Генома числа копий гена и экспрессии анализ первичных опухолей желудка и желудочных линий раковых клеток

Генома числа копий гена и экспрессии анализ первичных опухолей желудка и линий рака желудка клеток
Аннотация
фон
рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний во всем мире и второй наиболее распространенной причиной рака, связанных смерти. копий генов, количество изменений, играют важную роль в развитии рака желудка и изменение гена числа копий является одним из основных механизмов раковой клетки для контроля экспрессии потенциальных онкогенов и генов-супрессоров опухолей.
методы
Для того, чтобы выделить гены потенциальной биологической и клинической значимости при раке желудка, мы провели систематический обзор массива на основе генной экспрессии и копировать уровни число в первичных опухоли желудка и желудочных линий раковых клеток и подтвердила результаты с использованием анализа транскриптов на основе захвата сродства ( Trac анализ) и в режиме реального времени QRT-PCR.
Результаты
Комплексный анализ микрочипов выявлено в общей сложности 256 генов, которые были расположены в повторяющихся регионах прибылей или убытков и, по крайней мере, в 2 раза копию number- связанные с ним изменения в их экспрессии генов. Уровни экспрессии 13 из этих генов, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, ERBB2
, HHIPL2
, LTB4R
, ММР9
, PERLD1
, PNMT
, PTPRA
и OSMR
, были подтверждены в общей сложности 118 образцов желудочного с использованием либо QRT-PCR или TRAC анализа. Все эти 13 генов были дифференцированно выражены между раковыми образцами и доброкачественных тканей (р &л; 0,05), а также связь между числом копий и экспрессии генов изменений была подтверждена в течение девяти (69,2%) этих генов (р &л; 0,05).
вывод изображения В заключение, интегрированный экспрессии генов и анализ микрочипов числа копий генов выделены, которые могут быть критически важными для рака желудка. ПРОФ и QRT-PCR анализ подтвердила результаты микрочипов и поэтому роль этих генов в качестве потенциальных биомаркеров рака желудка.
Фона
Из-за отсутствия ранних симптомов аденокарциномы желудка характеризуется поздней диагностики стадии и неудовлетворительных вариантов лечебная терапия [1, 2]. Несмотря на снижение его заболеваемости в последние несколько десятилетий, рак желудка остается второй наиболее распространенной причиной смертности от онкологических заболеваний во всем мире [3]. Примерно 90% всех видов рака желудка являются аденокарциномы, возникающие из эпителия [4]. Согласно классификации рака желудка Лорена разделены на два основных гистологических подтипов, кишечных и диффузные [5].
Желудочной аденокарциномы, как и многие другие солидных опухолей эпителиального происхождения, часто являются сложными с точки зрения целостности хромосомной [6, 7]. Злокачественные опухоли желудка, как известно, несут несколько аберраций в их геноме и такие хромосомные изменения имеют решающее значение для активации и инактивации связанных с раком генов [8-17]. Генная изменение числа копий является одним из основных механизмов раковой клетки, чтобы контролировать экспрессию генов, решающее значение для клеточной выживаемости и рака прогрессии [17-22]. Эти цифровые копии изменения часто включают большую группу генов, расположенных близко друг от друга в той же самой хромосоме. Например; в желудочном раковых заболеваний часто усиливается область 17q12-q21 содержит гены, такие как ERBB2
, GRB7
, Юп
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
и top2a <бр> [14, 17, 23]. Тем не менее, лишь немногие из этих генов, вероятно, будут истинные гены рака драйверов, способствующих онкогенеза, в то время как другие могут быть усилено просто из-за их близости с хромосомной мишени амплификации генов [24, 25]. Один из подходов, чтобы отличить такие гены водителя от пассажирских мутаций заключается в интеграции генома число копий и данных выражений, который позволяет идентифицировать гены, чья активация транскрипции или репрессии связано с изменением числа копий в раковых клетках. Таким образом, путем объединения информации из генов число копий и экспрессии микрочипов с высоким разрешением, можно не только определить контрольные точки числовых изменений копии в мельчайших подробностях, но и оценить функциональное значение этих изменений, и поэтому, возможно, идентифицировать гены, которые управляют рак возникновения и прогрессирования.
Чтобы выделить гены потенциальных в качестве биомаркеров или клинических целей при раке желудка, мы провели систематический высокого разрешения на основе массивов обзор числа копий и экспрессии генов уровней в желудочном раковых тканях и клеточных линиях. Наш предыдущий массив на основе анализ показал, что копия получает номер и потери сотен генов связаны с одновременным увеличением или уменьшением экспрессии гена [17]. В настоящем исследовании мы увеличили разрешение анализа числа копий более 20 раз, чтобы более точно визуализировать изломов числа копий изменений. Кроме того, мы провели транскрипционный анализ генов, расположенных в измененных участках хромосом, чтобы идентифицировать гены, дерегуляция связана с злокачественного фенотипа.
Методы
желудочной раковых тканей и клеточных линий
Этот исследовательский проект был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике отделения медицинской генетики и хирургии и утвержденные Clinical советом по рассмотрению Хельсинской Центральной университетской больницы. Образцы тканей желудка были собраны перспективно пациентов, перенесших операции на желудке или гастроскопию в Центральном госпитале Хельсинкского университета в период с 1999 по 2007 год было получено информированное согласие от каждого пациента, участвующего. Тринадцать свежемороженая первичные желудочные раковые ткани и семь желудочные клеточные линии рака предстательной были выбраны для микрочипов анализа (таблица 1). Материал ткани состоял из двух различных гистологических подтипов, кишечная (n = 9) и диффузный (п = 4), а опухоли были расположены на двух разных участках желудка, корпус (n = 8) и Антрум (п = 5 ). В общей сложности 111 желудочных тканей и 7 желудочные клеточные линии рака были включены в QRT-ПЦР и анализ захвата сродством на основе транскрипт (TRAC) анализирует (дополнительный файл 1: Клинические параметры). Образцы ткани состояли из 43 доброкачественные и 68 раковых тканей желудка и были представлены как гистологических подтипов рака желудка (кишечные, п = 42; диффузный, п = 25; один из неизвестных гистологии). Образцы Желудочные ткани хранили при -80 ° С. Для того, чтобы проверить, процент опухоли и гистологию образцов, замороженные образцы были вмонтированы в Tissue-Tek ОСТ соединение (Sakura Finetek, Торранс, штат Калифорния, США) и 5 ​​мкм замороженные льда срезы готовили и окрашивали с использованием трипанового синего. Гистология желудка образцов рака оценивали опытным патологоанатомом (М.-Л. K.-L.). Ткань-Тек была удалена из тканей до нуклеиновая кислота extractions.Table 1 Клиническое параметры для анализируемых образцов на массив сравнительная геномная гибридизация (aCGH) и экспрессии микрочипов.
<СОР> <СОР> <СОР> <СОР> Primary желудочный tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Желудочный линии раковых клеток
Age /пол
гистологии
Происхождение
AGS
54 /F
Адено-карцинома
Первичная опухоль
KATOIII
55 /M
Диффузный
плевральной выпот
MKN-1
72 /M
адено- плоскоклеточный рак
узла метастазирования лимфы
MKN-7
39 /M
Кишечные
лимфоузлов метастаз
MKN-28
70 /F
узел метастаз Кишечные
лимфа
MKN-45
62 /F
Диффузный
печени метастазирование <бр> ТМК-1
21 /M
Диффузный узла метастазирование

лимфатических клеточные линии AGS и KATOIII были получены из американской коллекции типовых культур (Роквилл, штат Мэриленд, США) и MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, а также клеточные линии ТМК-1 были своеобразным подарком от Hiroshi Yokozaki, Кобе университета Высшая школа медицины, Кобе, Япония [26]. AGS клетки выращивали в среде F12 Kaighn (в 2 мМ глутамина, 10% ФБС, 100 ед /мл пенициллина-стрептомицина), клетки KATOIII в IMDM среде (2 мМ глутамина, 10% FBS, 100 ед /мл пенициллина-стрептомицина) и все другие клеточные линии в среде RPMI-1640 (10% FCS, 2 мМ глутамина, 100 ед /мл пенициллина-стрептомицина). Все клетки культивировали при 37 ° С и 5% CO <югу> 2.
РНК и выделения ДНК
До РНК и ДНК экстракций замороженной ткани погружают в реактив RNAlater-ICE (Ambion, Austin, TX , США) и хранили при -80 ° с в течение 16 часов для стабилизации РНК. Половину образца ткани (~ 25 мг) гомогенизировали в RLT-β-меркаптоэтанол буфера для лизиса (RNeasy Mini Kit, фирма Qiagen Inc., Hilden, Germany), а другая половина в АТЛ-буфере (DNeasy крови и тканей комплект, Qiagen) с использованием Ultra-Turrax гомогенизатор (IKA Works, Уилмингтон, штат Северная Каролина, США). РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy мини, в том числе дополнительного лечения ДНКазы и ДНК с использованием DNeasy крови и тканей Kit. Для желудка линий раковых клеток, 1 × 10 7 клетки лизируют с помощью шприца и иглы в любом RLT-β-меркаптоэтанол буфера для лизиса или АТЛ-буфером до РНК- и ДНК-извлечений, соответственно. РНК и ДНК концентрации были измерены с использованием NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и качество РНК оценивали с помощью компании Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Только РНК, показывающие различные 18S и 28S рибосомных пиков в анализе Bioanalyzer и 260/280 соотношение выше 2.0, были приняты для дальнейшего анализа.
Массив ГКГ и микрочипов экспрессии генов анализ
анализировались Тринадцать опухоли желудка и семь желудка клеточные линии рака предстательной на oligoarrays 244K Геном человека CGH (G4411B, Agilent Technologies). Три из опухолей и всех семи клеточных линий были также проанализированы с использованием экспрессии генов oligoarrays 44K Всего человеческого генома (G4112F, Agilent Technologies) (Рисунок 1). Средние 260/280 отношения для этих образцов были 2,1 для РНК и 1,8 для ДНК, и все образцы РНК были четкие пики 18S и 28S рибосомных в анализе Bioanalyzer указывающей хорошее качество (данные не показаны). Массив эксперименты CGH были выполнены с использованием человеческого генома ГКГ Microarray 244а комплект (Agilent Technologies). Этикетировочное и гибридизацию проводили в соответствии с протоколом компании Agilent (v5.0, июнь 2007 г.). Вкратце, 1,5 мкг ДНК образца и 1,5 мкг пола соответствием эталонной ДНК (ДНК-геномную, Promega, Madison, WI, USA) были дважды переваривают AluI
и RsaI
ферментов рестрикции (Promega). Гидролизованный ДНК метили с помощью компании Agilent геномную ДНК-маркирование Kit Plus. Образец ДНК метили с Cy5-дУТФ и эталонной ДНК с Cy3-дУТФ соответственно. Меченые ДНК очищали с Microcon YM-30 фильтров (Millipore, Billerica, MA, USA). После очистки, образцы и эталонные ДНК, объединяли и гибридизировали в массив с 50 мкг ДНК человеческого Cot-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) при 65 ° C, 20 оборотов в минуту в течение 40 ч. Гибридизацию проводили с Agilent Oligo aCGH Гибридизация Kit. Перед началом сканирования слайды были промыты в соответствии с протоколом. В дополнение к гибридизациями образца ДНК, описанных выше, ссылка мужской ДНК (Су3) гибридизовали с эталонной женской ДНК (Cy5) в соответствии с тем же протоколом, который будет использоваться в качестве опорного массива в анализе данных aCGH. Рисунок 1 Блок-схема, описывающая различные этапы исследования. Эксперименты экспрессии генов
были выполнены с использованием Всего генома человека Oligo Microarray комплект (Agilent Technologies), а также маркировки и гибридизацию в соответствии с протоколом Agilent (v5.7, март 2008 г.). Вкратце, 2 мкг тотальной РНК пробы и эталонной РНК (пул линий 10 раковых клеток, без желудка, АТСС, Manassas, штат Массачусетс, США) были мечены с использованием Agilent Quick Amp Labeling Kit. Образец РНК метили Cy5-дЦТФ и эталонной ДНК с Cy-3 дЦТФ, соответственно. Меченой РНК затем очищали с использованием набора RNeasy мини-спиновые колонки (Qiagen). Гибридизацию проводили с Аджилент экспрессии генов Гибридизация Kit и образцы гибридизовали при 65 ° С, 10 оборотов в минуту в течение 17 ч и промывают в соответствии с протоколом до начала сканирования. Оба aCGH и микрочипов экспрессии генов слайды были отсканированы с использованием ДНК Microarray сканера (Agilent Technologies) и проанализированы с помощью Feature Extraction Software (v9.5.1.1.).
Высокого разрешения число копий профилирование
Все данные количество копий доступна по адресу:. //WWW cangem орг (инвентарный номер: CG-EXP-49). [27]. Компании Agilent ГКГ Analytics программного обеспечения (v3.5.14) был применен для определения изменения количества копий. Данные микрочипов был качество фильтруют с использованием Outlier информации, полученной из анализа Feature Extraction. Зонды помеченных как выбросы были удалены из дальнейшего анализа. Кроме того, были применены следующие фильтры аберраций: минимальное количество зондов в области = 3, минимальный абсолютный журнал <суб> 2 отношение для региона = 0,27, и максимальное количество аберрантных регионов = 1000. Журнал <суб> 2 отношение 0,27 соответствует 1,2-кратному изменению числа копий. В CGH Analytics, каждый коэффициент aCGH впервые был преобразован в журнал <суб> 2 отношение с последующим Z-нормализации. Мужскую и женскую эталонного массива был использован в качестве матрицы калибровки в анализе данных. Из-за гендерных различий между массивами, которые могут вызвать смещение в анализе, хромосомы Х и Y были исключены из калибровки. Алгоритм ADM-2 с пороговым уровнем 12,0 использовали для идентификации генов число копий изменений в отдельных образцах и клеточных линий. были рассчитаны минимальные общие области изменений в 20 образцов, в том числе размер и хромосомной положение изменения в пар оснований. Аберрация была определена как рецидивирующей, если он присутствует, по крайней мере, 25% образцов (таблица 2) .table 2 Минимальные общие области рецидивирующим (≥25%) число копий изменений.
Переделка

тканей (п = 13) завод
Клеточные линии (п = 7)

Частота

Размер (Мб)

Position (Мб)

Возможные гены-мишени

+ 1q41-q43.1
2 страница 3 из 25 %
17,30
216.31-233.61
ENAH, AGT, CAPN2, Lefty2, LGALS8

+ 5p13.3-q11.1
1 4
25%
19,41
30.18-49.60
OSMR, RNASEN

+ 7q21.3-q22.1 4
3
35%
4,60
97.33-101.93
CYP3A4, AZGP1, VGF

+ 8q24.13-q24.3
3 страница 2 из 25%
19,8
126.45-146.25 <бр> ASAP1, BAI1, KHDRBS3

+ 8q24.3
6 страница 3 из 45%
2,23
143.59-145.82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0 страница 5 из 25%
1,05
22.89-23.94
LTB4R

+ 17q12-q21.1
3 страница 3 из 30%
0,28
35.02-35.30
ERBB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT

+ 17q22-q24.2 страница 2 из 3
25%
13,65
50.45-64.10
Axin2, RNF43

+ 19q12-qter 4
3
35%
29,36
33.89-63.25
CEACAM5, APOC1, Апо, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, ХПН, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, nlrp7, CCNE1

+ 20p13-qter страница 5 3
40%
57.94
0.04-57.98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST 3, Eya2, PI3, ID1, MMP9, BMP7

-9p24.3-P21 0,1
3 4
35%
27,81
1.05-28.86
МТАП, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1

-18q12. 3-q22.2
3 страница 5 из 40%
26.11
39.48-65.59
Smad7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5

-18q22.3 -qter
2 страница 5 из 35%
3,69
70.95-74.65
TSHZ1

-21q11.2-q21.1 страница 3 3
30%
4,07
14.37-19.44
HSPA13

-Xq28 4
1
25%
1,21
152.24- 153,45 -

Количество случаев, размер минимальных общих областей (МБ), а также положения хромосомной изменению (МБ) указаны, а также возможные гены-мишени. CNV регионы не будут показаны в таблице. . Усиление Номер экземпляра (+), потеря номер копии (-)
Gene анализ экспрессии микрочипов
Все экспрессии генов данных доступна по адресу: //WWW cangem орг (инвентарный номер: CG-EXP.. -49) [27]. Результаты были микрочипов качества фильтруется с помощью выпадающих заданного с помощью функции извлечения программного обеспечения и нормализованы в соответствии с методом лесс, который был включен в пакет программного обеспечения. Анализ экспрессии генов был ограничен генами, расположенными в регионах хромосомных аберраций с рецидивирующими (таблица 2). Целью такого подхода является то, чтобы выделить изменения экспрессии генов, которые были связаны с изменениями в количестве копий генов, и, следовательно, может представлять потенциальные онкогены или гены-супрессоры опухолей с функциональной ролью в развитии рака. Во-первых, средний коэффициент log10 выражение было вычислено для всех зондов, ориентированных на один и тот же ген. Затем в двух отдельных анализов для прибылей и убытков, сравнивали средний уровень экспрессии каждого гена между образцами с числом копий прибылей /убытков и образцов с нормальным количеством копий, чтобы оценить влияние изменений числа копий на экспрессию генов. экспрессии генов вислоухих изменения (FC) были рассчитаны либо путем деления медиана экспрессии раковых образцов медианным экспрессии доброкачественных образцов или путем деления медиана экспрессии образцов рака с числом копий изменений (g1) медианным экспрессии образцов рака с нормальным числом копий (g0). По крайней мере, в 2 раза число копий связанное с этим изменение в экспрессии генов, считалось значимым. На основании этих данных, 13 генов ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, HHIPL2, LTB4R
, ММР9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
и PTPRA
, были выбраны, чтобы быть дополнительно подтверждена с анализом и ПРОФ QRT-ПЦР (анализ транскриптов с помощью сродства захвата) анализа. Результаты комплексного анализа микрочипов были сопоставлены с тремя ранее опубликованных исследований, которые систематически интегрируют в количестве копий и экспрессии генов данных генома [15-17].
В режиме реального времени анализ QRT-PCR
в режиме реального времени qRT- ПЦР проводили в течение 2-х генов, ALPK2
(18q21.31-q21.32) и HHIPL2
(1q41). Уровни экспрессии были измерены в 82 тканях желудка (46 раковой и 36 доброкачественных тканей) и в 7 желудочных линий раковых клеток (дополнительный файл 1: клинические параметры). 1 мкг тотальной РНК, превращали в кДНК с использованием Молони-мышиный вирус лейкемии обратной транскриптазы (Promega, Madison, WI, USA) и случайных праймеров (Invitrogen) в объеме 50 мкл в течение 1 ч при 37 ° С. Реакция была инактивированной нагреванием (95 ° С, 3 мин) и заполняют до конечного объема 200 мкл с помощью очищенной воды молекулярного. Стенограммы были количественно с использованием генной экспрессии продуктов на Assays-DemandTM-(Hs01085414_m1 для ALPK2
и Hs00226924_m1 для HHIPL2
) в соответствии с протоколом производителя (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Все праймеры были расположены на границах экзон-экзона. В кратком изложении, 2 мкл матрицы кДНК смешивали с 1,25 мкл специфических праймеров и зондов, меченных FAM-репортерного красителя. 12,5 мкл TaqMan ® Универсальный PCR Mastermix и РНКазы воду добавляли в общем объеме 25 мкл. 18S рРНК человек служил в качестве эндогенного контроля для нормализации уровней экспрессии в последующем количественном анализе. Зонд 18S метили ВИК-репортер красителем, чтобы позволить мультиплексной ПЦР с генов-мишеней. Условия ПЦР были следующими: 50 ° С в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин. Каждый образец измеряли в трех экземплярах, и данные были проанализированы с помощью дельта-дельта метода для сравнения относительных результатов выражение (2 - [управление Ct образец-Кт])
ПРОФ анализ
анализа Transcript с помощью. сродства захвата (TRAC) анализ [28] проводили в течение 11 различных генов в 88-желудочных тканей (53 злокачественными и 35 доброкачественная тканей) и 7 желудочных линий раковых клеток (дополнительный файл 1: клинические параметры). Гены, включенные в анализ были включены ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1), CYP3A4
(7q21.1) ASAP1
(8q24.1-q24.2), LTB4R
(14q11.2-q12), PERLD1
(17q12), ERBB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-Q13 .2), PTPRA
(20p13) и ММР9
(20q11.2-q13.1). Преимущество анализа TRAC является то, что уровни экспрессии множества генов могут быть измерены одновременно из одной пробы, таким образом, снижение количества образца РНК, необходимой для анализа. Это особенно важно для анализа часто дефицитных образцов клинических тканей.
Анализ ПРОФ проводился в PlexPress (Хельсинки, Финляндия). Пользовательские TRACPackTM реагенты для мРНК (PlexPress) были использованы в анализе. Вкратце, 90 мкл гибридизационного Mix (содержащие меченые Гено-специфические зонды для обнаружения и биотинилированные зонды олиго-дТ) на лунку распределяли на 96-луночный планшет для ПЦР. Два микрограмма образца РНК наносили в каждую лунку в общем объеме реакционной смеси 100 мкл. Равное количество (30 аттомоль /реакции) одноцепочечной 62-членного синтетического олигонуклеотида контроля гибридизации, в том числе и поли-A хвостом, был добавлен к каждому образцу до начала гибридизации. Гибридизацию проводили при 60 ° С, 650 оборотов в минуту в течение 120 минут (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Гамбург, Германия). После того, как гибридизация сродства захвата, очистки и элюирования были сделаны с использованием Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Финляндия) процессор магнитных частиц. Стрептавидином магнитные гранулы в сочетании TRACPACK ™ (50 мкг, PlexPress) добавляли к смеси для гибридизации и давали связываться с биотинилированным мРНК-зонда-олиго (дТ) -hybrids в течение 30 минут, после чего гранулы промывают 5 раз использу промывную буфер для удаления несвязанного материала. Меченой РНК-специфических зондов, элюировали буфером для элюции и обнаружен с помощью капиллярного электрофореза, используя ABI3100 секвенсер (Applied Biosystems, Cheshire, UK). Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения TRACParser (PlexPress).
Статистический анализ данных QRT-PCR
непараметрический тест Манна-Уитни для двух независимых выборок применялся для определения статистической значимости различий в экспрессии мРНК относительной уровни ALPK2
и HHIPL2
в доброкачественных и злокачественных образцах желудка, а также в образцах рака желудка различных гистологических подтипов или TNM стадий развития. Р-значение &л; 0,05 считали статистически значимым (SPSS 17.0). Кроме того, в двух отдельных анализов для прибылей и убытков, уровни экспрессии в образцах рака с копией прироста числа или потерь (g1) сравнивают с образцами рака с нормальным числом копий (g0), чтобы оценить связь между числом копий и экспрессии генов. Скопировать номер данные были доступны для 37 образцов желудочного включенных в анализ QRT-PCR (Дополнительный файл 1: Клинические показатели). изменения сворачивают экспрессии генов были вычислены путем деления средней экспрессии одной группы (например, карцином) по средней экспрессии другой группы (например, доброкачественная образцов).
Статистический анализ данных ПРОФ анализа
Синтетический контроль гибридизационная использовалась в нормализации данных для удаления любого небиологический колебанием данных. Для каждой цели, сигнал интенсивности относительно этого внутреннего контроля гибридизации были рассчитаны. За девять образцов ткани, анализируемых в повторности означает, использовали интенсивность сигнала. Непараметрический тест Манна-Уитни для двух независимых выборок применялся для определения статистической значимости различий в относительных уровней экспрессии мРНК ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, LTB4R
, ММР9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
и PTPRA
в доброкачественных и злокачественных образцах желудка, а также в образцах рака желудка различных гистологических подтипов или TNM стадий развития. Р-значение &л; 0,05 считали статистически значимым (SPSS 17.0). Сравнение уровней экспрессии генов в образцах с и без изменений числом копий была выполнена, как это было описано ранее для анализа QRT-PCR. . Скопировать номер данные были доступны для 43 образцов желудочного рака, включенных в анализ ПРОФ анализа

Результаты копирования Gene количество аберраций изображения Все числа копий гена изменения в отдельных образцах приведены в дополнительном файле 2: изменения количества копий обнаружены с помощью анализа aCGH. Минимальные общие регионы рецидивирующих (≥25%) изменений, а также их размер, частота, возможные гены-мишени, а также позиции хромосомной в пар оснований приведены в таблице 2. рецидивирующий получили регионы располагались на 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), и 20p13-qter (40%). Неизменные удаленные районы располагались на 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), и Xq28 (25%). Все периодические изменения числа копий были обнаружены как в первичных злокачественных опухолей желудка и в желудочном линиях раковых клеток, для 14q11.2, которое было изменено лишь в пяти клеточных линиях, за исключением.
Экспрессии генов, связанный число копий изменений
В общей сложности 256 индивидуальных генов (10% всех генов, расположенных в рецидивирующих хромосомных областей с числом копий изменений) показал, по меньшей мере, в 2 раза числа копий, связанное изменение в их выражении (диапазон 2,0 - 34,6, медиана 3,8) (Дополнительный файл 3: Копировать номер, связанный ген изменения выражения). 226 из этих генов были избыточно экспрессируется и расположены в повторяющихся регионах прироста количества копий, в то время как 30 генов underexpressed и расположены в повторяющихся регионах потери числа копий. Fold изменения в экспрессии генов рассчитывали путем сравнения уровней экспрессии образцов с числом копий изменений для образцов с нормальным числом копий в данном гене. Таким образом, положительное изменение раз относится к увеличению усиления числа копий, связанных в экспрессии генов, тогда как отрицательное изменение раз относится к уменьшению потерь, связанных количества копий в экспрессии генов.
HHIPL2
(HHIP-подобный 2) ген, амплифицированный в регионе 1q41-q43.1, показал высокий прирост числа копий ассоциированных гиперэкспрессия при раке желудка в соответствии с комплексным анализом микрочипов (FC = 26,9). Как правило, самое высокое выражение гена сложите изменения между образцами рака и без прироста количества копий были обнаружены на 19q области с из 40 генов, показывающих ≫ 5-кратное количество копии, связанные изменения в их выражении, 19 (47,5%) были расположены в 19q области (3 Дополнительный файл: изменения экспрессии гена номер, связанный Copy). Наиболее underexpressed ген в рецидивирующих регионах потери количества копий было ALPK2
(альфа-киназы 2) (FC = -34,6), расположенный на 18q12.3-q22.2.
Ранее три исследования нами и другими были опубликованы, которые систематически интегрировать в количестве копий и экспрессии генов данных генома, чтобы идентифицировать гены, чья экспрессия изменилась из-за изменения числа копий при раке желудка [15-17]. Сравнение перекрывающихся генов между этими исследованиями и текущего исследования выявили 20 генов TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), МТАП
(9q21 .3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), ERBB2
(17q12-q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST 3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2) и TUBB1
(20q13.32), которые были либо получили и суперэкспрессированный или удалены и underexpressed в нашем исследовании, и по крайней мере один из ранее опубликованных исследований. Ранее опубликованные данные вместе с текущие результаты являются еще одним свидетельством биологической роли этих генов в развитии рака желудка.
Проверка потенциальных мишеней рака желудка генов
анализ в реальном времени QRT-ПЦР показал, что экспрессия HHIPL2 <бр> 7,4 раза выше в образцах рака желудка по сравнению с доброкачественными желудочных тканей (р &л; 0,05). Кроме того, избыточная экспрессия HHILP2
была в значительной степени связано с увеличением числа копий (р &л; 0,05), как выражение HHIPL2
17,4 раза выше в образцах рака с количеством копий усиления HHIPL2
(g1 ), чем в образцах рака с нормальным числом копий этого гена (g0) (таблицы 3 и 4). Согласно анализу QRT-PCR была 2,9 раза underexpression из ALPK2
в рака желудка с потерями числа копий (g1) по сравнению с раком желудка с нормальной копией числа ALPK2
(g0) (P < 0,05 ). Удивительно, однако, экспрессия ALPK2
в рака желудка в целом была в 1,9 раза выше (р &лт; 0,05), чем в неопухолевых тканях желудка (таблицы 3 и 4). Гистологического подтипа или TNM стадии не оказывает статистически значимого влияния на экспрессию HHIPL2
или ALPK2
(таблица 3) .table 3 Результаты непараметрического критерия Манна-Уитни для QRT-PCR и анализа данных ПРОФ (SPSS17.0).
Джин

Хромосома

Рак vs. незлокачественная

кишечная по сравнению с диффузным

g1 против g0

M0 против M1

T1-2 против T3-4

N0 против N1-3

ALPK2

18q21.31-q21.32
р &л; 0,05
р = 0,104

р
&л; 0,05
р = 0,451

р = 0,072

р = 0,378

ASAP1

8q24.1-q24.2
р-л; 0,001
р = 0,319

р = 0,396

р = 0,208

р = 0,232

р = 0,289

CEACAM5

19q13.1-q13.2
р &л; 0,001
р = 0,061

р = 0,254

р = 0,543

р = 0,197

р = 0,253

CYP3A4

• Прогностическое значение соотношения нейтрофилов и лимфоцитов соотношение тромбоцитов лимфоцитов в прогре…
• Новый метод, цифровое сканирование генома обнаруживает усиление гена KRAS в рака желудка: вовлечение гиперэксп…