsäure wurden zu der Lösung gegeben. Die Mischungen wurden dann für eine grüne Farbe change.iii beobachtet) Gerbstoffe
Etwa 0,2 g MEMM getrennt wurde in 5 ml Wasser gekocht. Die Mischungen wurden abgekühlt und filtriert. Ein paar Tropfen (3 Tropfen) von 5% Eisenchloridlösung wurden zu dem Filtrat gegeben und für eine blau-schwarze Niederschlag formation.iv) Alkaloids
Etwa 0,5 g MEMM wurde separat mit 10 gekocht beobachtet ml verdünnter Salzsäure (alkoholisch) in einem Teströhrchen für 5 min. Die Mischungen wurden abgekühlt und die Trümmer absetzen gelassen. Jeder der Überstände wurde in ein anderes Reagenzglas filtriert und 1 ml jeder Filtrat wurde genommen, in den drei Tropfen Dragendorffs Reagenz (Kalium Wismut Jodid-Lösung) wurde zugegeben, geschüttelt und beobachtet für das Auftreten eines orangeroter Fleck und einen Niederschlag formation.v) Saponine
Etwa 0,2 g MEMM wurde mit Wasser geschüttelt und die Mischung wurde einer persistenten Schaum beobachtet. die HPLC-Analyse von MEMM
wurde gemäß dem vorherigen Bericht [4 ], aber mit geringfügigen Änderungen. Kurz gesagt, MEMM (10 mg) wurde in 1 ml Methanol suspendiert. Die Lösung wurde durch eine Filterpatrone (Porengröße von 0,45 &mgr; m) vor der Analyse übergeben. Die filtrierte Probe wurde mit der HPLC-System analysiert, bestehend aus dem Waters Delta 600 mit 600-Steuerung, Photodiodenarray-Detektor (Waters 996). Und eine Phenomenex Luna (5 um) (Torrance, CA, USA) Säule (4,6 mm I.D. x 250 mm). Zwei Lösungsmittel bezeichnet als A und B wurden zur Elution der Bestandteile verwendet. A war 0,1% wässriger Ameisensäure und B war Acetonitril. Anfangsbedingungen waren 95% A und 5% B mit einem linearen Gradienten von 25% B bei t Erreichen
12 min und dieser Zustand wurde 8 = min gehalten. B reduziert wurde wieder auf 15% bei t = 22 min
und in diesem Zustand für weitere 8 min (t
= 30 min) gehalten. Bei t = 35 min
kehrte das Programm zu dem Anfangslösungsmittelzusammensetzung. Die Durchflussrate verwendet wurde, war 1,0 ml /min und das Injektionsvolumen betrug 10 ul. Der Säulenofen wurde bei 27 ° C eingestellt und das Elutionsmittel bei 210, 254, 280, 300, 330 und 366 nm überwacht wurde. Die Retentionszeiten, Spitzenflächen und UV-Spektren der Hauptpeaks wurden analysiert. Die HPLC-Analyse wurde im Labor von Phytotherapie, Heilpflanzen-Abteilung, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Malaysia durchgeführt
Versuchstiere
Männliche Sprague Dawley-Ratten (180-200 g; 8-10. 70-80% Luftfeuchtigkeit;; 12 h Licht /Dunkelheit-Zyklus) in Wochen alt) wurden von der Veterinärtiereinheit, Fakultät für Veterinärmedizin, Universiti Putra Malaysia (UPM), Malaysia und hielt unter Raumtemperatur (27 ± 2 ° C erhalten die Tier-Holding-Einheit, Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, UPM. Sie wurden mit Futter und Wasser ad libitum
vom Beginn der Experimente geliefert. Das Studienprotokoll der vorliegenden Studie wurde von der Animal House und Use Committee, Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, UPM (UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00449 Ethische Genehmigung nicht) zugelassen. Die Ratten wurden in Übereinstimmung mit den geltenden UPM Richtlinien für die Pflege von Labortieren und die ethischen Richtlinien für die Untersuchungen der experimentellen Schmerzen in der bewussten Tieren [14] behandelt. Alle Experimente wurden zwischen 09.30 und 18.30 Uhr durchgeführt, um die Auswirkungen von Veränderungen der Umwelt zu minimieren. Das Fasten wurde für 48 h vor allen Assays angewendet, wobei die Ratten Zugang erlaubt wurde nur Wasser.
Bestimmung der möglichen Mechanismen von Gastroprotektion von MEMM
Pylorus-Ligation-induzierte Ulzera
Pylorus-Ligation wurde entsprechend durchgeführt das Verfahren von Shay et al. [15] mit leichten Modifikationen. Dreißig Ratten wurden zufällig in fünf Gruppen aufgeteilt (n = 6). Gruppe-I (Kontrolle) wurde mit Vehikel behandelt (10% DMSO), Gruppe-II (positive Kontrolle, Ranitidin) bei 100 mg /kg (po) gegeben wurde, Gruppe-III, -IV und-V, wurden Ratten, die mit MEMM (50, 250 und 500 mg /kg, jeweils). Pylorus-Ligation wurde durchgeführt, 1 h nach der Verabreichung der Testverbindungen auf 48 h nüchternen Ratten. Ketamin HCl (100 mg /kg, intramuskulär) und Xylazin-HCl (16 mg /kg, intramuskulär) wurden verwendet, um die Ratten vor der Ligation des Pylorus zu betäuben. Ein 2 cm langen Schnitt in den Bauch knapp unterhalb des Brustbeins auf den narkotisierten Ratten gemacht. Der Magen wurde ausgesetzt, und ein Faden wurde um das Magenpförtner und gebunden in einem festen Knoten geleitet. Es wurde darauf geachtet, während der Bindung des Knotens zu Blutgefäßen in den Knoten zu vermeiden. Der Bauch wurde vernäht, und die Haut wurde von irgendwelchen Blutflecken oder Blutungen gereinigt. Die Tiere wurden 6 Stunden nach der Ligation durch Genickbruch getötet.
Bestimmung des Volumens, pH-Wert, freiem und Gesamtsäuregehalt von Mageninhalt
Die Mägen wurden entfernt, und der Inhalt wurde abgelassen, gesammelt und bei 2500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert für 10 min. Das Volumen und pH des Magensafts wurde gemessen und wurde von Srivastava et al freien und Gesamtsäure Schätzung gemäß dem Verfahren unterzogen. [16]. Freie Azidität wurde mit 0,01 N Natriumhydroxid durch Titration bestimmt (NaOH) mit Methylorange Reagenz, bis die Farbe der Lösung wurde gelblich. Das Volumen an zugegebenem Alkali festgestellt wurde. Dann werden zwei bis drei Tropfen Phenolphthalein hinzugegeben und die Lösung titriert, bis eine deutliche rosa Farbe erscheint. Das Gesamtvolumen NaOH hinzugefügt wurde festgestellt, und dies entspricht Gesamtsäure. Säure wurde mit der folgenden Formel berechnet: $$ \\ mathrm {} Acidität = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {der} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {Normalität} \\ kern0.5em \\ mathrm {der} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Schätzung der Magenwand Schleim Inhalt
Magenwand Schleimgehalt wurde durch das Verfahren, beschrieben von Corne bestimmt et al. [17] mit leichten Modifikationen. Der Magen wurde entlang der großen Kurvatur, gewogen geöffnet und in 0,16 M Saccharose /0,05 M Natriumacetat, pH 5,8 für 2 h in 10 ml von 0,1% Alcian Blau eingetaucht. Die überschüssigen Farbstoff wurde dann durch zwei aufeinanderfolgende Spülungen in 0,25 M Saccharoselösung (jeweils 15 min) entfernt. Der verbleibende Farbstoff mit den Magenschleim komplexiert wurden für 1 min in alle 30 Minuten-Intervall mit 0,5 M MgCl 2 für 2 h und geschüttelt intermittierend extrahiert. Der blaue Extrakt wurde dann kräftig mit einem gleichen Volumen Diethylether ausgeschüttelt, und die resultierende Emulsion wurde für 10 min bei 3600 rpm zentrifugiert. Die Absorption (OD) von Alcianblau in der wässrigen Schicht wurde bei 580 nm mit einem Spektrophotometer abgelesen. Magenschleimhaut-Läsionen in L-NAME vorbehandelten Ratten die Menge an Alcianblau Extrakt pro Gramm Nass Magen dann aus einer Standardkurve berechnet.
Ethanol-induzierte
Die Beteiligung von endogenem NO in Modulieren des Ethanol-induzierten gastroprotektive Aktivität wurde nach der Methode von Andreo et al. [18], aber mit geringfügigen Änderungen. Männliche Ratten wurden zufällig in zwölf Gruppen aufgeteilt (n = 6) und fasteten für 24 h, aber freien Zugang zu Wasser gelassen. (70 mg /kg, ein Inhibitor der NO-Synthase) Sie wurden dann mit Kochsalzlösung oder L-NAME vorbehandelt später intraperitoneal (ip) und 30 min werden die Tiere erhielten Vehikel (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positive Kontrollgruppe) oder 500 mg /kg MEMM (po). Eine Stunde nach der Verabreichung von Testlösungen wurde Ulcus ventriculi induziert unter Verwendung von 5 ml /kg absolutem Ethanol in allen Gruppen. Auf der anderen Seite, L-Arginin (200 mg /kg) verabreicht wurde, 30 min nach der Kochsalzlösung oder L-NAME-Behandlung und anschließend 30 min später von der ethanol Verabreichung. Alle Ratten wurden 1 h später durch Bestrahlen mit Diethylether getötet. Der Magen wurde entlang der großen Kurvatur geöffnet, um die Ulcusfläche (UA), um zu bestimmen, wie durch Balan et al. [19]. Der prozentuale Schutz wurde anhand der folgenden Formel berechnet: $$ \\ mathrm {Schutz} \\ left (\\% \\ rechts) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {Steuerung} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {R} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {behandelt} \\ \\ mathrm {Gruppe} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {Steuerung} \\ right)} \\ mal 100 \\% $$ Ethanol-induzierte Magenschleimhaut Läsion in NEM vorbehandelt Ratten
die Beteiligung Um zu untersuchen, Sulfhydryl (SH) -Gruppe in der Modulation der gastroprotektive Aktivität Ethanol-induzierten beschriebenen Verfahren, die von Andreo et al. [18] wurden mit geringfügigen Änderungen angenommen. Die Ratten wurden willkürlich in 12 Gruppen aufgeteilt (n = 6) und fasteten für 24 h, aber freien Zugang zu Wasser gelassen. Das Experiment begann mit Vorbehandlung (i.p.) von Kochsalzlösung oder NEM (10 mg /kg), einem Sulfhydryl (SH) Blocker. Dreißig Minuten nach der Vorbehandlung regiment wurden die Ratten verabreicht (po) mit Vehikel (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positive Kontrollgruppe) oder 500 mg /kg MEMM durch die Verabreichung von 5 ml /kg Ethanol folgte eine Stunde später Magenulceration zu induzieren. Alle Tiere wurden getötet, 1 h nach der Ethanol durch Bestrahlen mit Diethylether erhält. Der Magen wurde entfernt und Magen-Schäden wurde wie oben beschrieben bestimmt.
Biochemische Analyse von Magengewebe
die makroskopischen Analysen, Superoxid-Dismutase (SOD) [20], Katalase (CAT) [21], Myeloperoxidase (MPO) Nach [22], Glutathion-Peroxidase (GTP) [23], Glutathion-Reduktase (GTR) [24] und Thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS) [25] Enzymaktivitäten in den Magen Gewebe der Ratte wurden gemessen. Die Magenschleimhaut wurde aus dem Antrum Teil des Magens abgeschabt eine scrapper und gelagert bei 4 ° C für biochemische Abschätzung verwendet wird. Die ausrangiert Magenschleimhaut wurde ausgesetzt, um die Schleimhaut Homogenat (pH 7,2) herzustellen. Das Homogenat wurde dann bei 3000 Upm 10 min zentrifugiert und der Überstand wurde für die Analyse von Antioxidationsmittel-Typ auf Ethanol induzierten Schäden der Magenschleimhaut verwendet wird, erhalten. In allen antioxidative Abwehr Assays, Ranitidin (100 mg /kg) -pretreated Gruppe wurde als positive Kontrollgruppe betrachtet.
Bestimmung der SOD-Aktivität
Die Aktivität von SOD bestimmt wurde auf der Hemmung der Bildung von Nicotinamid-Adenin-Basis Dinucleotid, Phenazinmethosulfat und Amino-blau-Tetrazolium Formazan [20]. Etwa 0,5 ml Gewebehomogenat wurde mit 0,4 ml Ethanol und Chloroform-Gemisch und zentrifugiert gemischt. Zu dem Überstand Assaygemisch (Natriumpyrophosphat-Puffer (0,025 M, pH 8,3), Nitroblautetrazolium, Phenazinmethosulfat und reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADH)) zugegeben und inkubiert bei 30 ° C für 90 s. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Eisessig verhaftet und mit n
Butanol gemischt. Die Intensität der Farbe in Butanol entwickelt wurde bei 560 nm gemessen. Die SOD-Aktivität wurde durch den Grad der Hemmung dieser Reaktion gemessen und als Millimol /min /mg Protein ausgedrückt.
Bestimmung der CAT-Aktivität
wurde die Aktivität von CAT kolorimetrisch bei 620 nm untersucht, wie durch das Verfahren der beschriebenen Sinha [21]. Die Reaktionsmischung von 1,5 ml, enthaltend 1,0 ml Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml 2,0 M H 2 O 2 und 1,0 ml Gewebehomogenat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,0 ml von Dichromat-essigsäure-Reagens gestoppt (5% Kaliumdichromat und Eisessig-Gemisch im Verhältnis von 1: 3). Die Ergebnisse sind als Millimol /min /mg Protein ausgedrückt.
Bestimmung der MPO-Aktivität
die Aktivität von MPO wurde gemessen nach dem Verfahren von Bradley et al. [22], aber mit geringfügigen Änderungen. Die homogenisierten Proben wurden eingefroren und dreimal aufgetaut und bei 40 ° C bei 1500 g für 10 min zentrifugiert. Etwa 100 &mgr; l des homogenisierten Überstand wurde in 1,9 ml 10 mmol /l Phosphatpuffer (pH 6,0) und 1,0 ml von 1,5 mmol /LO-Dianisidin-hydrochlorid enthaltend 0,0005% (w /v) H 2 O hinzugefügt 2. Die Absorption wurde bei 450 nm auf einem UV-Spektrophotometer und der MPO-Aktivität im Magengewebe wurde wie umol /min /mg Protein.
Bestimmung der GTP-Aktivität ausgedrückt
Die Aktivität von GTP durch das Verfahren von Rotruck beschrieben gemessen wurde et al. [23] mit leichten Modifikationen. Das Reaktionsgemisch, das 0,2 ml enthielt 0,4 M, Tris - HCI-Puffer, pH 7,0, 0,1 ml 10 mM Natriumazid, 0,2 ml Gewebehomogenat (das Gewebe in 0,4 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0 homogenisiert), 0,2 ml Glutathion und 0,1 ml 0,2 mM Wasserstoffperoxid wurde dann 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,4 ml 10% TCA und Unterwerfung unter die Zentrifugationsverfahren verhaftet. Der Überstand wurde für die Glutathion-Gehalt untersucht durch Verwendung von Ellman-Reagens (19,8 mg von 5, 5'-dithiobisnitro benzoesäure (DTNB) in 100 ml 0,1% Natriumnitrat). Ein molarer Extinktionskoeffizient von 6,22 × 103 &mgr; mol wurde verwendet, um die Aktivität von GTP zu bestimmen. Die Enzymaktivität wurde als Internationale Einheiten der Enzymaktivität /g Protein ausgedrückt. Internationale Einheiten werden als umol Hydroperoxide transformiert /min /ml Enzym.
Bestimmung der GTR-Aktivität ausgedrückt
Die Höhe der GTR wurde durch das Verfahren von Ellman bestimmt [24]. Approximately1.0 ml Überstand wurde mit 0,5 ml Ellman-Reagens (19,8 mg von 5, 5'-dithiobisnitro benzoesäure (DTNB) in 100 ml 0,1% Natriumnitrat) und 3,0 ml Phosphatpuffer (0,2 M, pH 8,0 behandelt, ). Die Absorption wurde bei 412 nm gelesen, und der GTR-Aktivität wurde als umol /min /mg Gewebe ausgedrückt.
Bestimmung von TBARS Gehalt
Der Umfang LPO durch Analyse der Niveaus von TBARS in der Magenschleimhaut gemessen wurde gemäß dem vorherige Methode [25], aber mit geringfügigen Modifikationen. Zu 0,5 ml Gewebehomogenat, 1,5 ml 20% Essigsäure, 0,2 ml SDS und 1,5 ml TBA zugegeben. Die Mischung wurde auf 4 ml mit destilliertem Wasser und erhitzt 1 Stunde bei 95 ° C hergestellt. Nach dem Abkühlen wurden 4,0 ml Butanol-Pyridin-Mischung gegeben und gut geschüttelt. Diese Mischung wurde dann bei 4000 Upm 10 min zentrifugiert. Die organische Schicht wurde genommen und seine Absorption wurde bei 532 nm abgelesen und die Ergebnisse wurden als n mol /g Protein ausgedrückt.
Schätzung von Protein
Der Proteingehalt im Magengewebe nach der Methode von Lowry et geschätzt al. [26], aber mit geringfügigen Änderungen. Die Gewebeprobe und die Standards (1,0 mg /ml Rinderserumalbumin in doppelt destilliertem Wasser) in verschiedenen Röhrchen wurden mit 5,0 ml der Reagenzmischung (48% Natriumkaliumtartrat behandelt, 2% Kupfersulfat und 3% Natriumcarbonat in 1.48 (v /v)). Dann Folin Phenol-Reagens (1: 2) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben und für 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die optische Dichte wurde bei 710 nm unter Verwendung von Wasser als Reagenzienblind lesen.
In-vitro-anti-inflammatorische Aktivität von MEMM
In-vitro-Wirkung von MEMM auf Stickstoffmonoxid
Zellkultur und Stimulation
die RAW 264.7 Zelllinie (murine Monozyten-Makrophagen) (European Collection of Cell Cultures, Porton Down, UK) wurde mit 10% in DMEM aufrechterhalten ergänzt FBS, 4,5 g /L Glucose, L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin (50 U /ml) und Streptomycin (50 ug /ml) und 5% CO 2 bei 37 ° C. Die Zellen (4 × 10 5 Zellen /Vertiefung) wurden in eine 96-Well-Platte ausgesät und für 2 h bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator inkubiert, um die Anhaftung von Zellen zu ermöglichen, und dann ausgelöst, mit Stimuli (100 U /ml IFN-g und 5 ug /ml LPS) mit oder ohne die Anwesenheit von MEMM in der Konzentration im Bereich von 12,5 bis 100 &mgr; g /ml. DMSO (Vehikel) wurde verwendet, um die MEMM aufzulösen. Die Endkonzentration an DMSO wurde sichergestellt, 0,1% in allen Kulturen zu sein. Die Zellen wurden dann für 17-20 h bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator inkubiert. Die NO-Bestimmung durchgeführt, indem der Kulturüberstand gegen die Griess-Assay unterworfen wird und die restlichen Zellen in der Vertiefung wurden für die Lebensfähigkeit der Zellen-Assay getestet
Nitrite Bestimmung
Die Konzentration von Nitrit (NO 2 . - ) wurde ein stabiler Metabolit von NO in Kulturmedium unter Verwendung des Griess-Assay [27] bestimmt. Ein gleiches Volumen von Griess-Reagenz wurde mit dem Kulturüberstand vermischt und die Farbentwicklung wurde bei 550 nm gemessen. Die Menge an Nitrit in dem Kulturüberstand wurde auf der Basis der Standardkurve eines Natriumnitrit (0-100 uM) frisch zubereitet in entionisiertem Wasser bestimmt. Prozentsatz der NO-Hemmung unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times $$ 100 \\% bei;
* Kontrolle ist die Nitritgehalt von IFN-γ /LPS-induzierte Gruppe
Die Lebensfähigkeit der Zellen
Die Zytotoxizität von MEMM auf den kultivierten Zellen durch Bestimmung der Reduktion von 3 bestimmt. - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) [27]. Die MTT-Reagenzien (0,05 mg /ml) wurden in sterilem PBS, pH 7,0 suspendiert und dann in jede Vertiefung zugegeben anschließend an den Überstand zu entfernen. Dies wurde für 4 h bei 37 ° C durch die Inkubation der verbleibenden Zellen, gefolgt von der Zugabe von 100 &mgr; l 100% DMSO in die Vertiefungen befolgte die Formazan Salze aufzulösen gebildet. Die Extinktion wurde bei 570 nm gemessen. Der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach der folgenden Formel berechnet: $$ \\ mathrm {Zelle} \\ \\ mathrm {Lebensfähigkeit} \\ left (\\% \\ rechts) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {Steuerung}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {Beispiel}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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