Mekanismit gastroprotection metanolia uutteen Melastoma malabathricum lehdet

Mekanismit gastroprotection metanolia uutteen Melastoma malabathricum
lähtee
Abstract
tausta
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) on pieni pensas eri lääkkeiden käyttötarkoituksia. Tämä tutkimus toteutettiin määrittämiseksi gastroprotektiivinen mekanismeja metanolia otteen M. malabathricum
lehdet (MEMM) rotilla. Tool Menetelmät
Uute n mekanismeja gastroprotection (50, 250, 500 mg /kg) tutkittiin käyttäen pylorus-ligaation rottamallissa jossa tilavuus, pH, vapaa ja kokonaishappopitoisuus mahanesteessä ja mahalaukun seinämän limapitoisuudessa määritettiin. Osallistuminen endogeenisen typpioksidin (NO) ja sulfhydryyli (SH) yhdisteet gastroprotektiivinen vaikutus MEMM mitattiin myös. MEMM alistettiin antioksidantti, tulehdusta ja phytochemical analyysi ja HPLC profilointia.
Tulokset
MEMM sisälsivät erilaisia ​​kasvien osatekijät quercitrin on tunnistettu osa niistä. MEMM ja quercitrin: i) merkitsevästi (p < 0,05) vähensi ja happamuus mahalaukun mehu lisäten samalla pH ja mahalaukun seinämän limapitoisuudessa .; ii) merkitsevästi (p < 0,05) lisäsi tason SOD, GTP ja GTR samalla merkittävästi (p < 0,05) puolestaan ​​laskenut CAT, MPO ja TBARS toiminta .; iii) aiheutti gastroprotektiivista aktiivisuutta arvioitiin käyttämällä etanolin aiheuttamia mahahaava määritys, joka purettiin N G-nitro-l-arginiini metyyliestereitä (L-NAME, estäjä NO nopaliinisyntaasin) ja N
- etyylimaleimidi (NEM, sulfhydryyli- (SH) estäjä). MEMM esti lipoksigenaasin (LOX) ja ksantiinioksidaasin (XO) toiminta, jolla on korkein affiniteetti entisen samalla quercitrin osoittivat korkeaa affiniteettia XO toimintaan.
Johtopäätökset
MEMM näytteillä gastroprotektiivista aktiivisuus johtuu osittain läsnäolosta quercitrin, sen antioksidantti ja tulehdusta toimintaa, ja kautta modulaatio NO ja SH-ryhmien.
Avainsanat
Melastoma malabathricum
Melastomaceae metanoliuutteessa gastroprotective mekanismeja Typpioksidi sulfhydryyliryhmän antioksidantit tulehdusta Taustaa
Peptisiä haavoja ovat yleinen häiriö koko ruoansulatuskanavassa. Lähes 8 10% maailman väestöstä vaikuttaa mahahaava, noin 5% heistä kärsii mahahaavan [1]. Haavat, jotka vaikuttavat ruoansulatuskanavan yleensä pahentaa epäsuhta tuhoisaa ja puolustava tekijät vatsassa [1]. Vaikka pidetään monitekijäinen sairaus, on yleisesti tunnustettu, että lähes kaikki mahahaava liittyvät tartunnan Helicobacter pylori
ja suurin terapeuttinen tarkoitus on hävittää H. pylori
infektio. Tällä hetkellä ensilinjan lääketieteellinen mahahaavahoidon on suunnattu hävittää helikobakteeri
infektion ja perustuu yleensä kolmen hoitotoimenpide, johon osallistui käyttö mahahaavan estäjien (Eli histamiini H 2-antagonistit, protoni pumppu estäjiä tai sukralfaatti ja vismutti) yhdistettynä kahdentyyppisiä antibiootteja [2]. Kuitenkin se tosiasia, että on olemassa useita muita tekijöitä kuin helikobakteeri
jotka voivat laukaista mahahaava muodostumista ei pidä jättää huomiotta [3]. Erilaisia ​​lähestymistapoja on käytetty mahahaavahoidon liittyy näiden ei-H. pylori
-aiheiset tekijät kuten vähentää hapon eritystä ja lisäämällä liman tuotantoa, mutta nämä lähestymistavat ovat pidetty toisen linjan hoitona.
Huolimatta niiden tehokkuudesta H. pylorin hävittämisessä
, hoito on monimutkainen ja korkeat kustannukset, jossa käytetään ainakin kahden antibiootin yhdessä mahahapon estäjiä. Tämä yhdistelmä aiheuttaa usein useita ei-toivottuja sivuvaikutuksia (so antibioottiresistenssi, toistuminen, pahoinvointi) [2,3]. Huolimatta siitä, että H. pylori
infektioita ovat vähitellen väheni koko useimmissa teollisuusmaissa, asteittainen lisääminen epäonnistumiseen helikobakteeri
hävittämiseksi hoitoja havaitaan muualla [2]. Tämä on edelleen pahentaa yhdistys näiden standardin mahahaavan tekijöille erilaisia ​​ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Ottaen huomioon niiden erilaiset haittavaikutuksia esiintyminen antibiooteille vastustuskykyisten H. pylori
kantoja, löytää uusia ja turvallisia ei-antibiootti Mahalaukun limakalvoa suojaavan lääkityksen luonnollisista lähteistä, erityisesti kasvit, kasvavat edelleen kaikkialla maailmassa [2, 4].
Yksi kasveista, joita käytetään hoitoon mahahaavan Malesiassa on Melastoma malabathricum
L. (perhe Melastomaceae). Paikallisesti tiedossa Malaiji nimellä "Senduduk
", M. malabathricum
löytyy runsaasti Intian valtameren Island, koko Etelä-ja Kaakkois-Aasiassa, Taiwanissa, Kiinassa, Etelä-Tyynellämerellä ja Australiassa. Eri kasvien osia käytetään Malaiji perinteinen lääkkeitä joilla hoidetaan erilaisia ​​vaivoja kanssa lehtiä, erityisesti, on käytetty hoitoon mahahaavan muun muassa [5]. Tieteellisesti, M. malabathricum
osat on raportoitu olevan erilaisia ​​farmakologisia aktiivisuuksia [5-7]. Muut kuin perinteisistä käytettäväksi mahahaavan estoainetta, M. malabathricum
valittiin tässä tutkimuksessa perustuu siihen, että se on yksi kuuluisan yrtit Malaiji lääke- kansanperinnettä, mutta sai puute huomiota keskuudessa yhteisössä. Lisäksi M. malabathricum
on raportoitu sisältävän suuren kokonaisfenolipitoisuuden ja käyttämään korkea antioksidantti ja tulehdusta toimet [5-7], jotka ovat tärkeitä mekanismeja mahahaavan tahansa yhdisteistä /otteita. On hyvin tunnettua, että mahahaavan ja erityisesti indusoivat etanolilla, liittyy ROS: n syntyminen. Etanoli nopeasti tunkeutuu mahalaukun limakalvo, koska se pystyy liuottamaan suojaavan limakalvojen ja aiheuttaa vapautumisen hydroperoksi-vapaiden radikaalien ja superoksidianionin. Nämä vapaat radikaalit aiheuttaa kasvua oksidatiivisen stressin kudoksiin, mikä puolestaan ​​lisää taso malondialdehydipitoisuus, merkkinä lisääntynyt lipidiperoksidaation. Kaiken etanolin aiheuttamia haitallisia vaikutuksia voivat ilmetä suoraan reaktiivisten metaboliittien tai epäsuorasti aktivoimalla muita mekanismeja, jotka lopulta aiheuttavat hapettumista [7]. Siksi, tiivisteet /yhdisteitä antioksidantteja aktiivisuus on erittäin tärkeä rooli huuhteluilman näitä vapaita radikaaleja ja estää lipidiperoksidaation. Sijasta tämän, M. malabathricum
on raportoitu aiheuttavan huomattavaa antioksidantti [7], ja siksi uskotaan olevan mahahaavan mahdollisia. Aikaisemmassa seulonta metanoliuute M. malabathricum
(MEMM) ja mahahaavan mahdollisten vastaan ​​etanoli- ja indometasiinin aiheuttaman mahahaavan malleja on raportoitu muualla [8]. MEMM havaittiin heikentävän etanolin aiheuttamia, mutta pahentaa indometasiinin aiheuttamaa, mahahaava muodostumista. Kyky MEMM käyttämään sekä gastroprotection ja anti-inflammatorinen toiminta [5] on toisin kuin indometasiini, joista vain kohdistuu anti-inflammatorista aktiivisuutta. Tämä havainto näyttää viittaavan siihen, että uute aktivoi gastroprotection mekanismilla, jota ei ole liitetty sen, että anti-tulehdus. Lisäksi, anti-inflammatorista aktiivisuutta MEMM mahdollisesti poikkesi yhden kohdistaman indometasiini. Koska estäjä sekä Coxs (ts COX-1 ja COX-2), indometasiinia on selektiivisempi COX-1, jota tarvitaan säilyttämään suojaavan mahalaukun limakalvon kerros [9]. Kyky MEMM tehostamaan indometasiinin aiheuttamaa mahahaavan muodostumisen viittaa siihen, että MEMM voi inhiboida COX-1: n toimintaa ja häiritä muodostumista konstitutiivisen PG, jotka suojaavat mahan limakalvon mm. Toisaalta, kyky MEMM aikaansaamaan anti-inflammatorisen aktiivisuuden saattaa johtua sen kyvystä inhiboida COX-2-riippuvainen vaste liittyy karrageeni-indusoidun rotan käpälän turvotuskokeesta [5, 9]. Muuta kuin, että MEMM voi myös toimia päinvastoin aktivoimalla COX-2, mikä kasvattaa PGE 2 synteesi, jonka on raportoitu aiheuttavan anti-inflammatorista aktiivisuutta sitoutumalla yksi sen reseptoreihin, PGE-reseptorin 4 (EP 4) [10]. Lisäksi PGE 2 on tiedetty olevan esiaste muodostumista syklopentenonin prostaglandiinien (cyPG), joka vaikuttaa anti-inflammatoriset [11]. Lisäksi kyky aktivoida PGE 2 synteesiä, mikä puolestaan ​​lisää mahalaukun liman tuotantoa, voi tapahtua aktivoinnin EP 3-reseptorien [10]. Tämä voi jälleen auttaa selittämään kyky MEMM osoittaa anti-inflammatorista aktiivisuutta, kun taas, samanaikaisesti, käyttää haavaumien vastaista vaikutusta vastaan ​​etanoli, mutta ei indometasiinin aiheuttamaa malli. Huolimatta näistä ehdotuksista, ei on pyritty määrittämään mahdollisia mekanismeja gastroprotection of MEMM, joita voitaisiin käyttää selittää havaitun mahahaavan toimintaa.
Ottaen huomioon edellä mainittu raportissa [8] ja toinen laatimat Hussain et ai. [6], joka arvioi mahahaavan potentiaalia vesiuutteen M. malabathricum
käyttäen vain yhtä mallia mahahaava (eli etanolin aiheuttamia malli), tutkimuksessa olivat malleja. Vaikka M. malabathricum
ole koskaan käytetty hoidossa H. pylori
infektio, joka tukee sen huono antibakteerinen vaikutus [12,13], perinteinen käyttö kasvin hoitoon mahahaavan perusteltua läsnäolo tutkimus toivoa löytää vaihtoehtoinen /luonnollinen gastroprotective ainetta korvaavan tällä hetkellä saatavilla sivuvaikutus-Baring lääkkeitä käytetään toisen linjan hoitona. Kun tämä seikka otetaan huomioon, esillä Tutkimuksessa tarkasteltiin mahdollisesta mekanismeja gastroprotection of MEMM erilaisilla rottia malleja. Tool Menetelmät
Kemikaalit
käytettävät kemikaalit ovat tässä tutkimuksessa analyyttisten laadut ja oli laadittu välittömästi ennen käyttöä. Seuraavia lääkkeitä käytettiin: ranitidiinin (Sigma Aldrich, USA), quercitrin (Sigma Aldrich, USA), absoluuttista etanolia (Fischer Scientific, USA), N-etyylimaleimidi (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G nitro-l-arginiini metyyliestereitä (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), karbenoksoloni (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) ja dietyylieetteriä (Fischer Scientific, USA).
Plant aineiden keräämistä ja valmistelu of MEMM
lehdet M. malabathricum
kerättiin elo-syyskuussa 2010 Serdang, Selangor, Malesia, ja tunnistaa kasvitieteilijä instituutista Bioscience (IBS), Universiti Putra Malesia (UPM), Serdang, Selangor, Malesia. Tosite yksilö, ACP-0017, on talletettu kasvimuseossa on IBS, UPM, Malesia. Maa kuivattuja lehtiä (40 g) liotettiin kolme kertaa huoneen lämpötilassa 24 h metanolin suhde 1:20 (w /v) ja metanoli supernatantti haihdutettiin (40 ° C) alennetussa paineessa kuivaksi tuloksena saanto on 12,8 g kuivattua ja tahmea metanoliuute (prosentteina tuotti oli ≈ 32%).
phytochemical seulontaa ja HPLC-analyysi MEMM
phytochemical seulonta ja HPLC-analyysi MEMM suoritettiin aikaisemmin raportoidun menetelmä [ ,,,0],7]. Phytochemical seulonta MEMM tehtiin läsnäolon määrittämiseksi flavonoideja, triterpeenit, tanniinit, alkaloidit ja saponiinit tavanomaisella protokollia, kuten on kuvattu below.i) Flavonoidit
Noin 10,0 g MEMM on erikseen keitettiin ja 2-3 min 100 ml: ssa vettä vesihauteessa. 3 ml suodosta, 3 ml happoa alkoholi (etanoli: vesi: väkevä kloorivetyhappo suhteessa 1: 1: 1), kiinteä magnesium (1 cm) ja 1 ml: ssa t-amyyli-alkoholia lisättiin. Sitten seokset havaittiin ruusu oranssi tai rikkoa väri change.ii) Triterpenes
Noin 1,0 g MEMM oli erikseen uutettu 24 tuntia eetteriin. 1 ml suodos haihdutettiin kuiviin ja jäännös liuotettiin uudelleen useita tippoja etikkahappoanhydridiä ja sitten useita tippoja rikkihappoa lisättiin liuokseen. Sitten seokset havaittiin vihreän värin change.iii) Tanniinit
Noin 0,2 g MEMM on erikseen keitettiin 5 ml: ssa vettä. Seokset jäähdytettiin ja suodatettiin. Muutama tippa (3 tippaa) 5%: Ferrikloridiliuos lisättiin suodokseen, ja havaittiin sininen-musta sakka formation.iv) Alkaloids
Noin 0,5 g MEMM on erikseen keitettiin 10 ml laimennettua suolahappoa (alkoholittomat) koeputkessa 5 min. Seokset jäähdytettiin ja roskat annettiin laskeutua. Kukin supernatantti nesteiden suodatettiin toiseen koeputkeen ja 1 ml kutakin suodosta otettiin johon kolme tippaa Dragendorffin reagenssia (kalium vismutti jodidi liuosta), ravisteltiin ja tarkkailtiin ulkonäkö oranssi-punainen täplä ja sakan formation.v) Saponiinit
Noin 0,2 g MEMM ravisteltiin veden kanssa ja seosta havaittiin jatkuvasti vaahdon.
HPLC-analyysi MEMM suoritettiin edellisen raportin [4 ] mutta pienin muutoksin. Lyhyesti, MEMM (10 mg) suspendoitiin 1 ml: aan metanolia. Liuos suodattimen läpi patruunan (huokoskoko 0,45 um) ennen analyysiä. Suodatettu Näyte analysoitiin käyttäen HPLC-systeemiä, joka koostuu Waters Delta 600 600 Controller, valodiodirividetektoria (Waters 996). Ja Phenomenex Luna (5 um) (Torrance, CA, USA) -pylvääseen (4,6 mm sisähalkaisija x 250 mm). Kahden liuottimen merkitty A ja B käytettiin eluointia ainesosia. A oli 0,1%: ista muurahaishappoa ja B oli asetonitriili. Alkuehdot oli 95% A: ta ja 5% B: n lineaarisella gradientilla saavuttaa 25% B t
= 12 min, ja tämä ehto pidettiin 8 min. B alennettiin takaisin 15%: iin t
= 22 min ja pidettiin tässä tilassa vielä 8 min (t
= 30 min). T
= 35 min, ohjelma palautetaan alkuperäiseen liuottimen koostumus. Käytetty virtausnopeus oli 1,0 ml /min ja injektiotilavuus oli 10 ui. Kolonniuunin oli asetettu 27 ° C: ssa ja eluenttia seurattiin 210, 254, 280, 300, 330 ja 366 nm. Retentioaikojen piikkien pinta-alojen ja UV-spektrit suuret piikit analysoitiin. HPLC-analyysi suoritettiin laboratoriossa Phytomedicine, lääkekasvien Division, Metsäntutkimuslaitos Malesian (frim), Kepong, Malesia.
Koe-eläimet
Sprague Dawley rottia (180-200 g; 8-10 viikkoa vanhoja) saatiin Veterinary Animal Unit, eläinlääketieteellinen tiedekunta, Universiti Putra Malesia (UPM), Malesia ja pidettiin huoneenlämmössä (27 ± 2 ° C; 70-80% kosteus, 12 tunnin valo /pimeys sykli) in Animal Holding yksikkö, Lääketieteellinen tiedekunta ja Health Sciences, UPM. Ne on toimitettu ruokaa ja vettä ad libitum
alusta kokeiden. Tutkimuksessa protokolla Tämän tutkimuksen hyväksyi Animal House ja käyttö komitea, Lääketieteellinen tiedekunta ja Health Sciences, UPM (Ethical hyväksyntä no: UPM /FPSK /PADS /BR-Uuh /00449). Rottia käsitellään voimassa olevien UPM ohjeita hoidosta koe-eläimiä ja eettisistä ohjeista tutkimusten kokeellisen kivun tajuissaan eläimillä [14]. Kaikki kokeet suoritettiin välillä 09.30 ja 18.30 h vaikutusten minimoimiseksi ympäristön muutoksiin. Paasto levitettiin 48 tuntia ennen kaikkien analyysit, joissa rottien annettiin pääsy vain vettä.
Määritys mahdollista mekanismeja gastroprotection on MEMM
pylorus ligaation indusoiman haavauman
pylorus ligaatio suoritettiin menetelmä, Shay et al. [15] pienin muutoksin. Kolmekymmentä rotat jaettiin satunnaisesti 5 ryhmään (n = 6). Ryhmä-I (kontrolli), käsiteltiin vehikkelillä (10% DMSO: ta), ryhmän II (positiivinen kontrolli, ranitidiini), annettiin 100 mg /kg (po), ryhmä-III, -IV ja-V, rottia hoidettiin MEMM (50, 250 ja 500 mg /kg, vastaavasti). Pylorus ligaatio suoritettiin 1 h antamisen jälkeen testiyhdisteiden 48 h paastonneet rotat. Ketamiini HCl: ää (100 mg /kg, lihakseen) ja ksylatsiinia HCl: llä (16 mg /kg, lihakseen) käytettiin Puuduta rotille ennen ligaatiota mahanportin. A2 cm pitkä viilto tehtiin vatsan alapuolella rintalastan nukutetun rotilla. Vatsa paljastui, ja lanka oli kulunut noin mahanportin sulkijalihaksen ja sidottu tiukka solmu. Pidettiin huolta, kun sitominen solmu välttää joihin verisuonia solmu. Vatsa ommeltiin, ja iho puhdistettiin tahansa veren täplät tai verenvuotoa. Eläimet tapettiin 6 h kuluttua ligaation katkaisemalla kaula.
Määritys tilavuus, pH, vapaa ja kokonaishappopitoisuus mahalaukun sisällön
mahat poistettiin, ja sisällöt valutettu pois, talteen ja sentrifugoitiin 2500 rpm 10 min. Tilavuus ja pH mahanesteen mitattiin ja saatettiin vapaan ja kokonaishappopitoisuus arvion menetelmän mukaisesti kuvataan Srivastava et al. [16]. Vapaa happamuus määritettiin titraamalla 0,01 N natriumhydroksidilla (NaOH) metyyli oranssi reagenssia, kunnes liuoksen väri muuttui kellertävä. Tilavuus emästä lisätään todettiin. Sitten kahdesta kolmeen tippaa fenolftaleiinia lisättiin ja titrattiin, kunnes selvä vaaleanpunainen väri tulee näkyviin. Kokonaistilavuus NaOH lisätään Todettiin ja tämä vastaa kokonaishappopitoisuus. Happamuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: $$ \\ mathrm {happamuus} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {of} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normaalius} \\ kern0.5em \\ mathrm {of} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ kertaa 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Arvio mahalaukun seinämän limapitoisuudessa
Mahalaukun seinämän limapitoisuudessa määritettiin menetelmällä, jonka Corne et al. [17] pienin muutoksin. Vatsa avattiin suurempaa kaarta pitkin, punnittiin ja upotettiin 10 ml: aan 0,1% Alcian Blue 0,16 M sakkaroosia /0,05 M natriumasetaatti, pH 5,8 2 h. Liiallinen väriaine poistettiin sitten kaksi peräkkäistä huuhtelua 0,25 M sakkaroosiliuoksessa (15 min kukin). Jäljellä oleva väriaine kompleksin mahan liman uutettiin 0,5 M MgCl 2 2 h ja ravisteltiin ajoittain 1 minuutin ajan 30 minuutin välein aikavälillä. Sininen uute ravistettiin sitten voimakkaasti yhtä suuren tilavuuden kanssa dietyylieetteriä ja saatu emulsio sentrifugoitiin 3600 rpm: ssä 10 min. Absorbanssi (OD) Alcian Blue vesikerrokseen luettiin 580 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä. Määrä Alcian Blue poimia per gramma märkää mahan laskettiin sitten standardikäyrästä.
Etanoli aiheuttaman mahalaukun limakalvon vaurio L-NAME pre-käsiteltyjen rottien
osallistuminen endogeenisen NO moduloimaan etanolin aiheuttamia gastroprotective aktiivisuus määritettiin menetelmällä Andreo et al. [18], mutta pienin muutoksin. Urosrotat jaettiin satunnaisesti kahteentoista ryhmään (n = 6) ja paastosivat 24 tuntia, mutta niille annettiin vapaa pääsy veteen. Sitten ne esikäsitelty suolaliuoksella tai L-NAME (70 mg /kg; n estäjä NO-syntaasin) intraperitoneaalisesti (ip), ja 30 minuuttia myöhemmin, eläimet saivat vehikkeliä (10% DMSO: ta), 100 mg /kg CBX (positiivinen kontrolliryhmä) tai 500 mg /kg MEMM (po). Yksi tunti antamisen jälkeen tutkittavia liuoksia, mahahaava indusoitiin käyttämällä 5 ml /kg absoluuttista etanolia kaikissa ryhmissä. Toisaalta, L-arginiini (200 mg /kg) annettiin 30 min sen jälkeen, kun suolaliuoksen tai L-NAME hoitoa ja sen jälkeen 30 min myöhemmin etanoli hallinnon. Kaikki rotat tapettiin 1 h myöhemmin altistuminen dietyylieetterillä. Vatsa avattiin suurempaa kaarta pitkin määrittää haavauman (UA), kuten ovat kuvanneet Balaniin et al. [19]. Prosenttiosuus suoja laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: $$ \\ mathrm {Suojaus} \\ vasemmalle (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {ohjaus} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {käsitelty} \\ \\ mathrm {ryhmä} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {ohjaus} \\ right)} \\ kertaa 100 \\% $$ Etanoli aiheuttamaa mahalaukun limakalvon vaurio NEM ennalta saaneilla rotilla
tutkimiseksi osallistumisen sulfhydryyli- (SH) ryhmä modulaatioon etanolin aiheuttamia gastroprotektiivista aktiivisuutta, kuvaamia menettelyjä Andreo et al. [18] hyväksyttiin pienin muutoksin. Rotat jaettiin satunnaisesti 12 ryhmään (n = 6) ja paastosivat 24 tuntia, mutta niille annettiin vapaa pääsy veteen. Kokeilu alkoi esikäsittely (i.p.) suolaliuosta tai NEM (10 mg /kg), sulfhydryyli- (SH-) estäjä. Kolmekymmentä minuuttia sen jälkeen, kun esikäsittelyn rykmentti, rotille annettiin (po) ja ajoneuvon (10% DMSO: ta), 100 mg /kg CBX (positiivinen kontrolliryhmä) tai 500 mg /kg MEMM jälkeen annetaan 5 ml /kg etanolia tuntia myöhemmin aiheuttaa mahahaava. Kaikki eläimet tapettiin 1 h saatuaan etanolia altistumisen dietyylieetterillä. Vatsa poistettiin ja mahalaukun vaurioita määritettiin kuten edellä on kuvattu.
Biokemiallinen analyysi mahan kudoksissa
jälkeen makroskooppinen analyysit, superoksididismutaasi (SOD) [20], katalaasin (CAT) [21], myeloperoksidaasi (MPO) [22], glutationiperoksidaasia (GTP) [23], glutationireduktaasi (GTR) [24] ja tiobarbiturihappoon reagoivat aineet (TBARS) [25] entsyymin toimintaa rotan mahan kudoksissa mitattiin. Mahalaukun limakalvo raaputettiin pois antrumin osasta mahasta scrapper ja säilytettiin 4 ° C: ssa biokemiallisia arvio. Romutettujen mahalaukun limakalvon saatettiin valmistella limakalvon homogenaatti (pH 7,2). Homogenaattia sentrifugoitiin sitten 3000 rpm: ssä 10 minuutin ajan ja saatu supernatantti käytettiin analyysiin antioksidanttityyppistä etanolia indusoi mahalaukun limakalvon vaurioita. Kaikissa antioksidanttipuolustuksen määrityksissä, ranitidiini (100 mg /kg) -pretreated ryhmää pidettiin positiivisen kontrolliryhmän.
Määritys SOD aktiivisuuden
aktiivisuus SOD määritettiin inhibitioon perustuva muodostumista nikotiiniamidi-adeniini- dinukleotidi, fenatsiinimetosulfaatilla ja amino sininen tetratsoliumilla formatsaanisuolaksi [20]. Noin 0,5 ml kudoshomogenaattia sekoitettiin 0,4 ml: aan etanolin ja kloroformin seokseen ja sentrifugoitiin. Supernatanttiin, määritys seosta (natriumpyrofosfaattipuskurilla (0,025 M, pH 8,3), nitrosinitetratsoliumia, fenatsiini metosulfaatti ja vähentää nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NADH)) lisättiin ja inkuboitiin 30 ° C: ssa 90 s. Reaktio on estetty lisäämällä jääetikkaa ja sekoitetaan n
butanolia. Intensiteetti kehittynyt väri butanolissa mitattiin 560 nm: ssä. SOD-aktiivisuus mitattiin aste inhibitio tämän reaktion, ja ilmaistaan ​​millimoolia /min /mg proteiinia.
Määritys CAT-aktiivisuuden
aktiivisuus CAT määritettiin kolorimetrisesti 620 nm: ssä, kuten on kuvattu menetelmässä Sinha [21]. Reaktioseos 1,5 ml, joka sisältää 1,0 ml: ssa fosfaattipuskuria (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml 2,0 M H 2O 2 ja 1,0 ml kudoshomogenaattia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 2,0 ml dikromaattiliuosta-etikkahappoa reagenssilla (5% kaliumdikromaattia ja jääetikan seosta suhteessa 1: 3). Tulokset ilmaistaan ​​millimoolia /min /mg proteiinia.
Määritys MPO toiminnan
aktiivisuus MPO mitattiin menetelmän mukaisesti, ovat kuvanneet Bradley et al. [22], mutta pienin muutoksin. Homogenoitu näytteet jäädytettiin ja sulatettiin kolme kertaa ja sentrifugoitiin 1500 g: ssä 10 minuutin ajan 40 ° C: ssa. Noin 100 ui homogenisoitua supernatanttia lisättiin 1,9 ml 10 mmol /l (pH 6,0) ja 1,0 ml 1,5 mmol /LO-dianisidiini-hydrokloridi, joka sisälsi 0,0005% (w /v) H 2O 2. Absorbanssi arvioitiin 450 nm: ssä UV-spektrofotometrillä ja MPO-aktiivisuus mahan kudoksissa ilmaistiin pmol /min /mg proteiinia.
Määritys GTP toiminnan
aktiivisuus GTP mitattiin menetelmällä, jonka Rotruck et ai. [23] pienin muutoksin. Reaktioseos, joka sisälsi 0,2 ml 0,4 M, Tris - HCI-puskuriin, pH 7,0, 0,1 ml 10 mM natriumatsidia, 0,2 ml kudoshomogenaattia (homogenisoitiin kudos 0,4 M Tris-HCl-puskuria, pH 7,0), 0,2 ml glutationia ja 0,1 ml: aan 0,2 mM vetyperoksidia inkuboitiin sitten huoneenlämpötilassa 10 min. Reaktio on estetty lisäämällä 0,4 ml 10% TCA ja alistuminen linkousjärjestelmässä. Supernatantti analysoitiin glutationin pitoisuus käyttämällä Ellmans reagenssia (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro bentsoehappoa (DTNB) 100 ml: ssa 0,1% natriumnitraattia). Molaarinen ekstinktiokerroin 6,22 x 103 umol käytettiin aktiivisuuden määrittämiseksi GTP. Entsyymiaktiivisuus ilmaistaan ​​kansainvälistä yksikköä entsymaattista aktiivisuutta /g proteiinia. Kansainvälistä yksikköä ilmaistaan ​​mikromooleina hydroperoksidien transformoitujen /min /ml entsyymiä.
Määritys GTR aktiivisuuden
taso GTR määritettiin menetelmällä Ellman [24]. Approximately1.0 ml supernatanttia käsiteltiin 0,5 ml: lla Ellmans reagenssia (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro bentsoehappoa (DTNB) 100 ml: ssa 0,1% natriumnitraattia) ja 3,0 ml fosfaattipuskuria (0,2 M, pH 8,0 ). Absorbanssi luettiin 412 nm: ssä ja GTR aktiivisuus ilmaistiin pmol /min /mg kudosta.
Määrittäminen TBARS sisällön
laajuus LPO mitattiin analysoimalla tasot TBARS mahalaukun limakalvon mukaan Aiempi menetelmä [25], mutta pienin muutoksin. 0,5 ml kudoshomogenaattia, 1,5 ml 20% etikkahappoa, 0,2 ml SDS: ää ja 1,5 ml TBA lisättiin. Seos koostuu 4 ml tislattua vettä ja kuumennetaan 1 tunnin ajan 95 ° C: ssa. Jäähdyttämisen jälkeen 4,0 ml butanolia-pyridiini-seosta lisättiin ja ravisteltiin hyvin. Tämä seos sentrifugoitiin sitten 4000 rpm: ssä 10 min. Orgaaninen kerros otettiin ja sen absorbanssi luettiin aallonpituudella 532 nm ja tulokset ilmaistiin n mol /g proteiinia.
Arviointi proteiinin
proteiinipitoisuus mahalaukun kudosta arvioitiin menetelmällä Lowry et al. [26], mutta pienin muutoksin. Kudosnäytteen ja standardit (1,0 mg /ml naudan seerumialbumiinia kahdesti tislattua vettä) eri putkia käsiteltiin 5,0 ml: lla reagenssia seosta (48% natriumkaliumtartraatin, 2% kuparisulfaattia ja 3% natriumkarbonaattia 01:48 (v /v)). Sitten Folin fenolireagenssilla (1: 2), lisättiin reaktioseokseen ja sen annetaan seistä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Optinen tiheys luettiin 710 nm: ssä käyttäen vettä nollareagenssille.
In vitro anti-inflammatorista aktiivisuutta MEMM
vitro vaikutus MEMM typpioksidin
Soluviljely ja stimulaation
RAW 264.7 solulinja (hiiren monosyyttiset makrofagit) (European Collection of Cell Cultures, Porton Down, UK) ylläpiti DMEM 10% FBS: ää, 4,5 g /l glukoosia, L-glutamiinia (2 mM), natriumpyruvaattia (1 mM), penisilliiniä (50 U /ml) ja streptomysiiniä (50 ug /ml) ja 5% CO 2 37 ° C: ssa. Solut (4 x 10 5 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa CO 2-inkubaattorissa, jotta solujen kiinnittymiselle, ja sitten laukaistaan ärsykkeitä (100 U /ml IFN-g ja 5 ug /ml LPS) kanssa tai ilman läsnä MEMM pitoisuuden vaihtelee välillä 12,5-100 ug /ml. DMSO (ajoneuvo) käytettiin liuottamaan MEMM. Lopullinen DMSO-pitoisuus oli varmistettu olevan 0,1% kaikissa kulttuureissa. Sitten soluja inkuboitiin 17-20 tuntia 37 ° C: ssa CO 2-inkubaattorissa. NO-mittaus suoritettiin alistamalla viljellyt supernatantti Griessin määrityksessä ja jäljellä oleviin soluihin ja testattiin solujen elinkelpoisuuden määrityksessä.
Nitriitti määritys
pitoisuus nitriitin (NO 2 - ), stabiili metaboliitti NO viljelyalustassa, määritettiin käyttämällä Griessin määritystä [27]. Yhtä suuri tilavuus Griess-reagenssia sekoitettiin viljelmän supernatantista, ja värin kehittymistä mitattiin 550 nm: ssä. Määrä nitriittiä viljelmän supernatantissa määritettiin perustuen standardikäyrän natriumnitriittiä (0-100 uM) juuri valmistettua deionisoidussa vedessä. Prosenttiosuus NO esto laskettiin seuraavalla kaavalla: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ jossa;
* valvonta on nitriitin määrä IFN-γ /LPS-indusoidun ryhmä.
Solujen elinkyky
sytotoksisuus MEMM on viljellyt solut määritettiin määrittämällä väheneminen 3 - (4,5-dimetyyli-2-tiatsolyyli) -2,5-difenyyli-2H-tetratsoliumbromidia (MTT) [27]. MTT reagenssit (0,05 mg /ml) suspendoitiin steriiliin PBS: ään, pH 7,0, ja lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan jälkeen supernatantti poistettiin. Tätä seurasi inkubointi jäljellä olevia soluja 37 ° C: ssa 4 h, minkä jälkeen lisättiin 100 ui 100% DMSO: ta kuoppiin liuottamiseksi formatsaanin muodostuneet suolat. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm. Prosenttiosuus solujen elinkelpoisuus laskettiin seuraavalla kaavalla: $$ \\ mathrm {Solu} \\ \\ mathrm {elinkelpoisuuden} \\ vasemmalle (\\% \\ right) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {ohjaus}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {näyte}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Uutta menetelmää, digitaalinen genomin skannaus tunnistaa KRAS geenivahvistus mahasyövistä: osallistuminen yli-ilmentynyt villin tyypin KRAS loppupään signalointi ja syöpäsolujen growth
• Perimän profiilin analyysi hajanainen-tyyppinen mahalaukun cancers