Genomvid antal genkopior och expressionsanalys av primära gastriska tumörer och magcancer cell lines

Genomvid antal genkopior och expressionsanalys av primära gastriska tumörer och magcancer cellinjer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Gastric cancer är en av de vanligaste maligniteter över hela världen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död. Genkopietalet förändringar spelar en viktig roll i utvecklingen av magcancer och en förändring i genkopietal är en av de viktigaste mekanismerna för en cancercell att kontrollera uttrycket av potentiella onkogener och tumörsuppressorgener.
Metoder
för att belysa gener av potentiella biologiska och kliniska relevansen i magcancer, genomförde vi en systematisk array-baserad undersökning av genuttryck och kopienummer nivåer i primära gastriska tumörer och magcancer cellinjer och validerade resultaten med en affinitetsinfångnings baserad avskrift analys ( TRAC-analys) och i realtid QRT-PCR.
Resultat
Integrerad microarray analys avslöjade sammanlagt 256 gener som var belägna i återkommande områden i vinster eller förluster och hade åtminstone en två-faldig kopia nummer- associerad förändring i deras genexpression. De uttrycksnivåer av 13 av dessa gener, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, erbB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
PNMT
, PTPRA
och OSMR
, validerades i totalt 118 gastric prover med antingen QRT-PCR eller TRAC-analys. Alla dessa 13 gener uttrycks differentiellt mellan cancerprover och icke-maligna vävnader (p < 0,05) och sambandet mellan kopietal och genuttryck förändringar var validerade för nio (69,2%) av dessa gener (p < 0,05).
Sammanfattning
Sammanfattningsvis integrerad genuttryck och antalet exemplar microarray analys markerade gener som kan vara av avgörande betydelse för gastric cancer. TRAC och QRT-PCR-analyser valideras microarray resultat och därmed rollen av dessa gener som potentiella biomarkörer för magcancer.
Bakgrund
På grund av bristen på tidiga symtom magcancer kännetecknas av scenen diagnos sent och otillfredsställande alternativ för kurativ behandling [1, 2]. Trots nedgången i dess förekomst under de senaste decennierna, förblir magcancer den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i världen [3]. Ungefär 90% av alla gastric cancer är adenocarcinom härrör från epitel [4]. Enligt Laurens klassificerings gastric cancer är indelade i två huvud histologiska subtyper, intestinala och diffusa [5].
Gastric adenokarcinom, liksom många andra solida tumörer av epitelialt ursprung, är ofta komplexa i termer av kromosomala integritet [6, 7]. Maligna gastriska tumörer är kända för att bära flera avvikelser i deras arvsmassa och sådana kromosomförändringar är av avgörande betydelse för aktivering och inaktivering av cancerrelaterade gener [8-17]. Genkopietalet förändring är en av de viktigaste mekanismerna för en cancercell för att kontrollera uttrycket av gener avgörande för cellöverlevnad och cancer progression [17-22]. Dessa kopietal förändringar innebär ofta en stor grupp av gener lokaliserade nära varandra på samma kromosom. Till exempel; i magcancer det ofta förstärkta 17q12-Q21 region innehåller gener som ErbB2
, GRB7
, JUP
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
och TOP2A
[14, 17, 23]. Men bara en minoritet av dessa gener kommer sannolikt att vara den sanna cancer drivrutins gener som bidrar till tumörbildning, medan andra kan förstärkas enbart på grund av deras kromosomala närhet med förstärknings målgener [24, 25]. Ett tillvägagångssätt för att särskilja sådana förar gener från passagerar mutationer är att integrera genomomfattande kopietal och expressionsdata, vilket möjliggör identifiering av gener vars transkriptionsaktivering eller repression är associerad med ett kopietal förändring i en cancercell. Genom att kombinera information från högupplösta antal genkopior och uttrycks mikroarrayer, är det möjligt att inte bara definiera brytpunkter av kopietal förändringar i detalj, men också för att bedöma den funktionella betydelsen av dessa förändringar och därför möjligen identifiera gener som driver cancer uppkomsten och utvecklingen.
att belysa gener potential som biomarkörer eller kliniska mål i magcancer, genomförde vi en systematisk hög upplösning array-baserad undersökning av kopietal och genuttryck nivåer i magcancer vävnader och cellinjer. Vår tidigare array-baserad analys visade att kopietal vinster och förluster på hundratals gener är associerade med en samtidig ökning eller minskning av genuttryck [17]. I den aktuella studien har vi ökat upplösningen av kopietalet analys över 20 gånger mer exakt visualisera brytpunkter av antalet kopior förändringar. Dessutom har vi genomfört en transkriptions analys av gener som ligger i förändrade kromosomregioner för att identifiera gener vars avreglering är förknippad med den maligna fenotypen.
Metoder
magcancer vävnader och cellinjer
Forskningsprojektet har granskats och godkänts av etiska kommittén vid institutionen för medicinsk genetik och kirurgi och godkänts av den kliniska Review Board av HUCS. Gastric vävnadsprover prospektivt in från patienter som genomgick magoperationer eller gastroskopi i Helsingfors universitetscentralsjukhus mellan 1999 och 2007. Informerat samtycke erhölls från varje deltagande patient. Tretton fryst primära magcancer vävnader och sju gastric cancercellinjer valdes för microarray analys (tabell 1). Servettmaterialet bestod av två olika histologiska subtyper, intestinal (n = 9) och diffus (n = 4) och tumörerna var belägna i två olika områden av magen, corpus (n = 8) och antrum (n = 5 ). Sammanlagt 111 gastric vävnader och 7 gastric cancercellinjer ingick i QRT-PCR och affinitetsinfångnings baserad avskrift analys (TRAC) analyser (Ytterligare fil 1: Kliniska parametrar). Vävnadsprover bestod av 43 icke-malign och 68 cancer mag vävnader och båda histologiska subtyper av magcancer var företrädda (intestinala, n = 42, diffus, n = 25, en av okänd histologi). Gastriska vävnadsprover lagrades vid -80 ° C. Att kontrollera tumör procent och histologi av proverna var frysta prover inbäddade i Tissue-Tek oktober förening (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) och 5 pm frusna is sektioner framställdes och färgades med användning av trypanblått. Histologi för magcancer prover utvärderades av en erfaren patolog (M.-L. K.-L.). Tissue-Tek avlägsnades från vävnaderna före nukleinsyrasekvenser extractions.Table 1 kliniska parametrar för de analyserade proverna på array jämförande genomisk hybridisering (aCGH) och uttrycks microarrays Primär.
mag- tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Gastric cancercellinjer
Ålder /kön
histologi
Ursprung
AGS
54 /F
Adeno-carcinoma
primärtumör
KATOIII
55 /M
Diffus
Pleurautgjutning
MKN-1
72 /M
Adeno-squamous carcinoma
Lymfkörtel metastaser
MKN-7
39 /M
Intestinal
Lymfkörtel metastaser
MKN-28
70 /F
Intestinal
Lymfkörtel metastaser
MKN-45
62 /F
Diffusa
levermetastaser
TMK-1
21 /M
Diffusa
Lymfkörtel metastas
AGS och KATOIII cellinjer erhölls från American Type Culture CoUection (Rockville, MD, USA) och MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, och TMK-1-cellinjer var en slags gåva från Hiroshi Yokozaki, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, Japan [26]. AGS-celler odlades i Kaighn F12-medium (2 mM glutamin, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-streptomycin), KATOIII celler i IMDM-medium (2 mM glutamin, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-streptomycin) och alla andra cellinjer i RPMI-1640-medium (10% FCS, 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin-streptomycin). Alla celler odlades vid 37 ° C och 5% CO 2.
RNA och DNA-extraktion
Före RNA- och DNA-extraktioner, den frysta vävnaden nedsänktes i RNAlater-ICE-reagens (Ambion, Austin, TX , USA) och lagrades vid -80 ° C under 16 timmar för att stabilisera RNA. Hälften av vävnadsprov (~ 25 mg) homogeniserades i RLT-β-merkaptoetanol lysbuffert (RNeasy mini-kit, Qiagen Inc., Hilden, Tyskland) och den andra hälften i ATL-buffert (DNeasy blod och vävnad Kit, Qiagen) med hjälp av Ultra-Turrax-homogenisator (IKA Works, Wilmington, NC, USA). RNA extraherades med användning av RNeasy mini-kit, inklusive den valfria DNas behandling, och DNA med användning av DNeasy Blod och vävnads Kit. För gastric cancercellinjer, 1 x 10 7-celler lyserades med hjälp av en spruta och nål i antingen RLT-β-merkaptoetanol lysbuffert eller ATL-buffert före RNA och DNA-extraktioner, respektive. RNA och DNA-koncentrationer mättes med hjälp av NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) och RNA kvalitet utvärderades med hjälp av Agilents 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Endast RNA som visar tydliga 18S och 28S ribosomala toppar i Bioanalyzer analys och 260/280 förhållanden över 2,0 godtogs för ytterligare analys.
Array CGH och genuttryck microarray analyser
Tretton gastric tumörer och sju gastric cancercellinjer analyserades på 244K Human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Tre av tumörerna och alla de sju cellinjer analyserades också med hjälp av 44K Hela Human Genome genuttryck oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (Figur 1). De genomsnittliga 260/280-förhållanden för dessa prover var 2,1 för RNA och 1,8 för DNA, och alla av de RNA-prover hade klara 18S och 28S ribosomala toppar i Bioanalyzer analys indikerar god kvalitet (data ej visade). Array CGH experiment utfördes med användning av Human Genome CGH microarray 244a kit (Agilent Technologies). Märkning och hybridisering utfördes enligt Agilent protokoll (v5.0, juni 2007). I korthet, 1,5 pg av prov-DNA och 1,5 ^ g av kön-matchade referens DNA (humant genomiskt DNA, Promega, Madison, WI, USA) var dubbeldigererades med Alul
och Rsal
restriktionsenzymer (Promega). Det digererade DNA märktes med användning av Agilent Iskt DNA Labeling Kit Plus. DNA-provet märktes med Cy5-dUTP och referens DNA med Cy3-dUTP, respektive. Märkt DNA renades med Microcon YM-30 filter (Millipore, Billerica, MA, USA). Följande renings, prov- och referens DNA poolades och hybridiserades till arrayen med 50 ^ g av humant Cot-1-DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vid 65 ° C, 20 rpm under 40 timmar. Hybridisering utfördes med Agilent Oligo aCGH hybridisering Kit. Före skanning, tvättades objektglasen enligt protokollet. Förutom de prov-DNA-hybridiseringar beskrivits ovan hänvisades manligt DNA (Cy3) hybridiserad mot referens kvinnliga DNA (Cy5) enligt samma protokoll som ska användas som en referensuppsättning i aCGH dataanalys. Figur 1 Flödesschema som beskriver olika steg av studien.
Genuttryck experiment utfördes med hela Human Genome Oligo microarray kit (Agilent Technologies), märkning och hybridisering enligt Agilent protokollet (v5.7, mars 2008). I korthet, 2 | j, g av total RNA-prov och referens-RNA (en pool av 10 cancercellinjer, icke-gastrisk, ATCC, Manassas, MA, USA) märktes med användning av Agilent Quick Amp Labeling Kit. Prov-RNA märktes med Cy5-dCTP och referens DNA med Cy3-dCTP, respektive. Märkt RNA renades därefter med användning av RNeasy mini spinnkolonner (Qiagen). Hybridisering utfördes med Agilent Gene Expression hybridisering Kit och prover hybridiserades vid 65 ° C, 10 rpm under 17 timmar och tvättades enligt protokollet före scanning. Både aCGH och genuttryck microarray slides avsöktes med hjälp av DNA microarray Scanner (Agilent Technologies) och analyserades med Feature Extraction Software (v9.5.1.1.).
Högupplöst antal kopior profilering
Alla kopietal data finns på http: //www. cangem org (accessionsnummer: CG-EXP-49). [27]. Agilents CGH Analytics programvara (v3.5.14) tillämpades för att identifiera antalet kopior ändras. Microarray data kvalitet filtreras med hjälp av avvikare information från feature extraction analysen. Probes flaggade som extremvärden togs bort från vidare analys. Dessutom har följande aberration filter tillämpas: minsta antal prober i region = 3, minsta absoluta log 2-förhållande för regionen = 0,27, och maximalt antal avvikande regioner = 1000. log 2 förhållande av 0,27 motsvarar en 1,2-faldig förändring av kopieantalet. I CGH Analytics, var varje aCGH förhållande först omvandlas till en logg 2 förhållande följt av en Z-normalisering. Den manliga vs. kvinnliga referensuppsättning användes som en kalibrerings array i dataanalysen. På grund av könsskillnader mellan grupperna som kan orsaka bias i analysen var kromosomer X och Y undantas från kalibreringen. ADM-2-algoritmen med en tröskelnivå av 12,0 användes för att identifiera genen kopietal förändringar i enskilda prover och cellinjer. Minimala gemensamma områden av förändringar i de 20 proverna beräknades, inklusive storlek och kromosomala position förändringen i baspar. En avvikelse definierades som återkommande, om det var närvarande i åtminstone 25% av proverna (Tabell 2) .table 2 Minimala gemensamma områden av återkommande (≥25%) antalet exemplar förändringar.
Ändring
Vävnader (n = 13)
Cellinjer (n = 7)
Frekvens

storlek (MB)
Position (Mb)
Möjliga målgener
+ 1q41-q43.1 2
3
25 %
17,30
216,31-233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1 1
4
25%
19,41
30,18-49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1 4
3
35%
4,60
97,33-101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3
3 2
25%
19,8
126,45-146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3
6
3
45%
2,23
143,59-145,82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0
5
25%
1,05
22,89-23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1
3
3
30%
0,28
35,02-35,30
erbB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2 2
3
25%
13,65
50,45-64,10
AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter 4
3
35%
29,36
33,89-63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57,94
0,04-57,98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-p21 0,1
3 4
35%
27,81 1,05-28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2
3
5
40%
26,11
39,48-65,59
SMAD7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter 2
5
35%
3,69
70,95-74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1
3
3
30%
4,07
14,37-19,44
HSPA13
-Xq28
4 1
25%
1,21
152.24- 153,45 Omdömen -
Antal fall är storleken på de minimala gemensamma områdena (Mb), och det kromosomala läget för förändring (Mb) anges liksom eventuella målgener. CNV regioner visas inte i tabellen. . Kopietal vinst (+), antal kopior förlust (-) Review Gene expression microarray analys | Allt genuttryck data finns tillgängliga på http: //www cangem org (accessionsnummer: CG-EXP.. -49) [27]. Microarray resultat kvalitet filtreras med hjälp av extremvärden som definieras av Feature Extraction Software och normaliseras i enlighet med löss metoden, som ingick i programpaketet. Genuttryck analysen begränsades till gener belägna i de kromosomala regioner med återkommande avvikelser (tabell 2). Målet med denna metod var att belysa genuttryck förändringar som är förknippade med förändringar i genkopietal, och kan därför utgöra potentiella onkogener eller tumörsuppressorgener med en funktionell roll i cancer. Först en median log10 uttrycksförhållandet beräknas för alla sonderna med inriktning på samma gen. Då, i två separata analyser för vinster och förluster, var medianexpressionsnivån av varje gen jämföras mellan prover med kopietal vinst /förlust och prover med normal kopieantal för att utvärdera effekten av kopietal förändringar på genuttryck. Genuttryck vika förändringar (FC) beräknades antingen genom att dividera median uttryck av cancerprover av median uttryck för icke-maligna prov eller genom att dela median uttryck av cancerprover med kopietal förändringar (G1) av median uttryck av cancerprover med normal kopietal (G0). Åtminstone en två-faldig kopietal associerad förändring i genexpression ansågs signifikant. Baserat på dessa data, 13 gener ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, erbB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
PNMT
och PTPRA
, valdes valideras ytterligare med QRT-PCR-analys och TRAC (utskrift analys med hjälp av affinitetsinfångning) analys. Resultaten från den integrerade microarray analys jämfördes med tre tidigare publicerade studier som systematiskt integrerar genomet hela kopietal och genexpressionsdata [15-17].
Realtid QRT-PCR-analys
realtid qRT- PCR utfördes under 2 gener, ALPK2
(18q21.31-q21.32) och HHIPL2
(1q41). Uttrycksnivåerna uppmättes i 82 gastriska vävnader (46 cancer och 36 icke-maligna vävnader) och 7 gastric cancercellinjer (Ytterligare fil 1: kliniska parametrar). 1 | j, g av totalt RNA omvandlades till cDNA med användning av Moloney-murint leukemivirus omvänt transkriptas (Promega, Madison, WI, USA) och slumpmässiga primrar (Invitrogen) i en volym av 50 | al under 1 h vid 37 ° C. Reaktionen var värmeinaktiverat (95 ° C, 3 min) och fylldes till en slutlig volym av 200 | il med molekylärbiologisk kvalitet vatten. Transkripten kvantifierades med användning av de analyser-on-DemandTM genen expressionsprodukter (Hs01085414_m1 för ALPK2
och Hs00226924_m1 för HHIPL2
) enligt tillverkarens protokoll (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alla primers belägna på exon-exon gränser. I korthet 2 pl cDNA mall blandas med 1,25 pl specifika primers och prober märkta med FAM-reportern färgämne. 12,5 | il av TaqMan ® Universal PCR Mastermix och RNas-fritt vatten tillsattes till en total volym av 25 | il. Human 18S rRNA fungerade som en endogen kontroll för att normalisera uttrycksnivåer i den efterföljande kvantitativ analys. 18S Sonden märktes med VIC-reporter färgämne för att tillåta multiplex PCR med målgener. PCR-betingelserna var som följer: 50 ° C under 2 min, 95 ° C under 10 min, följt av 40 cykler av 95 ° C under 15 s och 60 ° C under 1 min. Varje prov mättes i tre exemplar och data analyserades med delta-delta-metoden för att jämföra relativa uttrycksresultat (2 - [Ct prov Ct kontroll]) katalog TRAC analys
avskrift analys med hjälp av. affinitetsinfångning (TRAC) analys [28] genomfördes för 11 olika gener i 88 gastriska vävnader (53 cancer och 35 icke-maligna vävnader) och 7 gastric cancercellinjer (Ytterligare fil 1: kliniska parametrar). Generna som ingår i analysen var ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1), CYP3A4
(7q21.1) ASAP1
(8q24.1-q24.2) LTB4R
(14q11.2-Q12), PERLD1
(17q12), erbB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-Q13 0,2), PTPRA
(20p13), och MMP9
(20q11.2-q13.1). Fördelen med den TRAC-analysen är att de expressionsnivåer av multipla gener kan mätas samtidigt från ett enda prov således minska mängden av prov-RNA krävs för analysen. Detta är speciellt viktigt för analys av ofta knappa kliniska vävnadsprover.
TRAC analys utfördes vid PlexPress (Helsingfors, Finland). Custom TRACPackTM reagens för mRNA (PlexPress) användes i analysen. I korthet, 90 pl av Hybridization Mix (innehållande märkta genspecifika detekteringssonder och biotinylerade oligo-dT sonder) per brunn dispenserades till en 96-brunnars PCR-platta. Två mikrogram av RNA-prov applicerades till varje brunn i en 100 | il total reaktionsvolym. En lika stor mängd (30 amol /reaktion) av enkelsträngad 62-mer syntetisk oligonukleotid hybridisering kontroll, innefattande en poly-A-svansen, sattes till varje prov före hybridisering. Hybridisering utfördes vid 60 ° C, 650 varv per minut under 120 minuter (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Efter hybridisering affinitetsinfångning, rening, och eluering gjordes med hjälp av Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vanda, Finland) magnetiska partiklar processor. Streptavidin-kopplade magnetiska TRACPACK ™ -kulor (50 | j, g, PlexPress) tillsattes till hybridiseringsblandningen och tilläts binda till den biotinylerade mRNA-prob-oligo (dT) -hybrids under 30 minuter, varefter pärlorna tvättades 5 gånger med användning av tvätt buffert för att avlägsna eventuellt obundet material. Märkt RNA-specifika prober eluerades med elueringsbuffert och detekteras genom kapillär elektrofores, med användning av ABI3100 sequencer (Applied Biosystems, Cheshire, UK). Data analyserades med hjälp av TRACParser programvara (PlexPress).
Statistisk analys av QRT-PCR uppgifter Review, en nonparametric Mann-Whitney test för två oberoende prover för att bestämma den statistiska signifikansen av skillnader i relativa mRNA-expression nivåer ALPK2 Mössor och HHIPL2
i icke-maligna och cancer gastric prover samt i magcancer prover av olika histologiska subtyper eller TNM-stadier. Ett p-värde < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant (SPSS 17,0). Dessutom, i två separata analyser för vinster och förluster, var expressionsnivåerna i cancerprover med kopietal vinster eller förluster (G1) jämfört med cancerprover med normal antalet kopior (G0) för att utvärdera sambandet mellan antalet kopior och genuttryck. Kopietal data fanns tillgängliga för 37 av de gastriska prover som ingår i QRT-PCR-analys (Ytterligare fil 1: Kliniska parametrar). Genuttryck vika förändringar beräknades genom att dividera den genomsnittliga uttrycket av en grupp (t.ex. cancerprov) genom betyda expression av den andra gruppen (t.ex. icke-maligna prov).
Statistisk analys av TRAC analysdata Review, en syntetisk hybridisering kontroll användes i data normalisering för att avlägsna eventuell icke-biologisk variation i data. För varje mål, signalnivåer i förhållande till den interna hybridisering kontrollen beräknades. För de nio vävnadsprover som analyserats i replikera innebära signalintensitet användes. En icke-parametriska Mann-Whitney test för två oberoende prover för att bestämma den statistiska signifikansen av skillnader i de relativa mRNA-expressionsnivåer ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, erbB2, LTB4R
MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
och PTPRA
i icke-maligna och cancer gastric prover samt i magcancer prover av olika histologiska subtyper eller TNM-stadier. Ett p-värde < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant (SPSS 17,0). Jämförelsen av gen-expressionsnivåer i prover med och utan kopietal förändringar utfördes såsom beskrevs tidigare för QRT-PCR-analys. . Kopietal uppgifter finns tillgängliga för 43 magcancer provexemplar som ingår i TRAC analysanalysen
Resultat
genkopietalet avvikelser | Allt genkopietalet förändringar i individuella prov visas i tilläggsfilen 2: Kopiera nummer förändringar detekteras genom aCGH analys. Minimala gemensamma områden av återkommande (≥25%) förändringar samt deras storlek, frekvens, möjliga målgener och kromosomala läge i baspar visas i tabell 2. Den återkommande fick regioner var belägna vid 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), och 20p13-qter (40%). De återkommande borttagna regioner var belägna vid 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), och Xq28 (25%). Alla återkommande kopieringstal förändringar kunde detekteras både i primära gastric cancer och magcancer cellinjer, med undantag för 14q11.2, som ändrades endast i fem cellinjer.
Kopiera antal associerade genuttryck förändringar
Sammanlagt 256 enskilda gener (10% av alla gener som finns i de återkommande kromosomala regioner med kopietal förändringar) visade åtminstone en två-faldig kopieantal associerad förändring i sitt uttryck (intervall 2,0-34,6, median 3,8) (Ytterligare fil 3: Kopiera antal associerade gen uttryck förändringar). 226 av dessa gener överuttryckt och ligger i återkommande regioner kopietal vinster, medan 30 gener underexpressed och ligger i återkommande regioner kopieantal förluster. Faldig förändring i genexpression beräknades genom att jämföra uttrycksnivåerna av prover med kopietal förändringar till prover med normalt kopietal i en given gen. Därför hänvisar en positiv faldig förändring till ett antal kopior vinst relaterad ökning av genuttryck, medan en negativ faldig förändring avser ett antal kopior förlust relaterad minskning i genuttryck.
HHIPL2
(HHIP liknande 2) genen, förstärks i 1q41-q43.1 regionen uppvisade den högsta antal kopior vinst tillhörande uttryck i magcancer enligt den integrerade microarray analys (FC = 26,9). I allmänhet, den högsta genuttryck vika förändringar mellan cancerprover med och utan kopietal vinster upptäcktes vid 19q regionen sedan ut av de 40 generna visar > 5-faldig kopietal tillhörande förändringar i deras uttryck, 19 (47,5%) var belägna i 19q region (Ytterligare fil 3: Kopiera antal associerade genuttryck förändringar). Den mest underexpressed genen i de återkommande regionerna kopietal förluster var ALPK2
(alfa-kinas 2) (FC = -34,6) belägen vid 18q12.3-q22.2.
Tidigare tre studier av oss och andra har publicerats som systematiskt integrera genomomfattande kopietal och genuttryck data för att identifiera gener vars uttryck har förändrats på grund av ett antal kopior förändring i magcancer [15-17]. Jämförelsen mellan de överlappande gener mellan dessa studier och den aktuella studien visade 20 gener TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), MTAP
(9q21 0,3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), erbB2
(17q12-Q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2), och TUBB1
(20q13.32) som antingen vunnit och överuttryckt eller tas bort och underexpressed i vår studie och i åtminstone en av de tidigare publicerade studier. Tidigare publicerade data tillsammans med de aktuella resultaten ger ytterligare bevis för den biologiska rollen av dessa gener i magcancer.
Validering av potentiella magcancer målgener
realtid QRT-PCR-analys visade att uttrycket av HHIPL2
var 7,4 gånger högre i magcancer prover jämfört med de icke-maligna gastric vävnader (p < 0,05). Dessutom var det överuttryck av HHILP2
signifikant associerade med kopietal förstärkning (p < 0,05) som ett uttryck för HHIPL2
var 17,4 gånger högre i cancerprover med kopietalet förstärkningen hos HHIPL2
(g1 ) än i cancerprover med normal kopietal av denna gen (G0) (tabellerna 3 och 4). Enligt QRT-PCR-analys fanns en 2,9-faldig underuttryck av ALPK2
i magcancer med kopietal förluster (G1) jämfört med gastric cancer med normal kopia antal ALPK2
(G0) (p < 0,05 ). Emellertid överraskande uttrycket av ALPK2
i gastric cancer i allmänhet var 1,9 gånger högre (p < 0,05) än i de icke-maligna gastriska vävnader (tabell 3 och 4). Histologisk undertyp eller TNM-stadium hade inte någon statistiskt signifikant effekt på expressionen av HHIPL2
eller ALPK2
(tabell 3) .table 3 Resultat från det icke-parametriska Mann-Whitney test för QRT-PCR och TRAC dataanalys (SPSS17.0).
Gene
Kromosom
cancer vs. icke-malign
tarm vs. diffus
g1 vs. G0
M0 vs. M1
T1-2 vs. T3-4

N0 vs. N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0,05
p
= 0,104
p Hotel <
0,05 p
= 0,451
p
=
0,072 p
= 0,378
ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0,001
p
=
0,319 p
= 0,396
p
=
0,208 p
= 0,232
p
= 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0,001
p
= 0,061
p
= 0,254
p
= 0,543
p
=
0,197 p
= 0,253
CYP3A4

• Prognostisk betydelse för neutrofila lymfocyter förhållande och blodplättar lymfocyter förhållande hos patienter med avancerad magsäckscancer behandlas med FOLFOX kemoterapi
• En ny metod, upptäcker digital genom scanning KRAS genamplifiering i gastric cancer: inblandning av överuttryckt vildtyp KRAS i nedströms signalering och cancercelltillväxt