Mechanizmy žalúdočným metanolu extrakt z melastoma malabathricum listy

Mechanizmy žalúdočným metanolu extraktu melastoma malabathricum
opustí
Abstract Background
melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) je malý ker s rôznymi liečivými použitia. Táto štúdia bola vykonaná s cieľom určiť pred žalúdočným mechanizmy metanolu extraktu M. malabathricum
listy (Memmo) u potkanov.
Metódy
mechanizmov extraktu z žalúdočným (50, 250, 500 mg /kg) boli študované pomocou pylorus ligácia v potkaním modelu, kde boli objem, pH, voľného a celkového kyslosť žalúdočnej šťavy, a žalúdočný obsah stena hlienu určená. Zapojenie endogénnej produkcii oxidu dusnatého (NO) a sulfhydrylové (SH) zlúčenín v žalúdočnom účinku Memmo boli tiež merané. Memmo bol podrobený antioxidantu, protizápalové a fytochemikálie analýza HPLC a profilovanie.
Výsledky
Memmo obsahoval rôzne Fyto zložky s kvercitrín identifikované ako časť z nich. Memmo a kvercitrín: i) významne (p menšie ako 0,05) znižuje objem a kyslosť žalúdočnej šťavy pri zvyšovaní pH a obsah žalúdočnej steny hlienu.; ii) významne (p menšie ako 0,05), zvýšila úroveň SOD, GTP a GTR a zároveň významne (p menšie ako 0,05) znižuje hladinu CAT, MPO a TBARS činnosti.; iii) vyvíjaný gastroprotektívnymi aktivitu, keď sú hodnotená pomocou žalúdočný vred testu etanol-indukovanej, ktorý bol obrátený N G-nitro-L-arginín metylestery (L-NAME, inhibítor NO syntázy) a N
- ethylmaleimide (NEM, sulfhydrylové (SH) blokátor). Memmo inhibuje lipoxygenázy (LOX) a xantínoxidázy činnosti (XO) s najvyššou afinitou pre bývalý, zatiaľ čo kvercitrín vykazoval vysokú afinitu k XO aktivitu.
Závery
Memmo vykazovali gastroprotektívnymi aktivitu čiastočne spôsobená prítomnosťou kvercitrín, jeho antioxidačné a protizápalové aktivity, a cez moduláciu skupín nie a SH.
Kľúčové
melastoma malabathricum
Melastomaceae metanol extrahovať žalúdočným mechanizmy oxid dusnatý sulfhydrylovú skupinou antioxidant protizápalové pozadí
peptické vredy sú bežná porucha celého gastrointestinálneho traktu. Takmer 8 až 10% svetovej populácie zasiahnutej žalúdočných vredov, približne 5% z nich trpí žalúdočné vredy [1]. Vredy, ktoré majú vplyv na zažívací trakt sa obvykle zhoršuje disproporcie medzi deštruktívne a obranné faktory v žalúdku [1]. Aj keď považované za multifaktoriálne ochorenie, je všeobecne známe, že takmer všetky peptické vredy sú spojené s infekciou Helicobacter pylori stroje a hlavný terapeutický účel je na eradikáciu H. pylori
infekciu. V súčasnej dobe je v prvej línii liečenie žalúdočného vredu je zameraný na odstránenie Helicobacter pylori infekcii stroje a zvyčajne založené na trojité liečebného postupu, ktorý zahŕňal použitie inhibítorov žalúdočný vred (Ie histamínu H 2-antagonisti, protón čerpadlo inhibítory alebo sukralfát a bizmut) v kombinácii s dvoma typmi antibiotík [2]. Avšak skutočnosť, že existujú rôzne faktory, iné ako H. pylori
, ktoré môžu vyvolať tvorbu žalúdočný vred by nemala byť ignorovaná [3]. Rôzne prístupy boli použité na liečbu žalúdočných vredov spojených s týmito non-H. Pylori
spojené so štúdiom faktory, ako je zníženie sekrécie kyseliny a zvýšenie produkcie hlienu, ale tieto prístupy boli považované za liečba druhej línie.
Napriek ich účinnosti v eradikácii H. pylori
, liečba je zložitá a vysoké náklady, zahŕňajúce použitie aspoň dvoch antibiotík v kombinácii s inhibítorom žalúdočných kyselín. Táto kombinácia často spôsobuje niekoľko nežiaducich vedľajších účinkov (tj. Rezistencia voči antibiotikám opakovanie, nevoľnosť) [2,3]. Napriek tomu, že H. pylori infekcie
postupne znížila v priebehu väčšiny priemyselných krajín, postupné zvyšovanie zlyhanie H. pylori
eradikáciu ošetrení sa uviedol na inom mieste [2]. To je ďalej zhorší o pridružení týchto štandardných antiulceróznych látok s rôznymi nežiaducimi vedľajšími účinkami. S ohľadom na ich rôznych nežiaducich účinkov a výskyt rezistentných voči antibiotikám H. pylori
kmeňov, hľadanie nových a bezpečných non-antibiotiká gastroprotektívnymi látok z prirodzených zdrojov, najmä rastliny, aj naďalej zvyšovať po celom svete [2, 4].
Jedna z rastlín, ktoré sa používajú na liečbu žalúdočný vred v Malajzii je melastoma malabathricum
L. (rodina Melastomaceae). Známy miestne Malay ako "Senduduk
", M. malabathricum
sa vyskytuje hojne v Indickom oceáne ostrova, v celej južnej a juhovýchodnej Ázie, Taiwanu, Číny, Južnej Tichý oceán a Austrálie. Rôzne časti rastliny sa používajú v Malay tradičnej medicíne na liečbu mnohých ochorení s listami, a to najmä, boli použité na liečbu žalúdočných vredov medzi ostatnými [5]. Vedecky sa M. malabathricum
časti boli hlásené vykazujú rôzne farmakologické aktivity [5-7]. Iné ako na tradičné použitie ako protivredové činidlo, M. malabathricum
bol vybraný v tejto štúdii na základe skutočnosti, že je jedným z najznámejších bylín v Malay liečivého folklóru, ale nedostala nedostatok pozornosti medzi komunity. Navyše, M. malabathricum
bolo hlásené, že obsahujú vysoký celkový obsah fenolických a vyvíjať vysokú antioxidačné a protizápalové aktivity [5-7], ktoré sú dôležité v mechanizmoch protivredové akýchkoľvek zlúčenín /extraktov. Je dobre známe, že žalúdočný vred, a to najmä tie, ktoré indukujú etanol, je spojená s ROS generácie. Etanol rýchlo preniká do žalúdočnej sliznice, ako je schopný rozpustiť ochrannej hlienu a spôsobuje uvoľňovanie hydroperoxy-voľných radikálov a peroxidový anión. Tieto voľné radikály spôsobí zvýšenie oxidačného stresu v tkanivách, čo na oplátku zvyšuje hladinu malondialdehydu, marker zvýšenej peroxidácie lipidov. Celkovo možno povedať, etanol-indukovanej škodlivý účinok sa môže prejaviť priamo prostredníctvom tvorby reaktívnych metabolitov, alebo nepriamo prostredníctvom aktivácie iných mechanizmov, ktoré nakoniec vedú k oxidačné poškodenia, [7]. Z tohto dôvodu, extrakty /zlúčeniny s aktivitou antioxidantmi hrajú veľmi dôležitú úlohu vo výfukovom tie voľné radikály a inhibujú peroxidáciu lipidov. Namiesto toho, M. malabathricum
bola označená vyvíjať značnú antioxidačnú aktivitu [7], a preto sa predpokladá, že majú protivredový potenciál. Naše skoršie screening metanolu extraktu M. malabathricum
(Memmo) pre protivredové potenciál proti etanol a indometacín vyvolané modely žalúdočných vredov bola označená na inom mieste [8]. Memmo bolo zistené, že zoslabenie etanolom indukované, ale zhoršuje, žalúdočný vred formácie indometacínom indukovanej. Schopnosť Memmo vyvíjať ako žalúdočnom a protizápalové účinky [5], je v kontraste k tomu indometacínu, ktorý len pôsobiaci protizápalovú aktivitu. Toto pozorovanie naznačuje, že extrakt aktivuje žalúdočným prostredníctvom mechanizmu, ktorý nie je spojený sa, že anti-zápal. Okrem toho, anti-zápalové aktivity Memmo by prípadne mohla líšila od vyvíjanému indometacín. Je inhibítor oboch Coxs (tj. COX-1 a COX-2), indometacín je selektívnejší pre COX-1, ktorý je nutný pre udržanie ochrannej vrstvy žalúdočnej sliznice [9]. Schopnosť Memmo k zintenzívneniu tvorby žalúdočný vred indometacínom indukovanej naznačuje, že Memmo by tiež inhibuje COX-1 akcie a interferovať s tvorbou konštitutívny PG, ktoré pomáhajú chrániť žalúdočnú sliznicu medzi ostatnými. Na druhej strane, schopnosť Memmo, aby vyvinula protizápalový účinok môže byť vzhľadom k svojej schopnosti inhibovať COX-2 závislú odozvu spojenú s opuch labky testu Karagénan indukované krysy [5, 9]. Iné, než to, Memmo môže pracovať tiež protichodne aktiváciou COX-2, čo vedie k zvýšeniu PGE 2 syntéza, ktorá bola označená, aby vyvinula protizápalovú aktivitu väzbou k jednému z jeho receptorov, PGE receptor 4 (EP 4) [10]. Okrem toho, PGE 2 je známe, že je prekurzorom pre tvorbu prostaglandínov cyklopentenonu (cyPG), ktoré s ktorými pôsobia protizápalovo [11]. Okrem toho, schopnosť aktivovať PGE 2 syntéza, čo zase zvyšuje žalúdočnú produkciu hlienu, môže nastať prostredníctvom aktivácie EP receptory 3 [10]. To by mohlo opäť vysvetliť schopnosť Memmo demonštrovať protizápalovú aktivitu, zatiaľ čo, súčasne, pôsobiť protivredovú aktivitu proti ethanol-, ale nie indometacín indukovanej modelu. Napriek týmto návrhom, bol urobený žiadny pokus o určenie možných mechanizmov žalúdočným z Memmo, ktoré by mohli byť použité na vysvetlenie pozorovaného protivredovú aktivitu.
Ak vezmeme do úvahy vyššie uvedenú správu [8] a ďalšie správy vypracovanej Hussain et al. [6], ktorá hodnotila protivredový potenciál vodného extraktu M. malabathricum
použitie iba jedného modelu žalúdočných vredov (tj. Etanol modelu indukovanej), súčasné vyšetrovania boli vzory. Aj keď M. malabathricum
nebola nikdy použitá na liečbu infekcie baktériou H. pylori
, ktorý je podporovaný jeho zlé antibakteriálnej aktivity [12,13], tradičným použitie rastliny pre liečbu žalúdočných vredov odôvodnené výskum prítomnosť s nádej, že alternatívne /prírodný gastroprotektívnymi činidlo ako náhrada aktuálne dostupných liekov efektových-odhaľovať bočných používaných v liečbe druhej línie. S ohľadom na tento fakt do úvahy súčasnú štúdiu zameranú vyšetrovať o možných mechanizmov žalúdočným z Memmo za použitia rôznych modelov krysy.
Metódy
Chemicals
Chemické látky použité v tejto štúdii sú analytických tried a bol pripravený bezprostredne pred použitím. Boli použité nasledujúce látky: ranitidínu (Sigma Aldrich, USA), kvercitrín (Sigma Aldrich, USA), absolútna etanol (Fischer Scientific, USA), N-ethylmaleimide (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G -nitro-L-arginín metylestery (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), karbenoxolón (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) a dietyléter (Fischer Scientific, USA).
rastlinných materiálov vzoriek a príprava z Memmo
listov M. malabathricum
boli zhromaždené v auguste a septembri 2010 od Serdang, Selangor, Malajzia, a identifikovaný botanik z inštitútu biologických vied (IBS) University Putra Malajzia (UPM) Serdang, Selangor, Malajzia. Čo zodpovedá zľave exemplár ACP-0017, bol uložený na Herbár IBS, UPM, Malajzia. Pozemné sušené listy (40 g) sa namočí trikrát pri teplote miestnosti po dobu 24 hodín s metanolom v pomere 1:20 (hmotnosť /objem) a metanol supernatant sa odparí (40 ° C) za zníženého tlaku do sucha, čo vedie výťažok 12,8 g vysuší a lepkavé metanol extrakt (percento získa sa ≈ 32%).
Phytochemical skríning a HPLC analýza Memmo
fytochemikálie skríning a analýza HPLC Memmo bola vykonaná podľa predtým publikovaného spôsobu [ ,,,0],7]. Fytochemické screening Memmo bola vykonaná s cieľom stanoviť prítomnosť flavonoidov, triterpény, triesloviny, alkaloidy a saponíny v súlade s obvyklými protokolov, ako je popísané below.i) Flavonoidy
Približne 10,0 g Memmo sa oddelene varí počas 2 až 3 minúty v 100 ml vody vo vodnom kúpeli. 3 ml filtrátu, 3 ml kyseliny-alkoholu (etanol: voda: koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej v pomere 1: 1: 1) sa pridá pevný horečnatý (1 cm) a 1 ml t-amyl-alkoholu. Tieto zmesi boli potom pozorovaný ružovej-oranžovej farby alebo porušujú change.ii) Triterpény
Približne 1,0 g Memmo sa oddelene extrahujú po dobu 24 hodín v éteri. 1 ml filtrátu sa odparí do sucha a zvyšok sa znovu rozpustí v niekoľkými kvapkami acetanhydridu a potom niekoľko kvapiek kyseliny sírovej sa pridá k roztoku. Tieto zmesi boli potom pozorované po zelenej farby change.iii) Taníny
Približne 0,2 g Memmo sa oddelene varí v 5 ml vody. Zmesi sa ochladí a prefiltruje. Niekoľko kvapiek (3 kvapky) 5% roztoku chloridu železitého sa pridá k filtrátu a pozorovaný modročierneho zrazenina formation.iv) alkaloidy
Približne 0,5 g Memmo sa oddelene varí s 10 ml zriedenej kyseliny chlorovodíkovej (obsah alkoholu) v skúmavke po dobu 5 min. Zmesi sa ochladí a úlomky sa nechá usadiť. Každý zo supernatantu kvapalín sa prefiltruje do ďalšej skúmavky a odfotil 1 ml každého filtrátu, do ktorého bolo pridané, pretrepe a sleduje sa výskyt oranžovo-červené škvrny a zrazeniny tri kvapky činidla Dragendorffovým je (draselného bizmut roztoku jodidu) formation.v) Saponíny
Približne 0,2 g Memmo sa pretrepe s vodou a zmes bola pozorovaná pre trvalé penu.
HPLC analýza Memmo bola vykonaná v súlade s predchádzajúcej správe [4 ], ale s miernymi úpravami. Stručne povedané, Memmo (10 mg) sa suspenduje v 1 ml metanolu. Roztok sa nechá prejsť cez filtračnú patrónu (veľkosť pórov 0,45 um) pred analýzou. Filtrovaný vzorka bol analyzovaný pomocou HPLC systému pozostávajúce z Waters Delta 600 s 600 Controller, fotodiódy array detektor (Waters 996). A Phenomenex Luna (5 um) (Torrance, CA, USA) (4,6 mm vnútorný priemer x 250 mm). Dvoch rozpúšťadiel označujú ako A a B boli použité pre elúciu zložiek. A je 0,1% vodný roztok kyseliny mravčej a B je acetonitril. Počiatočné podmienky boli 95% A a 5% B s lineárnym gradientom dosiahne 25% B pri t = 12 minút stroje a tento stav sa udržiava počas 8 minút. B bola znížená späť na 15% pri t = 22 min
a udržiava sa na tejto podmienke po dobu ďalších 8 min (t
= 30 min). V čase t = 35 min
, program sa vráti na predvolené zloženie rozpúšťadlá. Prietok bol použitý 1,0 ml /min a vstrekovaný objem bol 10 ul. Stĺpec Pec bola nastavená na 27 ° C a eluent bol monitorovaný pri 210, 254, 280, 300, 330 a 366 nm. Boli analyzované retenčné časy, plochy vrcholu a UV spektra z hlavných vrcholov. HPLC analýza bola vykonaná v Laboratóriu Phytomedicine, Liečivé rastliny divízie, Forest Výskumný ústav Malajzia (FRIMA), Kepong, Malajzia
pokusných zvierat
Male Sprague Dawley (180-200 g; 8-10. týždňov) boli získané z veterinárneho oddelenia zvierat, fakulta veterinárneho lekárstva, University Putra Malajzia (UPM), Malajzia a udržiavaný za izbovej teplote (27 ± 2 ° C, 70-80% vlhkosť, 12 h svetlo /tma cyklus) v animal holding Unit, Lekárska fakulta a vedy zdravie, UPM. Boli dodané s potravou a vodou ad libitum
od začiatku experimentu. Protokol štúdie predkladané štúdie bol schválený Snemovňou zvierat a používanie výboru, Lekárska fakulta a vedy zdravie, UPM (Etické schválenie nie: UPM /FPSky /PADS /BR-Uuh /00449). Krysy boli spracované v súlade s platnými smernicami UPM v oblasti starostlivosti o laboratórne zvieratá a etických princípov pri vyšetrovaní experimentálnej bolesti zvierat pri vedomí [14]. Všetky pokusy boli vykonané medzi 09.30 a 18.30 h, aby sa minimalizovali dopady zmien v oblasti životného prostredia. Na lačno bol aplikovaný po dobu 48 hodín pred všetkými testami, vyznačujúci sa tým, že potkany boli povolený prístup iba k vode.
Stanovenie možných mechanizmov žalúdočným z Memmo
pyloru ligační indukovanej ulcerácii
pyloru ligácia bola vykonaná v súlade s metóda, ktorú Shay a spol. [15] s miernymi modifikáciami. Tridsať potkany boli náhodne rozdelené do 5 skupín (n = 6). Skupina-I (kontrola) sa spracuje s vozidlom (10% DMSO), skupina II (pozitívna kontrola, ranitidín) bol podaný v dávke 100 mg /kg (po), skupina-III, -IV a-V, krysám podané Memmo (50, 250 a 500 mg /kg, v danom poradí). Pyloru ligácia bola vykonávaná 1 hodinu po podaní testovaných zlúčenín na 48 hodín na lačno krysy. Ketamín HCl (100 mg /kg, intramuskulárne) a xylazínu HCl (16 mg /kg, intramuskulárne) boli použité na zanestetizovat krysy pred podviazaním vrátnika. A 2 cm dlhý rez bol vykonaný v oblasti brucha tesne pod hrudnou kosťou na anestetizovaných krýs. Žalúdok bol vystavený, a nite prešiel okolo pyloru zvierača a zviazaný v tesnom uzol. Pozornosť bola venovaná zatiaľ čo viazanie uzla, aby sa zabránilo zahŕňajúce krvné cievy v uzle. Brucho bola prišitá a koža bola zbavená krvné škvrny alebo krvácanie. Boli zvieratá usmrtená 6 hodín po ligácia cervikálny dislokáciou.
Stanovenie objemu, pH, voľného a celkového kyslosť žalúdočnej obsah
žalúdky boli odstránené, a obsah sa vypustí, zhromaždené a centrifugovány pri 2500 otáčkach za minútu po dobu 10 min. Objem a pH žalúdočnej šťavy bola meraná a podrobili voľného a celkového odhadu kyslosti podľa spôsobu popísaného v Srivastava et al. [16]. Voľných mastných kyselín bol stanovený titráciou 0,01 N hydroxidom sodným (NaOH) s metyl oranžovou činidlom, kým sa farba roztoku sa stala žltkastý. Objem pridanej alkálie bola zaznamenaná. Potom sa pridal dve až tri kvapky fenolftaleínu a roztok sa titruje, kým sa neobjaví definitívny ružová farba. Celkový objem roztoku hydroxidu sodného bolo uvedené, a to zodpovedá celkovej kyslosti. Kyslosť bola vypočítaná podľa tohto vzorca: $$ \\ mathrm {kyslosť} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {z} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normalita} \\ kern0.5em \\ mathrm {z} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0.1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Odhad žalúdočného obsahu stena hlienu
žalúdočný obsah steny hlienu bola stanovená metódou opísanou Corne et al. [17] s miernymi modifikáciami. Žalúdok bol otvorený pozdĺž veľkého zakrivenia, zvážené a ponorené do 10 ml 0,1% Alcian Blue na 0,16 M sacharózy /0,05 M octanu sodného, ​​pH 5,8 počas 2 hodín. Nadmerné farbivo sa potom odstráni v dvoch po sebe nasledujúcich oplachy 0,25 M roztoku sacharózy (15 min). Zvyšné farbivo v komplexe s do žalúdočnej sliznice sa extrahujú 0,5 M MgCl 2 po dobu 2 hodín a trepe sa prerušovane po dobu 1 min v každom intervale 30 minút. Modrá extrakt sa intenzívne pretrepáva s rovnakým objemom dietyléteru a vzniknutá emulzia sa odstredí pri 3600 otáčkach za minútu po dobu 10 minút. Absorbancia (OD) Alcian Blue na vodnej vrstve bola odpočítaná pri 580 nm za použitia spektrofotometra. Množstvo Alcian modré extrahovať na gram mokrej žalúdka, potom bola vypočítaná zo štandardnej krivky.
Etanol indukovanej žalúdočnej sliznice lézie v L-NAME liečeným potkanom
Zapojenie endogénneho NO pri modulácii pred žalúdočnom prostredím etanolu vyvolané aktivita bola stanovená podľa metódy Andreo et al. [18], ale s miernymi úpravami. Samce krýs bolo náhodne rozdelených do dvanástich skupín (n = 6) a na lačno po dobu 24 hodín, ale ponechaný voľný prístup k vode. Potom boli vopred ošetrené fyziologickým roztokom alebo L-NAME (70 mg /kg, inhibítorom NO syntázy), intraperitoneálne (ip) a 30 minút neskôr sa zvieratá dostala nosič (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (pozitívna kontrolná skupina) alebo 500 mg /kg Memmo (po). Jednu hodinu po podaní skúšobných roztokov, žalúdočný vred bola indukovaná za použitia 5 ml /kg absolútneho etanolu vo všetkých skupinách. Na druhej strane, L-arginín (200 mg /kg) bol podaný 30 minút po fyziologickým roztokom alebo L-NAME a spracovanie, po 30 minútach od podania etanolu. Všetci potkany boli usmrtení 1 hodinu neskôr pôsobením dietyléteru. Žalúdok bol otvorený pozdĺž veľkého zakrivenia pre určenie vredu oblasť (UA), ako je popísané Balan et al. [19]. Ochrana percentách bola vypočítaná podľa tohto vzorca: $$ \\ mathrm {Protection} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontrolné} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {zaobchádzané} \\ \\ mathrm {skupina} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontrolné} \\ right)} \\ times 100 \\% $$ etanol indukovanej žalúdočnej sliznice lézie NEM vopred potkanov
vyšetrovať zapojenie z sulfhydrylové (SH) skupina v modulácii aktivity žalúdočnom etanol-indukovanej, postupov popísaných v Andreo et al. [18] boli prijaté s miernymi úpravami. Krysy boli náhodne rozdelené do 12 skupín (n = 6) a na lačno po dobu 24 hodín, ale ponechaný voľný prístup k vode. Experiment začal s predpríprave (i.p.) fyziologického roztoku alebo NEM (10 mg /kg), čo je sulfhydrylové (SH-blokátor). Tridsať minút po predbežné spracovanie pluku, potkany boli podávané (po) nosič (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (pozitívna kontrolná skupina), alebo 500 mg /kg Memmo nasleduje podanie 5 ml /kg etanolu O hodinu neskôr vyvolať žalúdočné vredy. Všetky zvieratá boli zabité 1 h po podaní etanolu pôsobením dietyléteru. Žalúdok bol odstránený a žalúdka poškodenie bola stanovená ako je popísané vyššie.
Biochemickou analýzu žalúdočných tkanív
Po makroskopické analýzy, superoxid dismutázy (SOD) [20], katalázy (CAT), [21], myeloperoxidáze (MPO) [22], glutathionperoxidázy (GTP) [23], glutatión reduktáza (GTR) [24] a kyselina thiobarbiturovou reaktívne látky (TBARS) boli merané [25] aktivity enzýmov v žalúdku tkanív krysy. Žalúdočnej sliznice bol poškriabaný od antrálnej časti žalúdka pomocou zhrňovacie a skladovať pri teplote 4 ° C počas biochemické odhadu. Vyradené žalúdočnej sliznice sa podrobí príprave slizničnej homogenátu (pH 7,2). Homogenát sa odstredí pri 3000 otáčkach za minútu po dobu 10 minút a supernatant získaný bol použitý pre analýzu antioxidačné typu na etanolom indukované poškodenie žalúdočnej sliznice. Vo všetkých testoch antioxidačné obrany, ranitidín (100 mg /kg) -pretreated skupina bola považovaná za pozitívnu kontrolnej skupiny.
Stanovenie aktivity SOD
aktivitu SOD bola stanovená na základe inhibícia tvorby nikotínamid-adenín dinukleotid, fenazin methosulfát a amino blue tetrazolium formazanové [20]. Približne 0,5 ml tkanivového homogenátu sa zmieša s 0,4 ml etanolu a chloroformu a odstredí. K supernatantu sa, Testovacia zmes (pyrofosforečnan sodný pufra (0,025 M, pH 8,3), nitroblue tetrazolium, fenazin methosulfát a znižuje nikotínamidadeníndinukleotid (NADH)) bolo pridané a inkubovať pri 30 ° C počas 90 s. Reakčná zmes sa zastavené pridaním ľadovej kyseliny octovej a zmieša s n-butanol
. Intenzita farby vyvinuté v butanolom bola meraná pri 560 nm. SOD aktivita sa meria stupeň inhibícia tejto reakcie, a je vyjadrená ako milimol /min /mg proteínu.
Stanovenie CAT aktivity
aktivita CAT bola stanovená kolorimetricky pri 620 nm, ako je popísané metódou Sinha [21]. Potom sa reakčná zmes 1,5 ml s obsahom 1,0 ml roztoku fosfátového pufru (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml 2,0 M H 2O 2 a 1,0 ml homogenátu tkaniva. Reakcia bola zastavená pridaním 2,0 ml reakčného činidla dichrómanu-octovej kyseliny (5% dvojchrómanu draselného a zmes ľadovej kyseliny octovej v pomere 1: 3). Výsledky sú vyjadrené ako milimol /min /mg proteínu.
Stanovenie aktivity MPO
Aktivita MPO bola meraná podľa metódy opísanej Bradley et al. [22], ale s miernymi modifikáciami. Homogenizované vzorky boli zmrazené a rozmrazené trikrát a odstredí pri 1500 g počas 10 minút pri teplote 40 ° C. Pridané približne 100 ul homogenizované supernatantu na 1,9 ml 10 mmol /l fosfátového pufra (pH 6,0) a 1,0 ml 1,5 mmol /LO-dianisidin-hydrochlorid, ktorý obsahuje 0,0005% (m /V) H 2O 2. Absorbancia bola hodnotená pri vlnovej dĺžke 450 nm UV spektrofotometra a aktivity MPO v žalúdočnej tkanive bola vyjadrená ako umol /min /mg proteínu.
Stanovenie aktivity GTP
Aktivita GTP bola meraná spôsobom popísaným Rotruck et al. [23] s miernymi modifikáciami. Reakčná zmes, ktorá obsahovala 0,2 ml 0,4 M, Tris - HCI, pH 7,0, 0,1 ml 10 mM azidu sodného, ​​0,2 ml tkanivového homogenátu (homogenizuje tkanivo v 0,4 pufri M Tris-HCl, pH 7,0), 0,2 ml glutatión a 0,1 ml 0,2 mM peroxidu vodíka sa potom inkubuje pri teplote miestnosti po dobu 10 minút. Reakčná zmes sa zastavené pridaním 0,4 ml 10% TCA a podrobenie k procesu odstreďovania. Supernatant sa analyzuje na obsah glutatiónu pomocou Ellmans činidla (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro benzoovej kyseliny (DTNB) v 100 ml 0,1% dusičnanu sodného). Molárna extinkčný koeficient 6.22 x 103 umol sa určovali aktivity GTP. Enzýmová aktivita bola vyjadrená ako medzinárodných jednotkách enzymatickej aktivity /g proteínu. Medzinárodných jednotiek sú vyjadrené ako umol hydroperoxidov transformovaných /min /ml enzýmu.
Stanovenie aktivity GTR
Úroveň GTR zistila postupom podľa Ellman [24]. Approximately1.0 ml supernatantu sa zmieša s 0,5 ml Ellmans činidla (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro benzoovej kyseliny (DTNB) v 100 ml 0,1% dusičnanu sodného) a 3,0 ml fosfátového pufra (0,2 M, pH 8,0 ). Absorbancia bola odpočítaná pri 412 nm a GTR aktivita bola vyjadrená ako umol /min /mg tkaniva.
Stanovenie obsahu TBARS
rozsahu LPO bola meraná analýzou hladiny TBARS v žalúdočnej sliznici podľa na predchádzajúce metódy [25], ale s menšími úpravami. Do 0,5 ml tkanivového homogenátu, 1,5 ml 20% kyseliny octovej, 0,2 ml SDS a 1,5 ml terciárneho butylalkoholu bolo pridané. Výsledná zmes sa doplní na destilovanou vodou a zmes sa zahrieva po dobu 1 hodiny 4 ml pri teplote 95 ° C. Po ochladení sa pridá 4,0 ml butanolu, pyridínu a zmes pretrepe. Táto zmes sa potom odstredí pri 4000 otáčkach za minútu po dobu 10 minút. Organická vrstva bola zhotovená a jeho absorbancie bola odpočítaná pri 532 nm a výsledky boli vyjadrené ako n mol /g proteínu.
Odhad proteínu
Obsah proteínu v žalúdočnej tkanive bol odhadovaný v súlade s metódou Lowry et al. [26], ale s miernymi modifikáciami. Vzorka tkaniva a štandardy (1,0 mg /ml hovädzieho sérového albumínu vo dvakrát destilovanej vode) v jednotlivých skúmaviek boli ošetrené 5,0 ml zmesi reagensov (48% vínanu sodno-draselného, ​​2% síranu a 3% uhličitanu sodného v 1:48 (v /v)). Potom Folin fenol činidlo (1: 2) sa pridá k reakčnej zmesi a nechá sa stáť 30 minút pri teplote miestnosti. Optická hustota bola odpočítaná pri 710 nm za použitia vody ako slepé.
In vitro protizápalová aktivita Memmo
in vitro účinok Memmo na oxidu dusnatého
bunkové kultúry a stimulácia
surového 264.7 bunková línia (myšou monocytární makrofágy) (Európska zbierka bunkových kultúr, Porton Down, UK), bol zachovaný v DMEM doplnenom 10% FBS, 4,5 g /l glukózy, L-glutamínom (2 mM), pyruvát sodný (1 mM), penicilínom (50 u /ml) a streptomycínom (50 ug /ml) a 5% CO 2 pri teplote 37 ° C. Bunky (4 x 10 5 buniek /jamku) boli Zaočkované do 96-jamkové doštičky a inkubované po dobu 2 hodín pri teplote 37 ° C v CO 2 inkubátora pre umožnenie pripevnenie buniek, a potom spúšťaný podnety (100 U /ml IFN-g a 5 ug /ml LPS), s alebo bez prítomnosti Memmo v koncentrácii v rozmedzí od 12,5 do 100 ug /ml. DMSO (nosič) bola použitá na rozpustenie Memmo. Konečná koncentrácia DMSO bola zaistená, aby sa 0,1% vo všetkých kultúrach. Bunky potom boli inkubované po dobu 17-20 hodín pri teplote 37 ° C v CO 2 inkubátora. NO Stanovenie bolo vykonané vystavením kultivovaný supernatant proti testu Griess a bunky zostávajúce v jamke boli testované na životaschopnosti buniek teste
dusitanov stanovenie
koncentrácie dusitanov (NO 2 . - ), stabilný metabolit NO v médiu, bola stanovená pomocou testu Griessova [27]. Rovnaký objem Griessova činidla sa zmieša s supernatantu kultúry a vývoj farby sa meria pri 550 nm. Množstvo dusitanov v živnej supernatantu bola stanovená na základe štandardnej krivky z dusitanu sodného (0-100 uM) čerstvo pripravené v deionizovanej vode. Percento NO inhibície bola vypočítaná pomocou nasledujúceho vzorca: $$ \\ mathrm {Nie} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$, kde;
* riadenie je úroveň dusitanov IFN-y /LPS indukovanej skupina
životaschopnosť buniek
Cytotoxicita Memmo na kultivovaných buniek bola stanovená testovaním redukciu 3. - (4,5-dimetyl-2-thiazolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) [27]. MTT činidla (0,05 mg /ml) boli suspendované v sterilnom PBS o pH 7,0 a potom sa pridá do každej jamky následne po odstránení supernatantu. Potom nasledovala inkubácia zvyšných buniek pri 37 ° C počas 4 hodín, načo sa pridá 100 ul 100% DMSO do jamky, aby sa rozpustil formazánu soli vytvorené. Absorbancia bola meraná pri 570 nm. Percento životaschopnosti buniek bola vypočítaná podľa tohto vzorca: $$ \\ mathrm {Cell} \\ \\ mathrm {životaschopnosť} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {}} ovládanie * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {vzorka}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Spôsob román, digitálne skenovanie genómu detekuje KRAS amplifikáciu génu v žalúdočnej rakoviny: zapojenie nadmerne vystavený divokým typom KRAS vo signalizácie downstream a rastu rakovino…
• Genomická analýza profil rozptýlený-písať žalúdočné cancers