Mecanismos de protección gástrica del extracto de metanol de Melastoma malabathricum leaves

mecanismos de protección gástrica del extracto de metanol de Melastoma malabathricum
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Resumen Antecedentes

Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) es una pequeña mata de varios usos medicinales. El presente estudio se llevó a cabo para determinar los mecanismos protectores gástricos del extracto de metanol de M. malabathricum
hojas (Memm) en ratas.
Métodos
mecanismos de extracto de protección gástrica (50, 250, 500 mg /kg) fueron estudiados mediante el píloro-ligadura en el modelo de rata en el que se determinaron el volumen, pH, libre y acidez total del jugo gástrico, y el contenido de la pared mucosa gástrica. También se midió la participación de compuestos endógenos de óxido nítrico (NO) y sulfhidrilo (SH) en el efecto gastroprotector de Memm. Memm se sometió al antioxidante, antiinflamatorio y fitoquímico análisis y perfiles de HPLC.
Resultados
Memm contenían varios fito-constituyentes con quercitrina siendo identificado como parte de ellos. Memm y quercitrina: i) significativamente (p < 0,05) redujo el volumen y la acidez del jugo gástrico, mientras que el aumento del pH y el contenido de la pared mucosa gástrica .; ii) significativamente (p < 0,05) incrementó el nivel de SOD, GTP y GTR, mientras que de forma significativa (p < 0,05) redujo el nivel de CAT, las actividades de la MPO y TBARS .; iii) la actividad ejercida gastroprotector cuando se evaluó utilizando el ensayo de úlcera gástrica inducida por etanol, que fue revertido por la N G-nitro-L-arginina ésteres metílicos (L-NAME, un inhibidor de la NO sintasa) y N CD - etilmaleimida (NEM; un sulfhidrilo (SH) bloqueador). Memm inhibe la lipoxigenasa (LOX) y las actividades de la xantina oxidasa (XO) con la mayor afinidad por el primero, mientras que quercitrina mostró una alta afinidad para la actividad de XO.
Conclusiones
Memm exhibió una actividad gastroprotectora en parte debido a la presencia de quercitrina, sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias actividades, ya través de la modulación de los grupos de NA y SH.
Palabras clave
Melastoma malabathricum
Melastomaceae metanol extraen mecanismos gastroprotectores nítrico grupo sulfhidrilo óxido de antioxidante blanco anti-inflamatoria
las úlceras pépticas son un trastorno común de todo el tracto gastrointestinal. De cerca de 8 a 10% de la población mundial afectada por las úlceras pépticas, aproximadamente el 5% de ellos sufren de úlceras gástricas [1]. Las úlceras que afectan al sistema gastrointestinal generalmente se agravan por una desproporción entre los factores destructivos y defensivas en el estómago [1]. Aunque se considera como una enfermedad multifactorial, en general se reconoce que casi todas las úlceras pépticas están relacionados con la infección de Helicobacter pylori
y el objetivo terapéutico importante es erradicar la infección por H. pylori
. En la actualidad, el tratamiento médico de primera línea de la úlcera gástrica está dirigido a la erradicación de H. pylori
infección y por lo general basado en el procedimiento de tratamiento triple, que implicó el uso de inhibidores de la úlcera gástrica (Ie histamina H 2-antagonistas, protón inhibidores de la bomba, o sucralfato y bismuto) en combinación con dos tipos de antibióticos [2]. Sin embargo, el hecho de que hay varios factores distintos de H. pylori
que pueden desencadenar la formación de úlcera gástrica no debe ser ignorado [3]. Diversos enfoques se han utilizado en el tratamiento de la úlcera gástrica asociada con los no-H. pylori
factores relacionados con la PI como la reducción de la secreción de ácido y el aumento de la producción de moco, pero estos enfoques han sido considerados como el tratamiento de segunda línea.
A pesar de su eficacia en la erradicación de H. pylori
, el tratamiento es complejo y de alto costo, que implica el uso de al menos dos antibióticos en combinación con inhibidores de ácidos gástricos. Esta combinación a menudo causa varios efectos secundarios no deseados (es decir, resistencia a los antibióticos, la recurrencia, náuseas) [2,3]. A pesar del hecho de que H. pylori
infecciones han disminuido gradualmente a lo largo de la mayoría de los países industrializados, un aumento gradual en la insuficiencia de H. pylori
tratamientos de erradicación se observa en otras partes [2]. Esto se agrava aún más por la asociación de estos agentes antiulcerosos estándar con varios efectos secundarios no deseados. En consideración de sus diversos efectos adversos y la presencia de H. pylori
cepas resistentes a los antibióticos, la búsqueda de agentes gastroprotectores no antibióticos nuevos y seguros a partir de fuentes naturales, en particular las plantas, continúan aumentando en todo el mundo [2, 4].
Una de las plantas que se utilizan para tratar la úlcera gástrica en Malasia es Melastoma malabathricum
L. (familia Melastomaceae). Localmente conocido como el malayo 'Senduduk
', M. malabathricum
se encuentra abundantemente en isla del Océano Índico, en todo el sur y el sudeste asiático, Taiwán, China, Océano Pacífico Sur y Australia. Varias partes de la planta se usan en la medicina tradicional malayo para tratar una variedad de dolencias con las hojas, en particular, se han utilizado para tratar las úlceras gástricas entre otros [5]. Científicamente, el M. malabathricum
partes se han reportado para exhibir diversas actividades farmacológicas [5-7]. Aparte de su uso tradicional como agente antiulceroso, M. malabathricum
fue elegido en el presente estudio basado en el hecho de que es una de las hierbas medicinales famosas en el folklore malayo, pero no recibió la falta de atención en la comunidad. Por otra parte, M. malabathricum
se ha informado que contienen alto contenido de fenoles totales y de ejercer actividades anti-inflamatorias [5-7], que son importantes en los mecanismos de antiulcerosa de cualquiera de los compuestos /extractos alta antioxidante y. Es bien sabido que la úlcera gástrica, en particular los inducen por el etanol, está asociada con la generación de ROS. El etanol penetra rápidamente en la mucosa gástrica, ya que es capaz de solubilizar la mucosa de protección y provoca la liberación de radicales libres de hidroperoxi y anión superóxido. Estos radicales libres causan un aumento del estrés oxidativo en los tejidos, que a su vez, aumenta el nivel de malondialdehído, un marcador de aumento de la peroxidación de lípidos. En general, efecto deletéreo inducida por el etanol se puede manifestar directamente a través de la generación de metabolitos reactivos o indirectamente a través de otros mecanismos de activación que finalmente desencadenan daño oxidativo [7]. Por lo tanto, los extractos /compuestos con actividad antioxidantes juegan un papel muy importante en los basureros los radicales libres e inhiben la peroxidación lipídica. En lugar de esto, M. malabathricum
ha informado de ejercer una notable actividad antioxidante [7] y, por lo tanto, se cree que poseen antiulcerosa potencial. Nuestra proyección anterior de extracto de metanol de M. malabathricum
(Memm) para antiulcerosa potencial contra modelos de úlcera gástrica con etanol y inducidas por indometacina se ha informado en otras partes [8]. Memm se encontró para atenuar inducida por el etanol, pero agrava, la formación de úlcera gástrica inducida por indometacina. La capacidad de Memm para ejercer tanto la gastroprotección y actividades anti-inflamatorias [5] está en contraste con la de la indometacina, que sólo ejerce actividad anti-inflamatoria. Esta observación parece sugerir que el extracto activa gastroprotección través de un mecanismo que no está asociado a la de anti-inflamación. Además, la actividad anti-inflamatoria de Memm posiblemente podría difería de la ejercida por la indometacina. Al ser un inhibidor tanto de las COXs (es decir, COX-1 y COX-2), la indometacina es más selectivo para COX-1, que se requiere para el mantenimiento de la capa protectora de la mucosa gástrica [9]. La capacidad de Memm para intensificar la formación de úlcera gástrica inducida por indometacina sugiere que Memm también podría inhibido COX-1 de acción e interferir con la formación de PG constitutiva que ayudan a proteger la mucosa gástrica entre otros. Por otro lado, la capacidad de Memm para ejercer la actividad anti-inflamatoria podría ser debido a su capacidad para inhibir la respuesta de la COX-2-dependiente asociada con la prueba de edema de la pata de la rata inducido por carragenina [5; 9]. Aparte de eso, Memm también podría funcionar al contrario mediante la activación de la COX-2, lo que lleva a aumentar PGE 2 de síntesis, que se ha informado para ejercer la actividad anti-inflamatoria mediante la unión a uno de sus receptores, el receptor de PGE 4 (EP 4) [10]. Además, PGE 2 ha sido conocido por ser el precursor para la formación de prostaglandinas de ciclopentenona (cyPG) que ejerce anti-inflamatoria [11]. Por otra parte, la capacidad de activar la PGE 2 de síntesis, que a su vez aumenta la producción de moco gástrico, se puede producir a través de la activación de la EP 3 receptores [10]. Esto podría ayudar a explicar de nuevo la capacidad de Memm para demostrar la actividad anti-inflamatoria, mientras que, al mismo tiempo, ejercen actividad antiulcerosa contra el etanol, pero no modelo inducida por indometacina. A pesar de estas sugerencias, se ha hecho ningún intento para determinar los posibles mecanismos de protección gástrica de Memm, que podrían ser utilizados para explicar la observada actividad antiulcerosa.
Teniendo en cuenta el informe antes mencionado [8] y otros informes realizados por Hussain et al. [6], que evaluó el potencial antiulcerosa de extracto acuoso de M. malabathricum
usando sólo un modelo de úlcera gástrica (es decir, el modelo inducido por etanol), la investigación actual eran diseños. Aunque M. malabathricum
nunca se ha utilizado en el tratamiento de H. pylori
infección, que es apoyado por su pobre actividad antibacteriana [12,13], el uso tradicional de la planta para el tratamiento de la úlcera gástrica justificado la investigación de presencia con la esperanza de encontrar un agente alternativo /natural de gastroprotectores como un reemplazo para las drogas de efectos secundarios a pura disponibles actualmente utilizados en el tratamiento de segunda línea. Teniendo en cuenta este hecho, el presente estudio tuvo como objetivo investigar sobre los posibles mecanismos de protección gástrica de Memm utilizando modelos diferentes de ratas.
Métodos Químicos

Los productos químicos utilizados en este estudio son de los grados de análisis y habían sido preparados inmediatamente antes del uso. Se utilizaron los siguientes fármacos: ranitidina (Sigma Aldrich, EE.UU.), quercitrina (Sigma Aldrich, EE.UU.), etanol absoluto (Fischer Scientific, EE.UU.), N-etilmaleimida (NEM) (Sigma-Aldrich, EE.UU.), N G ésteres metílicos nitro-L-arginina (L-NAME) (Sigma-Aldrich, EE.UU.), carbenoxolona (CBX) (Sigma-Aldrich, EE.UU.) y éter dietílico (Fischer Scientific, EE.UU.). cOLECCIÓN materiales vegetales y preparación Memm de México la hojas de M. malabathricum
se recogieron entre agosto y septiembre de 2010 de Serdang, Selangor, Malasia, e identificado por un botánico del Instituto de Biociencias (SII), la Universidad Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, Malasia. Un ejemplar de muestra, ACP-0017, se ha depositado en el Herbario del SII, UPM, Malasia. Las hojas de tierra seca (40 g) se empaparon tres veces a temperatura ambiente durante 24 h con metanol en la proporción de 1:20 (w /v) y el sobrenadante de metanol se evaporó (40 ° C) a presión reducida hasta sequedad dando como resultado un rendimiento de 12,8 g se secó y el extracto de metanol pegajosa (porcentaje produjo fue ≈ 32%).
screening fitoquímico y el análisis HPLC de Memm comentario el tamizaje fitoquímico y el análisis HPLC de Memm se realizó de acuerdo con el método se informó anteriormente [ ,,,0],7]. tamizaje fitoquímico de Memm se llevó a cabo para determinar la presencia de flavonoides, triterpenos, taninos, alcaloides y saponinas de acuerdo con los protocolos convencionales como se describe below.i) Los flavonoides
Aproximadamente 10,0 g de Memm se hirvió por separado durante 2 a 3 minutos en 100 ml de agua en un baño de agua. A 3 ml del filtrado, 3 ml de ácido-alcohol (etanol: agua: ácido clorhídrico concentrado en la relación de 1: 1: 1) se añadieron, magnesio sólido (1 cm) y 1 ml de t-amil-alcohol. Las mezclas se observaron a continuación para un violar change.ii de color rosa-naranja o) triterpenos
Aproximadamente 1,0 g de Memm se extrajo por separado durante 24 h en éter. se evaporó 1 ml del filtrado a sequedad y el residuo se redisolvió en varias gotas de anhídrido acético y después varias gotas de ácido sulfúrico se añadieron a la solución. Las mezclas fueron luego observados por un change.iii de color verde) Taninos
Aproximadamente 0,2 g de Memm se hirvió por separado en 5 ml de agua. Las mezclas se enfriaron y se filtraron. Se añadieron unas cuantas gotas (3 gotas) de solución de cloruro férrico 5% al ​​filtrado y se observaron durante un formation.iv precipitado azul-negro) Alcaloides
Aproximadamente 0,5 g de Memm fue hervida por separado con 10 ml de ácido clorhídrico diluido (alcohólica) en un tubo de ensayo durante 5 minutos. Las mezclas se enfriaron y se permitió que los escombros a un acuerdo. Cada uno de los líquidos sobrenadante se filtró en otro tubo de ensayo y fue tomada en el que se añadieron tres gotas de reactivo de Dragendorff (potasio bismuto solución de yoduro), se agitó y se observó la aparición de una mancha de color rojo anaranjado y un precipitado 1 ml de cada filtrado formation.v) las saponinas
Aproximadamente 0,2 g de Memm se agitó con agua y se observó la mezcla durante una espuma persistente. México la análisis por HPLC de Memm se realizó de acuerdo con el informe anterior [4 ], pero con ligeras modificaciones. En breve, Memm (10 mg) se suspendió en 1 ml de metanol. La solución se pasó a través de un cartucho de filtro (tamaño de poro de 0,45 micras) antes del análisis. La muestra filtrada se analizó utilizando el sistema HPLC consiste en el Waters Delta 600 con 600 Controller, un fotodiodo detector de red (Waters 996). Y un Phenomenex Luna (5 micras) (Torrance, CA, EE.UU.) columna (4,6 mm de diámetro interno x 250 mm). Dos disolventes indicados como A y B se utilizaron para la elución de los constituyentes. A era ácido fórmico acuoso al 0,1% y B era acetonitrilo. Las condiciones iniciales eran 95% de A y 5% de B con un gradiente lineal de llegar a 25% de B a t = 12 min
y esta condición se mantuvo durante 8 min. B se redujo de nuevo a 15% en t =
22 min y se mantuvo a esta condición para otro 8 min (t
= 30 min). En t = 35 min
, el programa vuelve a la composición del disolvente inicial. La velocidad de flujo usada fue 1,0 ml /min y el volumen de inyección fue de 10 l. El horno de la columna se fijó en 27 ° C y el eluyente se monitorizó a 210, 254, 280, 300, 330 y 366 nm. Se analizaron los tiempos de retención, áreas de los picos y UV espectros de los picos principales. El análisis por HPLC se llevó a cabo en el Laboratorio de Fitomedicina, plantas medicinales División, Instituto de Investigación Forestal de Malasia (FRIM), Kepong, Malasia animales experimentales

ratas Sprague Dawley macho (180-200 g; 8-10. se obtuvieron semanas de edad) de la Unidad Veterinaria Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Putra Malaysia (UPM), Malasia y mantenerse a una temperatura ambiente (27 ± 2 ° C; 70-80% de humedad; 12 h de luz /oscuridad ciclo) en la Unidad Animal Holding, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, la UPM. Se suministran con comida y agua ad libitum
desde el comienzo de los experimentos. El protocolo de estudio del presente estudio fue aprobado por la Cámara de Animales y el empleo de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, UPM (La aprobación ética no: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00449). Las ratas fueron manejados de acuerdo con las directrices actuales de la UPM para el cuidado de los animales de laboratorio y las directrices éticas para las investigaciones de dolor experimental en animales conscientes [14]. Todos los experimentos se llevaron a cabo entre las 09.30 y las 18.30 h para minimizar los efectos de los cambios ambientales. El ayuno se aplicó durante 48 h antes de todos los ensayos en el que las ratas se les permitió el acceso a sólo agua.
Determinación de los posibles mecanismos de protección gástrica de Memm
píloro ulceración inducida por la ligadura del píloro
ligación se realizó de acuerdo con el método de Shay et al. [15], con ligeras modificaciones. Treinta ratas se dividieron al azar en 5 grupos (n = 6). Grupo-I (control) se trató con vehículo (DMSO al 10%), Grupo-II (control positivo, ranitidina) se administró a 100 mg /kg (po), Grupo-III, -IV y-V, las ratas se trataron con Memm (50, 250 y 500 mg /kg, respectivamente). Píloro ligación se lleva a cabo de 1 h después de la administración de los compuestos de prueba en 48 h ratas en ayunas. La ketamina HCl (100 mg /kg, intramuscular) y HCl xilazina (16 mg /kg, intramuscular) fueron utilizados para anestesiar a las ratas antes de la ligadura del píloro. Una incisión de 2 cm de largo se hizo en el abdomen, justo debajo del esternón en las ratas anestesiadas. El estómago se expuso, y un hilo se hizo pasar alrededor del esfínter pilórico y atado en un nudo apretado. Cuidado en atar el nudo de no implicar a los vasos sanguíneos en el nudo. El abdomen fue suturada, y la piel se limpió de cualquier mancha de sangre o sangrado. Los animales se sacrificaron 6 horas después de la ligadura por dislocación cervical.
Determinación del volumen, el pH, la acidez libre y total del contenido gástrico
los estómagos fueron retirados, y los contenidos se drenaron a cabo, recogieron y se centrifugaron a 2500 rpm por 10 min. El volumen y el pH del jugo gástrico se midió y fue sometido a la estimación de la acidez libre y total de acuerdo con el método descrito por Srivastava et al. [dieciséis]. acidez libre se determinó por titulación con 0,01 N de hidróxido de sodio (NaOH) con el reactivo naranja de metilo hasta que el color de la solución se volvió de color amarillento. El volumen de álcali añadido se indique lo contrario. Después, se añadieron dos a tres gotas de fenolftaleína y la solución se tituló hasta que aparezca un color rosa definitiva. El volumen total de NaOH añadido se ha indicado y esto corresponde a la acidez total. La acidez se calculó utilizando la siguiente fórmula: $$ \\ mathrm {acidez} = \\ frac {\\ mathrm {volumen} \\ kern0.5em \\ mathrm {de} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normalidad} \\ kern0.5em \\ mathrm {de} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ tiempos 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Estimación del contenido de pared mucosa gástrica
contenido de pared mucosa gástrica se determinó por el método descrito por Corne et al. [17], con ligeras modificaciones. El estómago se abrió a lo largo de la curvatura mayor, se pesó, y se sumergió en 10 ml de 0,1% Alcian azul en /acetato de sodio 0,16 M de sacarosa 0,05 M, pH 5,8 durante 2 h. El colorante excesiva se separó después por dos aclarados sucesivos en solución 0,25 M de sacarosa (15 min cada uno). El colorante restante complejado con la mucosa gástrica se extrajeron con 0,5 M MgCl 2 de 2 h y se agitó de forma intermitente durante 1 min en cada intervalo de 30 min. El extracto azul se agitó vigorosamente con un volumen igual de éter dietílico y la emulsión resultante se centrifugó a 3.600 rpm durante 10 min. La absorbancia (DO) de Alcian azul en la capa acuosa se leyó a 580 nm utilizando un espectrofotómetro. La cantidad de Alcian azul extraer por gramo estómago húmedo luego fue calculada a partir de una curva estándar.
Lesión de la mucosa gástrica inducida por etanol en L-NAME las ratas tratadas previamente
La participación de NO endógeno en la modulación de la gastroprotector inducida por etanol la actividad se determinó de acuerdo con el método de Andreo et al. [18], pero con ligeras modificaciones. Las ratas macho fueron divididos aleatoriamente en doce grupos (n = 6) y en ayunas durante 24 h pero permitió libre acceso al agua. Ellos fueron pre-tratados con solución salina o L-NAME (70 mg /kg; un inhibidor de la NO sintasa) por vía intraperitoneal (ip) y 30 min más tarde, los animales recibieron vehículo (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positivo grupo de control) o 500 mg /kg Memm (po). Una hora después de la administración de las soluciones de ensayo, la úlcera gástrica se indujo usando 5 ml /kg de etanol absoluto en todos los grupos. Por otra parte, L-arginina (200 mg /kg) se administró, 30 min después de la solución salina o L-NAME tratamiento y, seguido de 30 min más tarde por la administración de etanol. Todas las ratas se sacrificaron 1 hr más tarde por exposición a éter dietílico. El estómago se abrió a lo largo de la curvatura mayor para determinar el área de la úlcera (UA) como se describe por Balan et al. [19]. El porcentaje de protección se calculó utilizando la siguiente fórmula: $$ \\ mathrm {Protección} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {T} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {Control} \\ hbox {-} \\ mathrm {T} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {tratado} \\ \\ mathrm {grupo} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {T} \\ mathrm {a} \\ \\ mathrm {Control} \\ right)} ratas \\ tiempos 100 \\% $$ inducidas por etanol lesión de la mucosa gástrica en NEM pretratadas
Para investigar la participación de grupo sulfhidrilo (SH) en la modulación de la actividad gastroprotectora inducida por el etanol, los procedimientos descritos por Andreo et al. [18] fueron adoptadas con ligeras modificaciones. Las ratas se dividieron al azar en 12 grupos (n = 6) y en ayunas durante 24 h pero permitió libre acceso al agua. El experimento comenzó con pre-tratamiento (i.p.) de solución salina o NEM (10 mg /kg), un sulfhidrilo (SH) bloqueador. Treinta minutos después de la regimiento pre-tratamiento, las ratas se les administró (po) con vehículo (DMSO al 10%), 100 mg kg CBX (grupo control positivo) /o 500 mg /Memm kg seguido de la administración de 5 ml de etanol /kg una hora más tarde para inducir ulceración gástrica. Todos los animales se sacrificaron 1 h después de recibir el etanol por la exposición a éter dietílico. El estómago se retiró y el daño gástrico se determinó como se describe anteriormente
. El análisis bioquímico de los tejidos del estómago
Tras los análisis macroscópicos, superóxido dismutasa (SOD) [20], la catalasa (CAT) [21], la mieloperoxidasa (MPO) [22], glutatión peroxidasa (GTP) [23], glutatión reductasa (GTR) [24] y sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) se midieron [25] actividades de la enzima en los tejidos del estómago de la rata. La mucosa gástrica se raspó de la parte antral del estómago utilizando un raspador y se almacenó a 4 ° C para la estimación de bioquímica. La mucosa gástrica desechado se sometió a preparar el homogeneizado de la mucosa (pH 7,2). El homogenado se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min y se usó el sobrenadante obtenido para el análisis de tipo de los antioxidantes en etanol inducida por daño de la mucosa gástrica. En todos los ensayos de defensa antioxidante, ranitidina (100 mg /kg) Grupo -pretreated se consideró como el grupo de control positivo.
Determinación de la actividad SOD México La actividad de SOD se determinó sobre la base de la inhibición de la formación de nicotinamida adenina dinucleótido, metosulfato de fenazina y azul de tetrazolio amino formazan [20]. Aproximadamente se mezclaron 0,5 ml de homogeneizado de tejido con 0,4 ml de etanol y la mezcla de cloroformo y se centrifugó. Al sobrenadante, mezcla de ensayo (tampón de pirofosfato de sodio (0,025 M, pH 8,3), nitroazul de tetrazolio, metosulfato de fenazina y la reducción de la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH)) se añadió y se incubó a 30 ° C durante 90 s. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido acético glacial y se mezcla con n-butanol
. La intensidad del color desarrollado en butanol se midió a 560 nm. La actividad de la SOD se midió mediante el grado de inhibición de esta reacción y se expresa como milimoles /min /mg de proteína.
Determinación de la actividad CAT México La actividad de CAT se ensayó colorimétricamente a 620 nm como se describe por el método de Sinha [21]. La mezcla de reacción de 1,5 ml que contiene 1,0 ml de tampón de fosfato (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml de 2,0 M H 2O homogeneizado 2 y 1,0 ml de tejido. La reacción se detuvo mediante la adición de 2,0 ml de reactivo de ácido dicromato-acético (5% de dicromato de potasio y la mezcla de ácido acético glacial en la proporción de 1: 3). Los resultados se expresan como milimol /min /mg de proteína.
Determinación de la actividad MPO México La actividad de MPO se midió de acuerdo con el método descrito por Bradley et al. [22], pero con ligeras modificaciones. Las muestras homogeneizadas se congelaron y descongelaron tres veces y se centrifugaron a 1500 g durante 10 min a 40 ° C. Se añadieron aproximadamente 100 l del sobrenadante homogeneizado a 1,9 ml de 10 tampón de mmol /L de fosfato (pH 6,0) y 1,0 ml de 1,5 mmol /clorhidrato de LO-dianisidina que contiene 0,0005% (w /v) H 2O 2. La absorbancia se evaluó a 450 nm en un espectrofotómetro de UV y la actividad MPO en los tejidos gástricos se expresó como pmoles /min /mg de proteína.
Determinación de la actividad GTP
La actividad de GTP se midió por el método descrito por Rotruck et al. [23], con ligeras modificaciones. La mezcla de reacción, que contenía 0,2 ml de 0,4 M, Tris - HCl, pH 7,0, 0,1 ml de 10 azida de sodio mM, 0,2 ml de homogeneizado de tejido (se homogeneizó el tejido en tampón Tris-HCl 0,4, pH 7,0), 0,2 entonces ml de glutatión y 0,1 ml de peróxido de hidrógeno 0,2 mM se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. La reacción fue detenido por la adición de 0,4 ml de TCA al 10% y la sujeción al proceso de centrifugación. El sobrenadante se ensayó el contenido de glutatión mediante el uso de reactivo de Ellman (19,8 mg de 5, ácido benzoico 5'-dithiobisnitro (DTNB) en 100 ml de nitrato de sodio 0,1%). Se utilizó un coeficiente de extinción molar de 6,22 × 103 mol para determinar la actividad de GTP. La actividad enzimática se expresó como unidades internacionales de actividad enzimática /g de proteína. Las unidades internacionales se expresan como moles de hidroperóxidos transformados /min /ml de enzima.
Determinación de la actividad GTR
El nivel de GTR se determinó por el método de Ellman [24]. Approximately1.0 ml de sobrenadante se trató con 0,5 ml de reactivo de Ellman (19,8 mg de 5, ácido benzoico 5'-dithiobisnitro (DTNB) en 100 ml de nitrato de sodio 0,1%) y 3,0 ml de tampón fosfato (0,2 M, pH 8,0 ). La absorbancia se leyó a 412 nm y la actividad GTR se expresó como pmoles /min /mg de tejido.
Determinación del contenido de TBARS
El grado de LPO se midió mediante el análisis de los niveles de TBARS en la mucosa gástrica de acuerdo con la método anterior [25], pero con una modificación menor. A 0,5 ml de homogeneizado de tejido, 1,5 ml de ácido acético al 20%, 0,2 ml de SDS y 1,5 ml de TBA se han añadido. La mezcla se hizo hasta 4 ml con agua destilada y se calienta durante 1 hora a 95 ° C. Después de enfriar, se añadieron 4,0 ml de mezcla de butanol-piridina y se agitaron bien. Esta mezcla se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 min. La capa orgánica se recogió y su absorbancia se leyó a 532 nm y los resultados se expresaron como n mol /g proteína.
Estimación de proteína
El contenido de proteína en el tejido gástrico se estimó de acuerdo con el método de Lowry et Alabama. [26], pero con ligeras modificaciones. La muestra de tejido y los estándares (1,0 mg /ml de albúmina de suero bovino en agua bidestilada) en diferentes tubos fueron tratados con 5,0 ml de mezcla de reactivos (48% de tartrato de sodio y potasio, 2% de sulfato de cobre y carbonato de sodio 3% en 01:48 (v /v)). Entonces reactivo de fenol de Folin (1: 2) se añadió a la mezcla de reacción y se dejó reposar durante 30 min a temperatura ambiente. La densidad óptica se leyó a 710 nm utilizando agua como blanco de reactivo. Actividad anti-inflamatoria
in vitro de Memm
in vitro efecto de Memm en el óxido nítrico
Cultivo de células y estimulación Francia El RAW 264.7 línea de células (macrófagos monocitos murinos) (Colección Europea de cultivos celulares, Porton Down, Reino Unido) se mantuvo en DMEM suplementado con 10% de FBS, 4,5 g /L de glucosa, L-glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM), penicilina (50 U /ml) y estreptomicina (50 mg /ml) y 5% de CO 2 a 37 ° C. Las células (4 × 10 5 células /pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 2 horas a 37 ° C en un CO 2 incubadora para permitir la unión de las células y, a continuación disparado con estímulos (100 u /ml de IFN-g y 5 g /ml de LPS) con o sin la presencia de Memm en la concentración que oscila entre 12,5 a 100 mg /ml. DMSO (vehículo) se utilizó para disolver el Memm. La concentración final de DMSO fue asegurada a ser 0,1% en todas las culturas. Las células se incubaron a continuación durante 17-20 horas a 37 ° C en un CO 2 incubadora. El NO determinación se llevó a cabo sometiendo el sobrenadante del cultivo contra el ensayo de Griess y se pusieron a prueba las células que quedan en el pozo para el ensayo de viabilidad celular
determinación de nitrito
La concentración de nitrito (NO 2 . - ), un metabolito estable de NO en medio de cultivo, se determinó utilizando el ensayo de Griess [27]. Un volumen igual de reactivo de Griess se mezcló con el sobrenadante del cultivo y el desarrollo del color se midió a 550 nm. Se determinó la cantidad de nitritos en el sobrenadante de cultivo basado en la curva estándar de un nitrito sódico (0-100 mM) recién preparada en agua desionizada. Porcentaje de la NO inhibición se calculó utilizando la fórmula siguiente: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ dónde;
* El control es el nivel de nitrito de IFN-γ /inducida por LPS grupo
viabilidad de las células Francia El citotoxicidad de Memm en las células cultivadas se determinó analizando la reducción de 3. - (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) [27]. Los reactivos MTT (0,05 mg /ml) se suspendieron en PBS estéril, pH 7,0 y después se añadió en cada pocillo después de la separación del sobrenadante. Esto fue seguido por la incubación de las células restantes a 37 ° C durante 4 h, seguido de la adición de 100 l de 100% de DMSO en los pocillos para disolver las sales de formazán formados. La absorbancia se midió a 570 nm. El porcentaje de viabilidad celular se calculó según la siguiente fórmula: $$ \\ mathrm {célula} \\ \\ mathrm {viabilidad} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {Control}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {muestra}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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