Mekanismer af gastrobeskyttelse methanol ekstrakt af Melastoma malabathricum blade

Mekanismer af gastrobeskyttelse methanol ekstrakt af Melastoma malabathricum
blade
Abstrakt
Baggrund
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) er en lille busk med forskellige medicinske anvendelser. Den foreliggende undersøgelse blev udført for at bestemme de gastrobeskyttende mekanismer methanol ekstrakt af M. malabathricum
blade (MEMM) hos rotter.
Metoder
ekstrakt mekanismer af gastrobeskyttelse (50, 250, 500 mg /kg) blev undersøgt ved anvendelse af pylorus-ligering i rottemodel hvor volumen, pH, frit og totalt syreindhold af mavesaft, og mavevæggen slim indhold blev bestemt. blev også målt inddragelse af endogene forbindelser nitrogenoxid (NO) og sulfhydryl (SH) i gastrobeskyttende virkning MEMM. MEMM blev underkastet den antioxidant, anti-inflammatoriske og fytokemiske analyse og HPLC profilering.
Resultater Salg MEMM indeholdt forskellige phyto-bestanddele med quercitrin påvises som en del af dem. MEMM og quercitrin: i) signifikant (p < 0,05) reduceret mængden og surhedsgrad mavesaft samtidig øge pH og gastrisk væg slim indhold .; ii) signifikant (p < 0,05) øget niveau af SOD, GTP og GTR mens signifikant (p < 0,05) reducerede niveauet af CAT, MPO og TBARS aktiviteter .; iii) udøvede gastrobeskyttende aktivitet ved undersøgelse ved hjælp af ethanol-inducerede mavesår assay, der blev vendt ved N G-nitro-L-arginin methylestere (L-NAME; en inhibitor for NO-syntase) og N
- ethylmaleimid (NEM, en sulfhydryl (SH) blokker). MEMM hæmmede lipoxygenase (LOX) og xanthin oxidase (XO) med den størst affinitet for det tidligere, mens quercitrin viste høj affinitet for XO-aktivitet.
Konklusioner
MEMM udstillet en gastroprotektiv aktivitet dels på grund af tilstedeværelsen af ​​quercitrin, dens antioxidant og anti-inflammatoriske aktiviteter, og via modulering af NO og SH-grupper.
Nøgleord
Melastoma malabathricum
Melastomaceae Methanol ekstrakt gastroprotektive mekanismer Nitrogenoxid sulfhydrylgruppe antioxidant anti-inflammatorisk Baggrund
mavesår er en almindelig lidelse af hele mave-tarmkanalen. Af næsten 8 til 10% af verdens befolkning er berørt af mavesår, ca. 5% af dem lider af mavesår [1]. De sår, som påvirker det gastrointestinale system sædvanligvis forværres af et misforhold mellem destruktive og defensive faktorer i maven [1]. Selvom betragtes som multifaktoriel sygdom, er det almindeligt anerkendt, at næsten alle mavesår er forbundet med infektion af Helicobacter pylori
og de store terapeutiske mål er at udrydde H. pylori
infektion. I øjeblikket er den første linje behandling af mavesår målrettet på at udrydde H. pylori
infektion og normalt baseret på triple behandling procedure, der indebar brug af mavesår hæmmere (Dvs. histamin H 2-antagonister, proton pumpe hæmmere eller sucralfat og bismuth) i kombination med to typer antibiotika [2]. Imidlertid bør det forhold, at der er andre end H. pylori
forskellige faktorer, der kan udløse gastrisk sårdannelse ikke ignoreres [3]. Forskellige fremgangsmåder er blevet anvendt til behandling af mavesår forbundet med de ikke-H. pylori
-relaterede faktorer såsom at reducere syre sekretion og øget slim produktion, men disse metoder har været betragtet som den anden linje behandling.
Trods deres effektivitet i at udrydde H. pylori
, behandlingen er kompleks og høje omkostninger, involverer anvendelse af mindst to antibiotika i kombination med mavesyre inhibitorer. Denne kombination bevirker ofte adskillige uønskede bivirkninger (dvs. antibiotikaresistens, tilbagefald, kvalme) [2,3]. På trods af, at H. pylori
infektioner gradvist er faldet igennem de fleste industrialiserede lande, observeres en gradvis stigning i svigt af H. pylori Salg udryddelse behandlinger andetsteds [2]. Dette er yderligere forværret af foreningen af ​​disse standard antiulcusmidler med forskellige uønskede bivirkninger. I betragtning af deres forskellige bivirkninger og forekomsten af ​​antibiotikaresistente H. pylori
stammer, søgen efter nye og sikre ikke-antibiotiske gastroprotektive agenter fra naturlige kilder, især planter, fortsætte med at stige i hele verden [2, 4].
En af de planter, der anvendes til behandling af mavesår i Malaysia er Melastoma malabathricum
L. (familie Melastomaceae). Lokalt kendt af malaysisk som "Senduduk
', er M. malabathricum
findes rigeligt i Indiske Ocean Island, hele Syd- og Sydøstasien, Taiwan, Kina, sydlige Stillehav og Australien. Forskellige dele af planten anvendes i malaysisk traditionelle lægemidler til behandling af en række lidelser med blade, især har været anvendt til behandling af mavesår blandt andre [5]. Videnskabeligt har M. malabathricum
dele blevet rapporteret at udvise forskellige farmakologiske aktiviteter [5-7]. Undtagen til sin traditionelle anvendelse som middel mod ulcerationer, blev M. malabathricum
valgt i nærværende undersøgelse baseret på det faktum, at det er en af ​​de berømte urter i Malay lægemiddel folklore, men fik manglende opmærksomhed blandt samfundet. Desuden M. malabathricum
er blevet rapporteret at indeholde høj samlet phenol indhold og at udøve høj antioxidant og anti-inflammatoriske aktiviteter [5-7], som er vigtige i mekanismerne i mavesårsmedicin af eventuelle forbindelser /ekstrakter. Det er velkendt, at mavesår, især dem inducerer med ethanol, er forbundet med ROS-generering. Ethanol trænger hurtigt maveslimhinden, som det er i stand til at solubilisere de beskyttende slim og forårsager frigivelse af hydroperoxyfedtsyrer-fri radikaler og superoxid anion. Disse frie radikaler forårsager en stigning i oxidativt stress i vævene, hvilket igen øger niveauet af malondialdehyd, en markør for øget lipidperoxidation. Samlet set kan ethanol-induceret skadelig virkning manifesteres direkte via dannelse af reaktive metabolitter eller indirekte via aktivering andre mekanismer, der endelig udløser oxidativ [7] skade. Derfor ekstrakter /forbindelser med antioxidanter aktivitet spiller en meget vigtig rolle i scavenging de frie radikaler og hæmme lipidperoxidering. I stedet for dette, har M. malabathricum
blevet rapporteret til at udøve en bemærkelsesværdig antioxidantvirkning [7], og derfor menes at besidde antiulcus potentiale. Vores tidligere screening af methanol ekstrakt af M. malabathricum
(MEMM) for antiulcus potentiale mod ethanolproducerende og indomethacin-induceret gastrisk ulcus modeller er blevet rapporteret andetsteds [8]. MEMM viste sig at dæmpe ethanol-induceret, men forværres indomethacin-induceret, mavesår formation. Evne MEMM at udøve både gastrobeskyttelse og antiinflammatoriske aktiviteter [5] er i modsætning til den for indomethacin, som kun udøves antiinflammatorisk aktivitet. Denne observation tyder på, at ekstraktet aktiverer gastrobeskyttelse via en mekanisme, der ikke er forbundet med den for anti-inflammation. Endvidere kan den antiinflammatoriske aktivitet af MEMM eventuelt afveg fra den, der udøves af indomethacin. Bliver en inhibitor af begge Coxs (dvs. COX-1 og COX-2), indomethacin er mere selektiv for COX-1, som er nødvendig for at opretholde beskyttende maveslimhinden lag [9]. Evne MEMM at intensivere indomethacin-induceret gastrisk sårdannelse antyder, at MEMM også kunne inhiberes COX-1-funktion og forstyrre dannelsen af ​​konstitutiv PG, der hjælper til at beskytte maveslimhinden blandt andre. På den anden side kan evnen hos MEMM at udøve anti-inflammatorisk aktivitet skyldes dens evne til at inhibere COX-2-afhængige respons associeret med carrageenan-inducerede rotte pote ødem test [5; 9]. Bortset fra at kunne MEMM også arbejde Modsat ved at aktivere COX-2, hvilket fører til øget PGE 2 syntese, som er blevet rapporteret at udøve anti-inflammatorisk aktivitet ved binding til en af ​​dens receptorer, PGE-receptor 4 (EP 4) [10]. Endvidere PGE 2 er blevet kendt for at være en forløber for dannelsen af ​​cyclopentenon prostaglandiner (cyPG), der har en anti-inflammatorisk [11]. Endvidere evnen til at aktivere PGE 2 syntese, hvilket igen øger den gastriske slim produktion, kan ske via aktiveringen af ​​EP 3 receptorer [10]. Dette kan igen hjælpe med at forklare evne MEMM at påvise anti-inflammatorisk aktivitet, medens på samme tid, udøver antiulcus aktivitet mod ethanol-, men ikke indomethacin-induceret model. På trods af disse forslag, der er ikke gjort forsøg på at bestemme de mulige mekanismer for gastrobeskyttelse af MEMM, som kunne anvendes til at forklare den observerede mavesårsmedicin aktivitet.
Under hensyntagen til ovennævnte rapport [8] og en anden rapporter fra Hussain et al. [6], som vurderede mavesårsmedicin potentiale vandigt ekstrakt af M. malabathricum
kun bruger en model af mavesår (dvs. ethanol-induceret model), den aktuelle undersøgelse var designs. Selvom M. malabathricum
aldrig har været anvendt til behandling af H. pylori
infektion, hvilket understøttes af dens ringe antibakteriel aktivitet [12,13], den traditionelle brug af planten til behandling af mavesår berettiget tilstedeværelsen forskning med håbet om at finde en alternativ /naturlig gastrobeskyttende middel som en erstatning for de aktuelt tilgængelige bivirkning-blottelse lægemidler, der anvendes i anden linje behandling. Tager dette faktum i betragtning, nærværende undersøgelse havde til formål at undersøge, om de mulige mekanismer gastrobeskyttelse af MEMM ved hjælp af forskellige rotter modeller.
Metoder
Kemikalier
De kemikalier, der anvendes i denne undersøgelse er af analytiske kvaliteter og var blevet forberedt umiddelbart før brug. De følgende lægemidler blev anvendt: ranitidin (Sigma Aldrich, USA), quercitrin (Sigma-Aldrich, USA), absolut ethanol (Fischer Scientific, USA), N-ethylmaleimid (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G nitro-L-arginin methylestere (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), carbenoxolon (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) og diethylether (Fischer Scientific, USA).
Plant materialer indsamling og forberedelse af MEMM
bladene af M. malabathricum
blev indsamlet mellem august og september 2010 fra Serdang, Selangor, Malaysia, og identificeres med en botaniker fra Institut for Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, Malaysia. En voucher eksemplar, ACP-0017, er blevet deponeret på Herbarium af IBS, UPM, Malaysia. De formalede tørrede blade (40 g) blev gennemvædet tre gange ved stuetemperatur i 24 timer med methanol i forholdet 1:20 (w /v) og methanol supernatanten blev inddampet (40 ° C) under reduceret tryk til tørhed resulterede i et udbytte på 12,8 g tørret og sticky methanolekstrakt (procent gav blev ≈ 32%).
fytokemiske screening og HPLC-analyse af MEMM
fytokemiske screening og HPLC-analyse af MEMM blev udført ifølge den tidligere beskrevne metode [ ,,,0],7]. Phytochemical screening af MEMM blev udført for at bestemme tilstedeværelsen af ​​flavonoider, triterpener, tanniner, alkaloider og saponiner i henhold til de traditionelle protokoller som beskrevet below.i) Flavonoider
Ca. 10,0 g MEMM blev separat kogt i 2 til 3 minutter i 100 ml vand i et vandbad. Til 3 ml af filtratet, 3 ml syre-alkohol (ethanol: vand: koncentreret saltsyre i forholdet 1: 1: 1), fast magnesium (1 cm) og 1 ml t-amyl-alkohol blev tilsat. Blandingerne blev derefter observeret for en rose-orange eller overtræder farve change.ii) triterpener
Ca. 1,0 g MEMM blev separat udvundet i 24 timer i ether. 1 ml af filtratet blev inddampet til tørhed, og remanensen genopløst i flere dråber eddikesyreanhydrid og derefter flere dråber svovlsyre blev tilsat til opløsningen. Blandingerne blev derefter observeret for en grøn farve change.iii) Garvesyrer
Ca. 0,2 g MEMM blev separat kogt i 5 ml vand. Blandingerne blev afkølet og filtreret. Nogle få dråber (3 dråber) af 5% ferrichloridopløsning blev tilsat til filtratet, og iagttages en blå-sort bundfald formation.iv) Alkaloider
Ca. 0,5 g MEMM blev separat kogt med 10 ml fortyndet saltsyre (alkoholiske) i et reagensglas i 5 min. Blandingerne blev afkølet og resterne fik lov at sætte sig. Hver af supernatanten væsker blev filtreret ind i en anden reagensglas og blev taget ind i hvilken tre dråber Dragendorffs reagens (kalium bismuth iodid opløsning) blev tilsat, rystet og observeret for forekomsten af ​​en orange-rød plet, og et præcipitat 1 ml af hver filtrat formation.v) Saponiner
Ca. 0,2 g MEMM blev rystet med vand, og blandingen blev observeret for en vedvarende skum.
HPLC-analyse af MEMM blev udført i overensstemmelse med den foregående rapport [4 ], men med mindre ændringer. Kort fortalt blev MEMM (10 mg) suspenderet i 1 ml methanol. Opløsningen blev ledt gennem en filterpatron (porestørrelse på 0,45 um) inden analyse. Den filtrerede prøve blev analyseret ved hjælp af HPLC system bestående af Waters Delta 600 med 600 Controller, fotodiodegrupperingsdetektor (Waters 996). Og en Phenomenex Luna (5 um) (Torrance, CA, USA) søjle (4,6 mm i.d. x 250 mm). To opløsningsmidler betegnet som A og B blev anvendt til eluering af bestanddelene. A var 0,1% vandig myresyre og B var acetonitril. Oprindelige betingelser var 95% A og 5% B med en lineær gradient nå 25% B ved t
= 12 min og denne betingelse blev opretholdt i 8 min. B blev reduceret tilbage til 15% ved t
= 22 min og holdt ved denne betingelse for en anden 8 min (t
= 30 min). Ved t
= 35 min, programmet tilbage til den oprindelige sammensætning opløsningsmiddel. Den anvendte strømningshastighed var 1,0 ml /min og injektionsvolumenet var 10 pi. Søjlen ovn blev indstillet til 27 ° C, og eluenten blev monitoreret ved 210, 254, 280, 300, 330 og 366 nm. Retentionstiderne, toparealer og UV-spektre af de store toppe blev analyseret. HPLC-analyse blev udført i Laboratoriet for Phytomedicine, lægeplanter Division, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Malaysia
Eksperimentelle dyr
Mand Sprague Dawley-rotter (180-200 g;. 8-10 uger gamle) blev opnået fra Veterinary Animal Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Universiti Putra Malaysia (UPM), Malaysia og holdes under stuetemperatur (27 ± 2 ° C, 70-80% luftfugtighed, 12 timers lys /mørke cyklus) i Animal Holding Unit, medicinske fakultet og Sundhedsvidenskabelige Fakultet, UPM. De fik foder og vand ad libitum
fra begyndelsen af ​​forsøgene. Undersøgelsen protokollen ifølge undersøgelse blev godkendt af Animal House og brug Udvalg, Det Medicin og Sundhedsvidenskab, UPM (Etisk godkendelse nr: UPM /FPSK /pads /BR-Uuh /00449). Rotterne blev håndteret i overensstemmelse med gældende UPM retningslinjer for pleje af forsøgsdyr og de etiske retningslinjer for undersøgelser af eksperimentel smerte i bevidste dyr [14]. blev udført Alle eksperimenter mellem 09.30 og 18.30 h for at minimere virkningerne af miljømæssige forandringer. Fasting blev påført i 48 timer forud for alle analyser, hvor rotterne fik adgang til kun vand.
Bestemmelse af de mulige mekanismer for gastrobeskyttelse af MEMM
pylorus ligation-induceret sårdannelse
pylorus ligering blev udført ifølge den metode, Shay et al. [15] med små modifikationer. Tredive rotter blev opdelt tilfældigt i 5 grupper (n = 6). Gruppe-I (kontrol) blev behandlet med vehikel (10% DMSO) blev gruppe-II (positiv kontrol, ranitidin) givet ved 100 mg /kg (po), gruppe-III, -IV og-V, rotter blev behandlet med MEMM (50, 250 og 500 mg /kg). Pylorus ligering blev udført 1 time efter administrationen af ​​testforbindelserne på 48 timer fastede rotter. Ketamin HCl (100 mg /kg, intramuskulært) og xylazin HCI (16 mg /kg, intramuskulært) blev anvendt til at bedøve rotterne før ligering af pylorus. En 2 cm lang indsnit i maven lige under brystbenet på bedøvede rotter. Maven blev blotlagt, og en tråd blev ledt rundt pylorus sphincter og bundet i en stram knude. Pleje blev taget, mens binde knude for at undgå at inddrage blodkar i knude. Abdomen blev syet, og huden blev renset for eventuelle blod pletter eller blødning. Dyrene blev aflivet 6 timer efter ligering ved cervikal dislokation.
Bestemmelse af volumen, pH, frit og totalt syreindhold af gastrisk indhold
Maverne blev fjernet, og indholdet blev drænet ud, samles, og centrifugeret ved 2500 rpm i 10 min. Volumenet og pH af mavesaft blev målt og blev underkastet frit og totalt syreindhold estimering ifølge fremgangsmåden beskrevet af Srivastava et al. [16]. Frie syrer blev bestemt ved titrering med 0,01 N natriumhydroxid (NaOH) med methylorange reagens, indtil opløsningens farve blev gullig. Volumenet af alkali tilsættes blev noteret. Derefter blev to til tre dråber phenolphthalein tilsættes, og opløsningen blev titreret indtil en bestemt lyserød farve. Det totale volumen af ​​NaOH tilsættes blev bemærket, og dette svarer til det totale syreindhold. Syreindhold blev beregnet ud fra følgende formel: $$ \\ mathrm {Syreindhold} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {af} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ tider \\ mathrm {normalitet} \\ kern0.5em \\ mathrm {af} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ gange 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Estimering af gastrisk væg slim indhold
mavevæggen slim blev bestemt ved den af ​​Corne et al. [17] med små modifikationer. Maven blev åbnet langs den største krumning, vejet og neddyppet i 10 ml 0,1% Alcian blå i 0,16 M saccharose /0,05 M natriumacetat, pH 5,8 i 2 timer. Den overdrevne farvestof blev derefter fjernet ved to på hinanden følgende skylninger i 0,25 M saccharoseopløsning (15 min hver). Den resterende farvestof kompleks med de gastriske slim blev ekstraheret med 0,5 M MgCl 2 i 2 timer og rystet intermitterende i 1 min i hver 30 min interval. Den blå ekstrakt blev derefter rystet kraftigt med et tilsvarende volumen af ​​diethylether og den resulterende emulsion blev centrifugeret ved 3600 rpm i 10 min. Absorbansen (OD) af Alcian Blå i det vandige lag blev aflæst ved 580 nm ved anvendelse af et spektrofotometer. Mængden af ​​alcianblåt ekstrakt per gram våd mave blev derefter beregnet ud fra en standardkurve.
Ethanol-induceret maveslimhindelæsion i L-NAME pre-behandlede rotter
Inddragelsen af ​​endogent NO i modulering af ethanol-inducerede gastrobeskyttende aktivitet blev bestemt ifølge fremgangsmåden ifølge Andreo et al. [18], men med små modifikationer. Hanrotter blev tilfældigt inddelt i tolv grupper (n = 6) og fastet i 24 timer, men fik fri adgang til vand. De blev derefter forbehandlede med saltvand eller L-NAME (70 mg /kg; en inhibitor for NO-syntase) intraperitonealt (ip) og 30 min senere fik dyrene køretøj (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positiv kontrolgruppe) eller 500 mg /kg MEMM (po). En time efter administrationen af ​​testopløsninger blev mavesår fremkaldt ved anvendelse af 5 ml /kg absolut ethanol i alle grupper. På den anden side blev L-Arginin (200 mg /kg) administreret, 30 minutter efter saltvand eller L-NAME behandling og fulgt 30 min senere af ethanol administration. Alle rotter blev aflivet 1 time senere ved udsættelse for diethylether. Maven blev åbnet langs den største krumning for at bestemme ulcus område (UA) som beskrevet af Balan et al. [19]. Den procentvise beskyttelse blev beregnet ved hjælp af følgende formel: $$ \\ mathrm {Beskyttelse} \\ venstre (\\% \\ højre) = \\ frac {\\ venstre (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontrol} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {behandlet} \\ \\ mathrm {gruppe} \\ højre)} {\\ venstre (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontrol} \\ højre)} \\ gange 100 \\% $$ Ethanol-induceret maveslimhindelæsion i NEM pre-behandlede rotter
at undersøge involvering af sulfhydryl (SH) gruppe i modulering af ethanol-induceret gastroprotektiv aktivitet, de procedurer, der er beskrevet af Andreo et al. [18] blev vedtaget med mindre ændringer. Rotterne blev tilfældigt inddelt i 12 grupper (n = 6) og fastet i 24 timer, men fik fri adgang til vand. Forsøget startede med forbehandling (i.p.) af saltvand eller NEM (10 mg /kg), en sulfhydryl (SH-) blocker. Tredive minutter efter forbehandlingen regiment blev rotterne indgivet (po) med vehikel (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positiv kontrolgruppe) eller 500 mg /kg MEMM efterfulgt af administration af 5 ml /kg ethanol en time senere for at inducere gastrisk ulceration. Alle dyr blev aflivet 1 time efter at have modtaget ethanol ved udsættelse for diethylether. Maven blev fjernet og gastrisk beskadigelse blev bestemt som beskrevet ovenfor.
Biokemisk analyse af mave væv
Efter de makroskopiske analyser, superoxiddismutase (SOD) [20], katalase (CAT) [21], myeloperoxidase (MPO) [22], glutathionperoxidase (GTP) [23], glutathion-reduktase (GTR) [24] og thiobarbitursyre reaktive stoffer (TBARS) [25] enzymaktiviteter i rottens mave væv blev målt. Maveslimhinden blev skrabet fra antrale del af maven ved anvendelse af en scrapper og opbevaret ved 4 ° C i biokemisk estimation. Den ophugget maveslimhinden blev underkastet forberede den mucosale homogenatet (pH 7,2). Homogenatet blev derefter centrifugeret ved 3000 rpm i 10 min, og den opnåede supernatant blev anvendt til analyse af antioxidant type på ethanol-induceret gastrisk mucosal beskadigelse. I alle antioxidant forsvar analyser blev ranitidin (100 mg /kg) -pretreated gruppe betragtes som den positive kontrolgruppe.
Bestemmelse af SOD aktivitet
Aktiviteten af ​​SOD blev bestemt på grundlag af hæmning af dannelsen af ​​nikotinamid adenin dinukleotid, phenazinmethosulfat og amino tetrazolium formazan [20]. Ca. 0,5 ml af vævshomogenat blev blandet med 0,4 ml ethanol og chloroform-blanding og centrifugeret. Til supernatanten, assayblandingen (natriumpyrophosphat puffer (0,025 M, pH 8,3), nitroblåt tetrazolium, phenazin methosulfat og reduceret nikotinamid-adenin-dinucleotid (NADH)) blev tilsat og inkuberet ved 30 ° C i 90 s. Reaktionen blev standset ved tilsætning af iseddike og blandes med n-butanol
. Intensiteten af ​​farven udvikles i butanol blev målt ved 560 nm. SOD-aktivitet blev målt ved graden af ​​inhibering af denne reaktion og udtrykkes som millimol /min /mg protein.
Bestemmelse af CAT-aktivitet
Aktiviteten af ​​CAT blev analyseret kolorimetrisk ved 620 nm som beskrevet ved fremgangsmåden ifølge Sinha [21]. Reaktionsblandingen på 1,5 ml indeholdende 1,0 ml phosphatbuffer (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml 2,0 M H 2O 2 og 1,0 ml vævshomogenat. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 2,0 ml dichromat-eddikesyre-reagens (5% kaliumdichromat og iseddikesyre blanding i forholdet 1: 3). Resultater udtrykkes som millimol /min /mg protein.
Bestemmelse af MPO-aktivitet
Aktiviteten af ​​MPO blev målt ifølge fremgangsmåden beskrevet af Bradley et al. [22], men med mindre ændringer. De homogeniserede prøver blev frosset og optøet tre gange og centrifugeret ved 1500 g i 10 minutter ved 40 ° C. Ca. 100 pi af den homogeniserede supernatant blev tilsat til 1,9 ml 10 mmol /l phosphatbuffer (pH 6,0) og 1,0 ml 1,5 mmol /LO-dianisidin hydrochlorid indeholdende 0,0005% (w /v) H 2O 2. Absorbansen blev evalueret ved 450 nm på et UV-spektrofotometer og MPO-aktivitet i gastriske væv blev udtrykt som pmol /min /mg protein.
Bestemmelse af GTP aktivitet
Aktiviteten af ​​GTP blev målt ved den af ​​Rotruck fremgangsmåde et al. [23] med små modifikationer. Reaktionsblandingen, som indeholdt 0,2 ml 0,4 M Tris - HCl-puffer, pH 7,0, 0,1 ml 10 mM natriumazid, 0,2 ml vævshomogenat (homogeniseret væv i 0,4 M Tris-HCI-buffer, pH 7,0), 0,2 ml glutathion og 0,1 ml 0,2 mM hydrogenperoxid blev derefter inkuberet ved stuetemperatur i 10 min. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 0,4 ml 10% TCA og underkastelse til centrifugering processen. Supernatanten blev analyseret for glutathion-indhold ved hjælp af Ellmans reagens (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro benzoesyre (DTNB) i 100 ml 0,1% natriumnitrat). En molær ekstinktionskoefficient på 6,22 x 103 pmol blev anvendt til bestemmelse af aktiviteten af ​​GTP. Enzymaktiviteten blev udtrykt som internationale enheder af enzymatisk aktivitet /g protein. Internationale enheder er udtrykt som gmol hydroperoxider transformeret /min /ml enzym.
Bestemmelse af GTR aktivitet
Niveauet af GTR blev bestemt ved metoden ifølge Ellman [24]. Approximately1.0 ml supernatant blev behandlet med 0,5 ml Ellmans reagens (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro benzoesyre (DTNB) i 100 ml 0,1% natriumnitrat) og 3,0 ml phosphatpuffer (0,2 M, pH 8,0 ). Absorbansen blev aflæst ved 412 nm, og GTR-aktivitet blev udtrykt som pmol /min /mg væv.
Bestemmelse af TBARS indhold
Omfanget af LPO blev målt ved at analysere niveauerne af TBARS i maveslimhinden ifølge den tidligere metode [25], men med mindre modifikation. Til 0,5 ml af vævshomogenat, 1,5 ml 20% eddikesyre, 0,2 ml SDS og 1,5 ml TBA blev tilsat. Blandingen blev fyldt op til 4 ml med destilleret vand og opvarmet i 1 time ved 95 ° C. Efter afkøling blev 4,0 ml butanol-pyridin-blanding tilsat, og rystes godt. Denne blanding blev derefter centrifugeret ved 4000 rpm i 10 min. Det organiske lag udtoges, og dens absorbans blev aflæst ved 532 nm, og resultaterne blev udtrykt som n mol /g protein.
Estimering af protein
Proteinindholdet i det gastriske væv blev estimeret ifølge fremgangsmåden ifølge Lowry et al. [26], men med mindre ændringer. Vævsprøven og standarderne (1,0 mg /ml bovint serumalbumin i dobbelt destilleret vand) i forskellige rør blev behandlet med 5,0 ml reagens blanding (48% natrium kalium tartrat, 2% kobbersulfat og 3% natriumcarbonat i 01:48 (vol /vol)). Derefter Folin phenol reagens (1: 2) blev tilsat til reaktionsblandingen og får lov at henstå i 30 minutter ved stuetemperatur. Den optiske densitet blev aflæst ved 710 nm under anvendelse af vand som reagens blank. Salg In vitro anti-inflammatorisk aktivitet af MEMM Salg In-vitro virkning MEMM på nitrogenoxid
Cellekultur og stimulering
RAW 264.7 cellelinie (murine monocytiske makrofager) (European Collection of cell Cultures, Porton Down, UK) blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% FBS, 4,5 g /l glucose, L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 ug /ml) og 5% CO 2 ved 37 ° C. Cellerne (4 × 10 5 celler /brønd) blev podet i en 96-brønds plade og inkuberet i 2 timer ved 37 ° C i en CO 2 inkubator for at tillade binding af celler, og derefter udløses med stimuli (100 U /ml IFN-g og 5 ug /ml LPS) med eller uden tilstedeværelse af MEMM i koncentrationsintervallet mellem 12,5-100 ug /ml. DMSO (vehikel) blev anvendt til at opløse MEMM. Slutkoncentrationen af ​​DMSO blev sikret at være 0,1% i alle kulturer. Celler blev derefter inkuberet i 17-20 timer ved 37 ° C i en CO 2 incubator. NO-bestemmelse blev udført ved at underkaste den dyrkede supernatant mod Griess-assayet, og cellerne forbliver i brønden blev testet for levedygtighed celleassay
Nitrit bestemmelse
nitrit- (NO 2 . - ), en stabil metabolit af NO i dyrkningsmedium, blev bestemt under anvendelse af Griess-assayet [27]. Et tilsvarende volumen Griess-reagens blev blandet med kultursupernatanten og farveudviklingen blev målt ved 550 nm. Mængden af ​​nitrit i kultursupernatanten blev bestemt baseret på standardkurven af ​​en natriumnitrit (0-100 uM) frisk fremstillet i deioniseret vand. Procent af NO hæmning blev beregnet ved anvendelse af formlen nedenfor: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ hvor;
* kontrol er nitrit niveau af IFN-γ /LPS-induceret gruppe
Cellelevedygtighed
cytotoksicitet MEMM på de dyrkede celler blev bestemt ved at analysere reduktionen af ​​3. - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) [27]. MTT reagenser (0,05 mg /ml) blev suspenderet i sterilt PBS, pH 7,0, og derefter tilsat til hver brønd efter fjernelse af supernatanten. Dette blev efterfulgt af inkubation af de resterende celler ved 37 ° C i 4 timer efterfulgt af tilsætning af 100 pi 100% DMSO i brøndene for at opløse formazan salte dannet. Absorbansen blev målt ved 570 nm. Procentdelen af ​​cellelevedygtighed blev beregnet efter følgende formel: $$ \\ mathrm {Cell} \\ \\ mathrm {levedygtighed} \\ venstre (\\% \\ højre) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {kontrol}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {prøve}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• En ny metode, digital genom scanning registrerer KRAS genamplifikation i gastrisk kræft: inddragelse af overudtrykt vildtype-KRAS i nedstrøms signalering og kræft cellevækst
• Genomisk profil analyse af diffus type gastrisk cancers