Mecanismos de gastroproteção de extrato de metanol de Melastoma malabathricum leaves

mecanismos de gastroproteção de extrato de metanol de Melastoma malabathricum sai da arte abstracta
Fundo
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae)
é um pequeno arbusto com vários utilizações medicinais. O presente estudo foi realizado para determinar os mecanismos gastroprotective de extrato de metanol de M. malabathricum
folhas (Memm) em ratos.
Métodos
mecanismos do extrato de gastroproteção (50, 250, 500 mg /kg) foram estudadas utilizando o piloro-ligadura no modelo de rato em que o volume, o pH, a acidez livre e total de suco gástrico, e conteúdo parede muco gástrico foram determinados. O envolvimento dos compostos endógenos de óxido nítrico (NO) e sulfidrilo (SH) em o efeito gastroprotector do Memm também foram medidos. Memm foi submetido ao antioxidante, anti-inflamatório e fitoquímica análise e HPLC profiling.
Resultados
Memm continha várias fito-componentes com quercitrina ser identificado como parte deles. Memm quercitrina e: i) de forma significativa (p < 0,05) na redução do volume e acidez de suco gástrico e aumentar o pH e o conteúdo parede muco gástrico .; ii) significativamente (p < 0,05) aumentou o nível de SOD, GTP e GTR enquanto significativamente (p < 0,05) reduziu o nível de CAT, MPO e TBARS actividades .; iii) exerceram actividade gastroprotectora quando avaliadas utilizando o ensaio de úlcera gástrica induzida por etanol, que foi revertida por N L-nitro-L-arginina (ésteres metílicos de L-NAME, um inibidor da sintase de NO) e N
- ethylmaleimide (NEM, um sulfidrilo (SH) bloqueador). Memm inibiu a lipoxigenase (LOX) e actividades de xantina oxidase (XO) com a maior afinidade para o primeiro enquanto quercitrina demonstrou elevada afinidade para a actividade da XO.
Conclusões
Memm exibiu uma actividade gastroprotectora, devido em parte à presença de quercitrina, suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórios, e através da modulação dos grupos de nA e SH.
Palavras-chave
Melastoma malabathricum
Melastomaceae metanol extrair mecanismos gastroprotetora óxido nítrico grupo sulfidril antioxidante fundo anti-inflamatório
úlceras pépticas são um distúrbio comum de todo o trato gastrointestinal. De cerca de 8 a 10% da população mundial afectada por úlceras pépticas, aproximadamente 5% deles sofrem de úlceras gástricas [1]. As úlceras que afectam o sistema gastrintestinal são geralmente agravados por uma desproporção entre os factores destrutivos e defensivos no estômago [1]. Apesar de ser considerado como doença multifatorial, é geralmente reconhecido que quase todas as úlceras pépticas estão ligados à infecção por Helicobacter pylori
eo principal objetivo terapêutico é erradicar a infecção por H. pylori
. Atualmente, a primeira linha de tratamento médico de úlcera gástrica é destinado a erradicar a infecção por H. pylori
e, geralmente, com base no procedimento de tratamento triplo, que envolveu o uso de inibidores de úlcera gástrica (Ie histamina H 2-antagonistas, protão inibidores ou sucralfato e bismuto), em combinação com a bomba de dois tipos de antibióticos [2]. No entanto, o facto de existirem vários diferente de H. pylori
factores que podem provocar formação de úlcera gástrica não deve ser ignorado [3]. Várias abordagens têm sido utilizados no tratamento da úlcera gástrica associada com os não-H. pylori
factores relacionados com tais como a redução da secreção ácida e aumento da produção de muco, mas estas abordagens têm sido considerado como o tratamento de segunda linha.
Apesar de sua eficácia na erradicação da H. pylori
, o tratamento é complexo e de alto custo, que envolve a utilização de pelo menos dois antibióticos em combinação com inibidores da secreção ácida. Esta combinação muitas vezes provoca vários efeitos secundários indesejáveis ​​(isto é, resistência a antibióticos, a recorrência, náuseas) [2,3]. Apesar do fato de que as infecções de H. pylori
ter diminuído gradualmente ao longo de a maioria dos países industrializados, um aumento gradual da falha do H. pylori
tratamentos de erradicação é observado em outros lugares [2]. Isto é ainda piorar pela associação desses agentes antiúlcera convencionais com vários efeitos colaterais indesejáveis. Em consideração aos seus diversos efeitos adversos ea ocorrência de H. pylori
cepas resistentes a antibióticos, a busca de novas e seguras agentes gastroprotective não-antibiótico a partir de fontes naturais, especialmente plantas, continuam a aumentar em todo o mundo [2, 4].
Uma das plantas que são usadas para tratar úlcera gástrica na Malásia é Melastoma malabathricum
L. (família Melastomaceae). Localmente conhecido do Malay como 'Senduduk
', M. malabathricum
é encontrado em abundância no Oceano Índico Island, ao longo do Sul e Sudeste da Ásia, Taiwan, China, Oceano Pacífico do Sul e Austrália. Várias partes da planta são utilizadas na medicina tradicional Malay para tratar uma variedade de doenças com as folhas, em particular, têm sido utilizados no tratamento de úlceras gástricas, entre outros [5]. Cientificamente, o
partes M. malabathricum têm sido relatados para exibem várias actividades farmacológicas [5-7]. Excepto para seu uso tradicional como antiúlcera agente, M. malabathricum
foi escolhido no presente estudo com base no fato de que é uma das famosas ervas no folclore medicinal Malay, mas recebeu falta de atenção entre a comunidade. Além disso, M. malabathricum
tem sido relatado para conter alto conteúdo fenólico total e para exercer um antioxidante e as actividades anti-inflamatórias [5-7], que são importantes nos mecanismos de anti-úlcera de quaisquer compostos /extractos. É bem sabido que a úlcera gástrica, particularmente aqueles que induzem pelo etanol, está associada com a produção de ROS. Etanol penetra rapidamente a mucosa gástrica, uma vez que é capaz de solubilizar os mucosa de protecção e provoca a libertação de radicais livres e hidroperoxi-anião superóxido. Estes radicais livres causam um aumento do estresse oxidativo nos tecidos, o que, por sua vez, aumenta o nível de malondialdeído, um marcador de peroxidação lipídica aumentada. No geral, o efeito deletério induzida por etanol pode ser manifestada directamente através geração de metabolitos reactivos ou indirectamente através da activação de outros mecanismos que desencadeiam finalmente dano oxidativo [7]. Assim, os extractos /compostos com actividade antioxidantes desempenham um papel muito importante na eliminação os radicais livres e inibir a peroxidação lipídica. Em vez disto, M. malabathricum
foi reportado para exercer uma actividade antioxidante notável [7] e, portanto, acredita-se possuir potencial anti-úlcera. Nossa seleção anterior do extracto de metanol de M. malabathricum
(Memm) para antiúlcera potencial contra modelos de úlcera gástrica a etanol e induzida por indometacina tem sido relatado em outros lugares [8]. Memm foi encontrada para atenuar induzida pelo etanol, mas agravada, formação de úlcera gástrica induzida por indometacina. A capacidade de exercer Memm tanto a protecção gástrica e actividades anti-inflamatórias [5] é em contraste com a da indometacina, que só exerce uma actividade anti-inflamatória. Esta observação parece sugerir que o extracto gastroproteção activa através de um mecanismo que não está relacionado com a de anti-inflamação. Além disso, a actividade anti-inflamatória de Memm pode possivelmente diferia da exercida pela indometacina. Sendo um inibidor de ambos os COXs (isto é, a COX-1 e COX-2), a indometacina é mais selectivo para a COX-1, o que é necessário para manter a camada de protecção da mucosa gástrica [9]. A capacidade de Memm para intensificar a formação de úlcera gástrica induzida por indometacina sugere que Memm pode também inibiram a COX-1, a acção e interferir com a formação de PG constitutiva que ajudam a proteger a mucosa gástrica, entre outros. Por outro lado, a capacidade de Memm para exercer actividade anti-inflamatória pode ser devido à sua capacidade para inibir a resposta de COX-2 dependente associado com o teste de edema da pata do rato induzido por carragenina [5; 9]. Outras que, Memm também pode funcionar ao contrário através da activação de COX-2, levando a um aumento de PGE 2 de síntese, o que tem sido relatado para exercer actividade anti-inflamatória através da ligação a um dos seus receptores, o receptor de PGE 4 (PE 4) [10]. Além disso, a PGE 2 foi conhecido por ser o precursor para a formação de prostaglandinas ciclopentenônicas (cyPG) que exerce anti-inflamatório [11]. Além disso, a capacidade de activar a PGE 2 de síntese, que por sua vez aumenta a produção de muco gástrico, pode ocorrer através da activação do PE 3 receptores [10]. Isto pode ajudar a explicar novamente a capacidade de Memm para demonstrar a actividade anti-inflamatória, enquanto, ao mesmo tempo, exercem actividade anti-úlcera contra a etanol-, mas não modelo indometacina-induzida. Apesar destas sugestões, nenhuma tentativa foi feita para determinar os possíveis mecanismos de gastroproteção de Memm, que poderiam ser usados ​​para explicar o observado actividade anti-úlcera.
Tendo em conta o relatório acima mencionado [8] e outros relatórios feitos por Hussain et ai. [6], que avaliou o potencial antiúlcera do extrato aquoso da M. malabathricum
usando apenas um modelo de úlcera gástrica (ou seja, modelo induzida por etanol), o actual inquérito foram designs. Embora M. malabathricum
nunca foi usado no tratamento de H. pylori
infecção, o que é suportado pela sua fraca actividade antibacteriana [12,13], a utilização tradicional da planta para o tratamento de úlcera gástrica justificada a pesquisa de presença com a esperança de encontrar um agente gastroprotective alternativo /natural como um substituto para o lado drogas-descobrindo efeito disponíveis atualmente utilizados no tratamento de segunda linha. Levando em conta este facto, o presente estudo teve como objetivo investigar os possíveis mecanismos de gastroproteção de Memm usando modelos de vários ratos.
Métodos
Chemicals
Os produtos químicos utilizados neste estudo são de classes de análise e tinham sido preparados imediatamente antes da utilização. Foram utilizados os seguintes fármacos: ranitidina (Sigma Aldrich, EUA), quercitrina (Sigma Aldrich, EUA), etanol absoluto (Fischer Scientific, EUA), N-etilmaleimida (NEM) (Sigma-Aldrich, EUA), N L ésteres metílicos-nitro-L arginina (L-NAME) (Sigma-Aldrich, EUA), a carbenoxolona (CBX) (Sigma-Aldrich, EUA) e éter dietílico (Fischer Scientific, EUA).
recolha de materiais de plantas e preparação de Memm
as folhas de M. malabathricum
foram coletados entre agosto e setembro de 2010 a partir de Serdang, Selangor, na Malásia, e identificados por um botânico do Instituto de Biociências (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, na Malásia. Um espécime comprovante, ACP-0017, foi depositado no Herbário do IBS, UPM, na Malásia. As folhas trituradas secas (40 g) foram embebidos três vezes à temperatura ambiente durante 24 horas com metanol na proporção de 1:20 (w /v) e o sobrenadante metanol foi evaporada (40 ° C) sob pressão reduzida até à secura resultando em um rendimento de 12,8 g seco e pegajoso extracto de metanol (percentagem produziu foi ≈ 32%).
Fitofármaco rastreio e análise por HPLC de Memm
o rastreio fitoquímicos e a análise por HPLC de Memm foi realizada de acordo com o método relatado anteriormente [ ,,,0],7]. Triagem fitoquímica de Memm foi realizado para determinar a presença de flavonóides, triterpenos, taninos, alcalóides e saponinas de acordo com os protocolos convencionais como below.i descrito) Flavonóides
Aproximadamente 10,0 g de Memm foi fervida separadamente durante 2 a 3 minutos em 100 ml de água em um banho-maria. A 3 mL do filtrado, 3 ml de ácido-álcool (etanol: água: ácido clorídrico concentrado na proporção de 1: 1: 1), de magnésio sólido (1 cm) e 1 ml de t-amil-álcool foram adicionados. As misturas foram então observados por uma rosa-alaranjado ou violar change.ii cor) Triterpenos
Aproximadamente 1,0 g de Memm foi extraído separadamente por 24 h em éter. 1 ml do filtrado foi evaporado até à secura e o resíduo redissolvido em várias gotas de anidrido acético e, em seguida, várias gotas de ácido sulfúrico foram adicionados à solução. As misturas foram depois observados durante um change.iii cor verde) Taninos
Aproximadamente 0,2 g de Memm foi fervida separadamente em 5 ml de água. As misturas foram arrefecidas e filtrou-se. Algumas gotas (3 gotas) de uma solução de cloreto férrico a 5% foram adicionados ao filtrado e observados durante um formation.iv precipitado azul-preto) Alcalóides
Aproximadamente 0,5 g de Memm foi fervida com 10 separadamente ml de ácido clorídrico diluído (alcoólica) num tubo de ensaio durante 5 min. As misturas foram arrefecidas e os detritos foi deixada assentar. Cada um dos líquidos sobrenadantes foi filtrada para um outro tubo de ensaio e 1 ml de cada filtrado foi tomado em que três gotas de reagente de Dragendorff (potássio bismuto solução de iodeto) foi adicionado, agitado e observado o aparecimento de uma mancha cor de laranja-vermelho e um precipitado formation.v) saponinas
Aproximadamente 0,2 g de Memm foi agitada com água e a mistura foi observado para uma espuma persistente.
a análise HPLC de Memm foi realizada de acordo com o relatório anterior [4 ], mas com ligeiras modificações. Em breve, Memm (10 mg) foi suspenso em 1 ml de metanol. A solução foi passada através de um cartucho de filtro (tamanho de poro de 0,45 um) antes da análise. A amostra filtrada foi analisada usando o sistema de HPLC consistindo da Waters Delta 600 com 600 controlador, detector de arranjo de diodos (Waters 996). E uma coluna Phenomenex Luna (5 um) (Torrance, CA, EUA) coluna (4,6 mm d.i. x 250 mm). Dois solventes indicados como A e B foram utilizados para a eluição dos constituintes. A foi 0,1% de ácido fórmico aquoso e B foi acetonitrilo. As condições iniciais foram de 95% A e 5% de B com um gradiente linear atingir 25% de B, em t = 12 min
e esta condição foi mantida durante 8 min. B foi reduzida para 15% em
t = 22 min e manteve-se esta condição durante mais 8 min (t = 30 min
). No
t = 35 min, o programa devolvido à composição inicial de solvente. O caudal usado foi de 1,0 ml /min e o volume de injecção foi de 10 ul. O forno da coluna foi fixada em 27 ° C e o eluente foi monitorizado a 210, 254, 280, 300, 330 e 366 nm. Os tempos de retenção, as áreas dos picos e espectros de UV dos principais picos foram analisados. A análise HPLC foi realizada no Laboratório de Phytomedicine, Plantas Medicinais divisão, Instituto de Pesquisa Florestal da Malásia (FRIM), Kepong, Malásia animais
experimentais
ratos Sprague Dawley (180-200 g; 8-10. semanas de idade) foram obtidos a partir da Unidade de Veterinária animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universiti Putra Malaysia (UPM), Malásia e mantidos sob temperatura ambiente (27 ± 2 ° C; 70-80% de umidade; 12 h ciclo de luz /escuridão) em Unidade de animal Segurar, Faculdade de Medicina e Ciências da Saúde, a UPM. Eles foram abastecidos com alimento e água ad libitum
a partir do início das experiências. O protocolo de estudo do presente estudo foi aprovado pela Câmara Animal e Comitê de Uso da Faculdade de Medicina e Ciências da Saúde, a UPM (aprovação ética não: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00449). Os ratos foram tratados de acordo com as diretrizes atuais UPM para o cuidado de animais de laboratório e as diretrizes éticas para as investigações de dor experimental em animais conscientes [14]. Todos os experimentos foram realizados entre 09.30 e 18.30 h para minimizar os efeitos das mudanças ambientais. O jejum foi aplicada durante 48 h antes de todos os ensaios em que os ratos tiveram acesso a apenas água.
Determinação dos possíveis mecanismos de gastroproteção de Memm
Piloro ulceração induzida por ligadura
Piloro de ligação foi realizada de acordo com o método por Shay et ai. [15] com ligeiras modificações. Trinta ratos foram aleatoriamente divididos em 5 grupos (n = 6). Grupo I (controlo) foi tratado com veículo (DMSO a 10%), Grupo II (controlo positivo, ranitidina) foi determinada a 100 mg /kg (po), do grupo III, e -IV-V, os ratos foram tratados com Memm (50, 250 e 500 mg /kg, respectivamente). Piloro de ligação foi realizado 1 hora após a administração dos compostos de ensaio em 48 ratos em jejum h. HCl cetamina (100 mg /kg, por via intramuscular) e HCl xilazina (16 mg /kg, por via intramuscular) foram usadas para anestesiar os ratos antes da ligação do piloro. A 2 cm de comprimento Foi feita uma incisão no abdómen, logo abaixo do esterno em ratos anestesiados. O estômago foi exposto, e uma linha foi passada ao redor do esfíncter pilórico e amarrado em um nó apertado. Foi tomado cuidado ao amarrar o nó para evitar que envolve os vasos sanguíneos do nó. O abdômen foi suturada, ea pele foi limpa de quaisquer manchas de sangue ou sangramento. Os animais foram sacrificados 6 horas após a ligação por deslocamento cervical.
Determinação do volume, pH, acidez total e livre de conteúdo gástrico
Os estômagos foram removidos, e os conteúdos foram drenados para fora, recolhido e centrifugado a 2500 rpm durante 10 min. O volume e o pH do suco gástrico foi medida e foi submetido a estimativa acidez livre e total de acordo com o método descrito por Srivastava et ai. [16]. acidez livre foi determinado por titulação com 0,01 N de hidróxido de sódio (NaOH) com o reagente de laranja de metilo até a cor da solução tornou-se amarelada. O volume de álcali adicionado foi observada. Em seguida, adicionou-se duas a três gotas de fenolftaleína e a solução foi titulada até que uma cor rosa clara aparece. O volume total de NaOH adicionada foi notada e isto corresponde a acidez total. Acidez foi calculada utilizando a seguinte fórmula: $$ \\ mathrm {acidez} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {de} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normalidade} \\ kern0.5em \\ mathrm {de} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ estimativa do teor de parede de muco gástrico
conteúdo parede muco gástrico foi determinada pelo método descrito por Corne et al. [17] com ligeiras modificações. O estômago foi aberto ao longo da curvatura maior, pesados ​​e imersos em 10 ml de 0,1% de azul Alcian em sacarose 0,16 M de etilo /sódio 0,05 M, pH 5,8 durante 2 h. O corante excesso foi então removido por duas lavagens sucessivas em solução de sacarose 0,25 M (15 min cada). O corante remanescente complexado com o muco gástrico foram extraídas com 0,5 M MgCl 2 durante 2 h e agitou-se intermitentemente durante 1 min em cada intervalo de 30 min. O extracto de azul foi então agitada vigorosamente com um volume igual de éter dietílico e a emulsão resultante foi centrifugada a 3600 rpm durante 10 min. A absorvância (DO) de azul Alcian na camada aquosa foi lida a 580 nm utilizando um espectrofotómetro. A quantidade de Azul de Alcian extrair por estômago molhada gramas foi então calculada a partir de uma curva padrão. Lesão da mucosa gástrica induzida por etanol
em L-NAME ratos pré-tratados
O envolvimento do NO endógeno na modulação da gastroprotetora induzida por etanol a actividade foi determinada de acordo com o método de Andreo et ai. [18], mas com ligeiras modificações. ratos machos foram divididos aleatoriamente em doze grupos (n = 6) e em jejum durante 24 h, mas permitiu o acesso livre à água. Eles foram, em seguida, pré-tratados com solução salina ou com L-NAME (70 mg /kg; um inibidor da sintase de NO) por via intraperitoneal (IP) e 30 min mais tarde, os animais receberam veículo (DMSO a 10%), 100 mg /kg CBX (positiva grupo de controlo) ou 500 mg /kg Memm (PO). Uma hora após a administração de soluções de teste, úlcera gástrica foi induzida utilizando 5 mL /kg de etanol absoluto em todos os grupos. Por outro lado, a L-arginina (200 mg /kg) foi administrado, 30 minutos após soro fisiológico ou L-NAME e tratamento, seguido 30 minutos mais tarde pela administração de etanol. Todos os ratos foram sacrificados 1 hora mais tarde por exposição a éter dietílico. O estômago foi aberto ao longo da curvatura maior para determinar a área da úlcera (UA), como descrito por Balan et ai. [19]. A protecção percentual foi calculada utilizando a seguinte fórmula: $$ \\ mathrm {Protecção} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {controle} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {tratados} \\ \\ mathrm {group} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {a} \\ \\ mathrm {controle} \\ right)} ratos \\ times 100 \\% $$ induzida por etanol lesão da mucosa gástrica em NEM pré-tratados
Para investigar o envolvimento de grupo sulfidrilo (SH) na modulação da actividade protectora gástrica induzida pelo etanol, os procedimentos descritos por Andreo et ai. [18] foram aprovadas com ligeiras modificações. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 12 grupos (n = 6) e em jejum durante 24 h, mas permitiu o acesso livre à água. A experiência começou com pré-tratamento (i.p.) de soro salino ou NEM (10 mg /kg), um sulfidrilo (SH) bloqueador. Trinta minutos após o regimento pré-tratamento, os ratos foram administrados (po) com veículo (DMSO a 10%), 100 mg /kg CBX (grupo de controlo positivo) ou 500 mg /kg Memm seguido pela administração de 5 mL /etanol kg uma hora mais tarde para induzir a ulceração gástrica. Todos os animais foram sacrificados 1 hora depois de ter recebido o etanol por exposição a éter dietílico. O estômago foi removido e dano gástrico foi determinada como descrito acima.
Análise bioquímica dos tecidos do estômago
Seguindo a análise macroscópica, superóxido dismutase (SOD) [20], a catalase (CAT) [21], mieloperoxidase (MPO) [22], glutationa peroxidase (GTP) [23], glutationa redutase (GTR) [24] e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) [25] actividades enzimáticas nos tecidos do estômago do rato foram medidos. A mucosa gástrica foi raspada a partir da porção antral do estômago utilizando um raspador e armazenado a 4 ° C para a estimativa bioquímica. A mucosa gástrica desmantelada foi submetido a preparar o homogenato mucosa (pH 7,2). O homogenato foi então centrifugado a 3000 rpm durante 10 min e o sobrenadante obtido foi utilizado para a análise de tipo antioxidante em etanol induzida lesão da mucosa gástrica. Em todos os ensaios de defesa antioxidantes, ranitidina (100 mg /kg) Grupo de -pretreated foi considerado o grupo de controlo positivo.
Determinação da actividade da SOD
A actividade de SOD foi determinada com base na inibição da formação de nicotinamida adenina dinucleotídeo, metossulfato de fenazina e amino azul de tetrazólio formazan [20]. Cerca de 0,5 mL de homogenato de tecido foi misturado com 0,4 ml de etanol e mistura de clorofórmio e centrifugado. Para o sobrenadante, mistura de ensaio (tampão de pirofosfato de sódio (0,025 M, pH 8,3), nitroazul de tetrazólio, metossulfato de fenazina e forma reduzida do dinucleótido de nicotinamida-adenina (NADH)) foi adicionado e incubado a 30 ° C durante 90 s. A reacção foi interrompida por adição de ácido acético glacial e misturou-se com n-butanol
. A intensidade da cor desenvolvida em butanol foi medida a 560 nm. A actividade da SOD foi medido pelo grau de inibição desta reacção e é expressa como milimole /min /mg de proteína.
Determinação de actividade de CAT
A actividade de CAT foi ensaiada por colorimetria a 620 nm, tal como descrito pelo método de Sinha [21]. A mistura de reacção de 1,5 ml contendo 1,0 ml de tampão fosfato (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml de 2,0 M H 2O 2 e 1,0 ml de tecido homogeneizado. A reacção foi parada pela adição de 2,0 ml de solução de ácido acético-dicromato (dicromato de potássio a 5% e mistura de ácido acético glacial na proporção de 1: 3). Os resultados são expressos como milimole /min /mg de proteína.
Determinação da actividade de MPO
A actividade da MPO foi medida de acordo com o método descrito por Bradley et ai. [22], mas com ligeiras modificações. As amostras homogeneizadas foram congeladas e descongeladas por três vezes e centrifugou-se a 1500 g durante 10 min a 40 ° C. Aproximadamente 100 ul do sobrenadante de homogeneizado foi adicionada a 1,9 ml de tampão 10 mmol /l de fosfato (pH 6,0) e 1,0 ml de 1,5 mmol /cloridrato de LO-dianisidina contendo 0,0005% (w /v) H 2O 2. A absorvância foi avaliada a 450 nm num espectrofotómetro de UV e a actividade de MPO nos tecidos gástricos foi expressa como umoles /min /mg de proteína.
Determinação da actividade de GTP
A actividade de GTP foi medida pelo método descrito por Rotruck et ai. [23] com ligeiras modificações. A mistura reaccional, a qual continha 0,2 ml de 0,4 M, Tris - HCl, pH 7,0, azida de sódio a 0,1 ml de 10 mM, 0,2 ml do homogenato de tecido (homogeneizado do tecido em tampão Tris-HCl a 0,4, pH 7,0), 0,2 glutationa ml e 0,1 ml de peróxido de hidrogénio 0,2 mM foi então incubada à temperatura ambiente durante 10 min. A reacção foi interrompida por adição de 0,4 ml de TCA a 10% e a sujeição ao processo de centrifugação. O sobrenadante foi analisado para teor de glutationa, utilizando o reagente de Ellman (19,8 mg de 5, ácido benzóico 5'-dithiobisnitro (DTNB) em 100 ml de nitrato de sódio a 0,1%). Um coeficiente de extinção molar de 6,22 × 103 umol foi usada para determinar a actividade de GTP. A actividade da enzima foi expressa em unidades internacionais de actividade enzimática /g de proteína. unidades internacionais são expressos como umoles de hidroperóxidos transformadas /min /ml de enzima.
Determinação da actividade da GTR
O nível de GTR foi determinado pelo método de Ellman [24]. Approximately1.0 ml de sobrenadante foi tratado com 0,5 ml de reagente de Ellman (19,8 mg de 5, ácido benzóico 5'-dithiobisnitro (DTNB) em 100 ml de nitrato de sódio a 0,1%) e 3,0 ml de tampão de fosfato (0,2 M, pH 8,0 ). A absorvância foi lida a 412 nm e a actividade foi expressa como GTR umoles /min tecido /mg.
Determinação do conteúdo de TBARS
A extensão de LPO foi medida através da análise dos níveis de TBARS na mucosa gástrica de acordo com o método anterior [25], mas com pequena modificação. A 0,5 mL de homogenato de tecido, 1,5 ml de ácido acético a 20%, 0,2 ml de SDS e 1,5 ml de TBA foram adicionados. A mistura foi feita até 4 ml com água destilada e aqueceu-se durante 1 hora a 95 ° C. Após arrefecimento, foi adicionado 4,0 ml de uma mistura de butanol-piridina e bem agitada. Esta mistura foi então centrifugada a 4000 rpm durante 10 min. A camada orgânica foi retirada e a sua absorvância foi lida a 532 nm e os resultados foram expressos como a proteína N mol /g.
Estimativa da proteína
O teor de proteína no tecido gástrico foi calculada de acordo com o método de Lowry et ai. [26], mas com ligeiras modificações. A amostra de tecido e os padrões (1,0 mg /ml de albumina de soro bovino em água duplamente destilada) em diferentes tubos foram tratados com 5,0 ml de mistura de reagente (48% de tartarato de potássio de sódio, sulfato de cobre a 2% e carbonato de sódio a 3% em 01:48 (v /v)). Em seguida, o reagente de Folin fenol (1: 2) foi adicionado à mistura de reacção e deixou-se repousar durante 30 min à temperatura ambiente. A densidade óptica foi lida a 710 nm utilizando água como branco de reagente.
In vitro actividade anti-inflamatória de Memm
in vitro efeito de óxido nítrico sobre Memm
cultura celular e estimulação in the RAW 264.7 a linha de células (macrófagos monocíticos murinos) (European Collection of Cell Cultures, Porton Down, Reino Unido) foi mantida em DMEM suplementado com FBS a 10%, 4,5 g /L de glucose, L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), penicilina (50 U /ml) e estreptomicina (50 ug /ml) e 5% de CO 2 a 37 ° C. As células (4 × 10 5 células /poço) foram semeadas numa placa de 96 poços e incubadas durante 2 h a 37 ° C num CO 2 incubadora para permitir a ligação das células, e, em seguida, desencadeada com estímulos (100 U /ml de IFN-g e 5 ug /ml de LPS), com ou sem a presença de Memm na concentração variando entre 12,5-100 mg /ml. DMSO (veículo) foi utilizado para dissolver o Memm. A concentração final de DMSO foi assegurada a ser de 0,1% em todas as culturas. As células foram então incubadas durante 17-20 h a 37 ° C num CO 2 incubadora. O NO determinação foi realizada submetendo o sobrenadante de cultura contra o ensaio de Griess e as células restantes no poço foram testados para o ensaio de viabilidade celular
determinação Nitrito
A concentração de nitrito (NO 2 . - ), um metabolito estável do nO no meio de cultura, foi determinada utilizando o ensaio de Griess [27]. Um volume igual de reagente de Griess foi misturado com o sobrenadante da cultura e o desenvolvimento da cor foi medido a 550 nm. A quantidade de nitrito no sobrenadante da cultura foi determinada com base na curva padrão de nitrito de sódio (0-100? M) preparada de fresco em água desionizada. Percentagem do NO inibição foi calculada usando a fórmula abaixo: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ onde;
* controle é o nível de nitrito de IFN-γ /induzida por LPS grupo viabilidade celular
A citotoxicidade de Memm sobre as células de cultura foi determinada por ensaio de redução de três. - (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) [27]. Os reagentes de MTT (0,05 mg /ml) foram suspensas em PBS estéril, pH 7,0 e, em seguida, adicionado a cada poço para subsequente remoção do sobrenadante. Isto foi seguido pela incubação das células restantes a 37 ° C durante 4 h seguida pela adição de 100 ul de DMSO a 100% para os poços para dissolver os sais de formazano formados. A absorvância foi medida a 570 nm. A percentagem de viabilidade celular foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: $$ \\ mathrm {celular} \\ \\ mathrm {viabilidade} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {controle}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {exemplo}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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