Genoom-brede gen aantal kopieën en expressie analyse van de primaire maag tumoren en maagkanker cellijnen

Genoom-brede gen aantal kopieën en expressie analyse van de primaire maag tumoren en maagkanker cellijnen
Abstract achtergrond
Maagkanker is een van de meest voorkomende maligniteiten wereldwijd en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen. Genkopieaantal veranderingen spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van maagkanker en een verandering in genkopieaantal is een van de belangrijkste mechanismen een kankercel de expressie van potentiële oncogenen en tumorsuppressor genen.
Methods
om genen van potentiële biologische en klinische relevantie bij maagkanker te benadrukken, hebben wij een systematische-array gebaseerde onderzoek van genexpressie en kopieer aantal niveaus in het primair maag tumoren en maagkanker cellijnen en gevalideerd de resultaten met behulp van een affiniteit capture gebaseerd transcript analyse ( TRAC-test) en real-time qRT-PCR.
Resultaten
Integrated microarray-analyse bleek totaal 256 genen die waren gevestigd in terugkerende regio's van de winsten of verliezen en had minstens een 2-voudige kopie aantal- bijbehorende verandering in hun genexpressie. De expressie niveaus van 13 van deze genen, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, ERBB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
, PNMT
, PTPRA
en OSMR
werd gevalideerd in een totaal van 118 monsters van de maag met behulp van de qRT-PCR of TRAC-test. Al deze 13 genen differentieel tot expressie tussen kankerachtige monsters en niet-maligne weefsels (p <0,05) en de associatie tussen kopieaantal en genexpressie veranderingen gevalideerd negen (69,2%) van deze genen (p < 0,05).
conclusie
tot slot, geïntegreerde genexpressie en aantal kopieën microarray analyse benadrukt genen die van cruciaal belang voor de maag carcinogenese kunnen zijn. TRAC en qRT-PCR analyses gevalideerd de microarray resultaten en dus de rol van deze genen als potentiële biomarkers voor maagkanker. Achtergrond
Door het ontbreken van vroege symptomen maagdarmkanker wordt gekenmerkt door late fase diagnose en onvoldoende mogelijkheden curatieve behandeling [1, 2]. Ondanks de daling van de incidentie in de afgelopen decennia, blijft maagkanker de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [3]. Ongeveer 90% van maagkanker zijn adenocarcinomen die voortvloeien uit het epitheel [4]. Volgens indeling maagkanker Laurén zijn verdeeld in twee histologische subtypes, darm- en diffuus [5].
Gastric adenocarcinomen, net als veel andere vaste tumoren van epitheliale oorsprong, zijn vaak complex qua chromosomale integriteit [6, 7]. Kwaadaardige tumoren maag is bekend dat meerdere afwijkingen in het genoom en dergelijke chromosomale wijzigingen dragen zijn cruciaal voor de activering en inactivering kankergerelateerde genen [8-17]. Genkopieaantal verandering is een van de belangrijkste mechanismen een kankercel de expressie van genen cruciaal voor celoverleving en kankerprogressie [17-22] beheersen. Deze kopie aantal veranderingen vaak sprake van een grote groep genen die dicht bij elkaar in hetzelfde chromosoom. Bijvoorbeeld; in de maag kankers de vaak versterkte 17q12-q21 gebied bevat genen zoals ERBB2
, GRB7
, JUP
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
en TOP2A
[14, 17, 23]. Slechts een klein deel van deze genen zijn waarschijnlijk een ware kanker bestuurder genen bijdragen aan het ontstaan ​​van tumoren, terwijl andere alleen toegelaten zijn vanwege hun chromosomale nabijheid van de amplificatie doelwitgenen [24, 25]. Een benadering voor deze driver genen onderscheiden van de passagier mutaties op genoom-brede kopieaantal en expressie gegevens die de identificatie van genen waarvan de transcriptionele activatie of repressie wordt geassocieerd met een kopieaantal verandering in een kankercel maakt integreren. Dus door het combineren van gegevens uit de hoge resolutie genkopieaantal en expressie microarrays is het niet alleen mogelijk om breakpoints of duplicaties in detail bepalen, maar ook de functionele betekenis van deze wijzigingen en daarom mogelijk genen die kanker schijfeenheid ontstaan ​​en de progressie. Belgique Om genen potentieel als biomarkers of klinische targets bij maagkanker te benadrukken, hebben wij een systematische hoge-resolutie-array-based overzicht van het aantal kopieën en genexpressie niveaus bij maagkanker weefsels en cellijnen. Onze eerdere array gebaseerde analyse blijkt dat kopieaantal winsten en verliezen van honderden genen zijn geassocieerd met een gelijktijdige verhoging of verlaging in genexpressie [17]. In de onderhavige studie hebben we de resolutie van het kopieaantal analyse toegenomen 20-voudig tot beter visualiseren van de breekpunten van het kopie-aantal variaties. Verder hebben we een transcriptie analyse van de genen zich in gewijzigde chromosomale regio's om genen waarvan de deregulering wordt geassocieerd met de kwaadaardige fenotype te identificeren uitgevoerd.
Methods
Maagkanker weefsels en cellijnen
Dit onderzoeksproject is herzien en goedgekeurd door de Ethische Commissie van de afdeling Medische Genetica en chirurgie en goedgekeurd door de Clinical review Board van Helsinki University Central Hospital. Gastric weefselmonsters werden prospectief verzameld van patiënten die een maag operatie of gastroscopie onderging in de Helsinki University Central Hospital tussen 1999 en 2007. Informed consent werd verkregen van elke deelnemende patiënt. Dertien bevroren primaire maagkanker weefsels en zeven maagkanker cellijnen werden gekozen voor microarray-analyse (Tabel 1). Het weefselmateriaal bestond uit twee verschillende histologische subtypes, intestinale (n = 9) en diffuse (n = 4) en de tumoren werden geplaatst op twee verschillende plaatsen van de maag, het corpus (n = 8) en het antrum (n = 5 ). In totaal 111 gastrische weefsels en 7 maagkanker cellijnen werden opgenomen in de qRT-PCR en affiniteitsinvangmiddel gebaseerde transcriptie assay (TRAC) analyses (aanvullende bestandsinformatie 1: klinische parameters). Het weefsel monsters bestonden uit 43 nonmalignant en 68 kankerachtige weefsels maag en beide histologische subtypes van maagkanker waren vertegenwoordigd (darm, n = 42, diffuse, n = 25, een onbekende histologie). Maagweefsel monsters werden opgeslagen bij -80 ° C. Het percentage tumor en histologie van de monsters controleren werden ingevroren monsters ingebed in Tissue-Tek oktober Verbinding (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) en 5 urn bevroren ijs-secties werden bereid en gekleurd met trypan blauw. Histologie van maagkanker monsters werd geëvalueerd door een ervaren patholoog (M.-L. K.-L.). Tissue-Tek werd uit de weefsels vóór zuur extractions.Table 1 klinische parameters voor de matrix geanalyseerd op vergelijkende genomische hybridisatie (aCGH) monsters en expressie microarrays.
Primaire Nucleic maag- tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Maagkanker cellijnen
Leeftijd /geslacht
histologie
Origin
AGS
54 /F
adeno-carcinoom
primaire tumor
KATOIII
55 /M
Diffuse
Pleuravocht
MKN-1
72 /M
adeno-plaveiselcelcarcinoom
lymfekliermetastasen
MKN-7
39 /M
Intestinale
lymfekliermetastase
MKN-28
70 /F
Intestinale
lymfekliermetastasen
MKN-45
62 /F
Zend
lever metastase
TMK-1
21 /M
Zend
lymfekliermetastasen
AGS en KATOIII cellijnen werden verkregen van American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) en MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, en TMK-1 cellijnen waren een soort geschenk van Hiroshi Yokozaki, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, Japan [26]. AGS-cellen werden gegroeid in Kaighn's F12 medium (2 mM glutamine, 10% FBS, 100 U /ml penicilline-streptomycine), KATOIII cellen in IMDM-medium (2 mM glutamine, 10% FBS, 100 U /ml penicilline-streptomycine) en alle andere cellijnen in RPMI-1640 medium (10% FCS, 2 mM glutamine, 100 U /ml penicilline-streptomycine). Alle cellen werden bij 37 ° C en 5% CO 2.
RNA en DNA-extractie
Vóór RNA en DNA extracties, het bevroren weefsel werd ondergedompeld in RNAlater ICE-reagens (Ambion, Austin, TX , USA) en bewaard bij -80 ° C gedurende 16 uur om het RNA te stabiliseren. Helft van het weefselmonster (~ 25 mg) werd gehomogeniseerd in RLT-β-mercaptoethanol lysis buffer (RNeasy mini kit, Qiagen Inc., Hilden, Duitsland) en de andere helft in ATL-buffer (DNeasy Tissue Blood Kit, Qiagen) met de Ultra-Turrax homogenisator (IKA Works, Wilmington, NC, USA). RNA werd geëxtraheerd met behulp van de RNeasy mini kit, zoals de optionele DNase behandeling en DNA met de DNeasy Tissue Kit bloed. Maagkanker cellijnen, 1 x 10 7 cellen werden gelyseerd met een injectiespuit en naald in beide RLT-β-mercaptoethanol lysis buffer of ATL-buffer voorafgaand aan RNA en DNA extracties, respectievelijk. RNA en DNA-concentraties werden gemeten met NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) en RNA kwaliteit werd beoordeeld volgens Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Alleen RNA's tonen verschillende 18S en 28S ribosomale pieken in de Bioanalyzer analyse en de 260/280 ratio's boven de 2,0 werden voor verdere analyse aanvaard.
Array CGH en genexpressie microarray analyses
Dertien maag tumoren en zeven maagkanker cellijnen werden geanalyseerd op het 244K Human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Drie van de tumoren en alle zeven cellijnen werden ook geanalyseerd met de 44K gehele menselijk genoom genexpressie oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (figuur 1). De gemiddelde 260/280 ratio voor deze monsters waren 2,1 voor RNA en 1,8 voor DNA, en alle RNA-monsters hadden duidelijk 18S en 28S ribosomale pieken in de Bioanalyzer analyse aangeeft goede kwaliteit (gegevens niet getoond). Array CGH experimenten werden uitgevoerd met behulp van Human Genome CGH Microarray 244A kit (Agilent Technologies). Etikettering en hybridisatie werden uitgevoerd volgens de Agilent protocol (v5.0, juni 2007). In het kort, 1,5 ug monster-DNA en 1,5 ug geslacht overeenkomende DNA-(Human Genomic DNA, Promega, Madison, WI, USA) waren dubbel-geknipt met AluI Kopen en RsaI
restrictie-enzymen (Promega). Het gedigereerde DNA werd gelabeld met de Agilent Genomic DNA Labeling Kit Plus. Monster DNA werd gelabeld met Cy5-dUTP en referentie DNA met Cy3-dUTP respectievelijk. Gemerkte DNA werd gezuiverd met Microcon YM-30 filter (Millipore, Billerica, MA, USA). Na de zuivering monster en referentie DNA's werden samengevoegd en gehybridiseerd aan de array met 50 ug menselijk Cot-1 DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bij 65 ° C, 20 rpm gedurende 40 uur. Hybridisatie werd uitgevoerd met Agilent Oligo aCGH Hybridization Kit. Vóór het scannen werden de objectglaasjes gewassen volgens het protocol. Naast het monster DNA hybridisaties bovenbeschreven verwijzing mannelijke DNA (Cy3) werd gehybridiseerd met verwijzing vrouwelijke DNA (Cy5) volgens hetzelfde protocol te gebruiken als een referentie-array in de aCGH gegevensanalyse. Figuur 1 stroomschema verschillende fasen van de studie.
Genexpressie experimenten werden uitgevoerd met het gehele menselijk genoom Oligo Microarray kit (Agilent Technologies) en labeling en hybridisatie volgens de Agilent protocol (v5.7, maart 2008). In het kort, 2 ug totaal RNA monster en referentie-RNA (een pool van 10 kankercellijnen, niet-maag, ATCC, Manassas, MA, USA) werden gelabeld met behulp van de Agilent Quick Amp Labeling Kit. Monster RNA werd gelabeld met Cy5-dCTP en referentie DNA met Cy3-dCTP, respectievelijk. Gelabelde RNA werd vervolgens gezuiverd met behulp RNeasy mini spinkolommen (Qiagen). Hybridisatie werd uitgevoerd met Agilent Genexpressie hybridisatie Kit en monsters werden gehybridiseerd bij 65 ° C, 10 rpm gedurende 17 uur en gewassen volgens het protocol vóór het scannen. Zowel aCGH en genexpressie microarray dia's werden gescand met behulp van de DNA microarray Scanner (Agilent Technologies) en geanalyseerd met Feature Extraction Software (v9.5.1.1.).
High-resolution copy number profileren Leer Alle copy number gegevens te vinden op http: //www. cangem org (toegangsnummer: CG-EXP-49). [27]. Agilent CGH Analytics software (v3.5.14) werd aangebracht op het kopieaantal veranderingen detecteren. Microarray data werd de kwaliteit gefilterd met behulp van de uitschieter verkregen via Feature Extraction analyse. Probes gemarkeerd als uitschieters werden verwijderd uit verdere analyse. Daarnaast werden de volgende aberratie filters toegepast: minimale aantal sondes in de regio = 3, minimum absolute log 2 ratio voor de regio = 0,27, en het maximum aantal afwijkende gebieden = 1000. De log 2-ratio van 0,27 komt overeen met een 1,2-voudige verandering in het aantal kopieën. In CGH Analytics, werd elke aCGH verhouding eerst omgezet in een logboek 2 verhouding, gevolgd door een Z-normalisatie. De mannelijke vs. vrouwelijke referentieraster gebruikt als ijkingsarray in de gegevensanalyse. Vanwege het geslacht verschillen tussen de arrays die bias in de analyse zou veroorzaken chromosomen X en Y werden uitgesloten van de kalibratie. ADM-2 algoritme met een drempelwaarde van 12,0 werd gebruikt om genkopieaantal veranderingen te identificeren afzonderlijke monsters en cellijnen. Minimale gemeenschappelijke gebieden van veranderingen in de 20 monsters werden berekend, waaronder de grootte en de chromosomale positie van de wijziging in basenparen. Een afwijking werd gedefinieerd als terugkerende, indien aanwezig in ten minste 25% van de monsters was (tabel 2) .table 2 Minimale gemeenschappelijke gebieden van recidiverende (≥25%) kopienummer veranderingen.
Wijziging
Tissues (n = 13)
cellijnen (n = 7)
Frequency

Size (Mb)
Position (Mb)
mogelijk doelwit genen
+ 1q41-q43.1 2
3
25 %
17.30
216,31-233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1 1
4
25%
19.41
30,18-49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1 verhuur 4
3
35%
4,60
97,33-101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3
3 2
25%
19,8
126,45-146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3
6
3
45%
2,23
143,59-145,82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0
5
25%
1.05
22,89-23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1
3
3
30%
0.28
35,02-35,30
ERBB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2 2
3
25%
13.65
50,45-64,10
AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter verhuur 4
3
35%
29.36
33,89-63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57,94
,04-57,98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-p21 0,1
3 verhuur 4
35%
27.81
1,05-28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2
3
5
40%
26.11
39,48-65,59
Smad7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter 2
5
35%
3,69
70,95-74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1
3
3
30%
4.07
14,37-19,44
HSPA13
-Xq28 verhuur 4 1
25%
1,21
152.24- 153,45
-
Aantal gevallen, de grootte van de minimale gemeenschappelijke gebieden (Mb), en de chromosomale positie van de wijziging (Mb) zijn evenals aangegeven mogelijk doelwit genen. CNV gebieden worden niet weergegeven in de tabel. . Nummer Copy winst (+), copy number verlies (-)
genexpressie microarray-analyse Leer Alle genexpressie data is te vinden op http: //www cangem org (toegangsnummer: CG-EXP.. -49) [27]. Microarray resultaten werden gefilterd met uitschieters kwaliteit gedefinieerd door de Feature Extraction Software en genormaliseerd volgens het loss methode, die werd opgenomen in het softwarepakket. De genexpressie analyse werd beperkt tot genen in het chromosomale regio's met recidiverende afwijkingen (tabel 2). Het doel van deze benadering was om genexpressie veranderingen die zijn geassocieerd met veranderingen in het aantal genkopieën te markeren, en kon dus potentiële oncogenen en tumorsuppressorgenen vormen met een functionele rol bij kanker. Eerst werd een mediane log10 expressieverhouding berekend voor alle probes gericht op hetzelfde gen. Vervolgens, in twee afzonderlijke analyses winsten en verliezen de mediane expressieniveau van elk gen werd vergeleken tussen de monsters met copy number winst /verlies en monsters met een normale kopie, zodat het effect van kopieaantal veranderingen op genexpressie te beoordelen. Genexpressie veelvoudveranderingen (FC) werden ofwel berekend door de gemiddelde expressie van de kankerachtige monsters te delen door de gemiddelde expressie van de nonmalignant monsters of de gemiddelde expressie van kanker monsters met kopie-aantal variaties (g1) te delen door de mediane expressie van kankermonsters met een normale kopie aantal (G0). Ten minste een 2-voudige kopieaantal geassocieerde veranderingen in genexpressie werd als significant beschouwd. Op basis van deze gegevens, 13 genen ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
en PTPRA
, werden gekozen verder te worden gevalideerd met qRT-PCR-analyse en TRAC (transcript analyse met behulp van affiniteit capture) test. De resultaten van de geïntegreerde microarray-analyse werden vergeleken met drie eerder gepubliceerde studies die systematisch integreren genoom-brede aantal kopieën en genexpressie data [15-17].
Real-time qRT-PCR-analyse
Real-time qRT- PCR werd uitgevoerd gedurende 2 genen, ALPK2
(18q21.31-q21.32) en HHIPL2
(1q41). De expressie niveaus werden gemeten in 82 maag weefsels (46 kankercellen en 36 nonmalignant weefsels) en in 7 maagkanker cellijnen (Extra file 1: Klinische parameters). 1 ug totaal RNA werd omgezet in cDNA met behulp Moloney muriene leukemie virus reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA) en willekeurige primers (Invitrogen) in een volume van 50 ul gedurende 1 uur bij 37 ° C. De reactie werd door warmte geïnactiveerd (95 ° C, 3 min) en gevuld tot een eindvolume van 200 pl met moleculaire kwaliteit water. De transcripten werden gekwantificeerd met de Assays-on-DemandTM genexpressieproducten (Hs01085414_m1 voor ALPK2 Kopen en Hs00226924_m1 voor HHIPL2
) volgens het protocol van de fabrikant (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle primers waren op exon-exon grenzen. Kort samengevat, 2 pi cDNA sjabloon werd gemengd met 1,25 pi specifieke primers en probes gelabeld met FAM-reporterkleurstof. 12,5 ul TaqMan ® Universal PCR Mastermix en RNase-vrij water toegevoegd tot een totaal volume van 25 pl. Menselijke 18S rRNA diende als endogene controle om de expressieniveaus te normaliseren in het daaropvolgende kwantitatieve analyse. De 18S probe werd gelabeld met VIC-reporter kleurstof multiplex PCR met de van doelwitgenen. De PCR condities waren als volgt: 50 ° C gedurende 2 min, 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s en 60 ° C gedurende 1 min. Elk monster werd in drievoud gemeten en de gegevens werden geanalyseerd door de delta-delta methode voor het vergelijken van relatieve expressie resultaat (2 - [Ct sample-Ct control])
TRAC assay
Transcript analyse met behulp van. affiniteit capture (TRAC) test [28] werd uitgevoerd voor 11 verschillende genen in 88 maag weefsels (53 kankercellen en 35 nonmalignant weefsels) en 7 maagkanker cellijnen (Extra file 1: Klinische parameters). De genen in de analyse opgenomen waren ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1), CYP3A4
(7q21.1) ASAP1
(8q24.1-q24.2), LTB4R
(14q11.2-Q12), PERLD1
(17q12), ERBB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-Q22), CEACAM5
(19q13.1-Q13 0,2), PTPRA
(20p13), en MMP9
(20q11.2-q13.1). Het voordeel van het TRAC test is dat de expressieniveaus van meerdere genen kan worden gemeten uit een enkel monster waardoor de hoeveelheid monster RNA vereist voor de analyse verlagen. Dit is vooral belangrijk voor de analyse van klinische vaak schaars weefselmonsters.
TRAC analyse werd uitgevoerd bij PlexPress (Helsinki, Finland). Aangepaste TRACPackTM reagentia voor mRNA (PlexPress) werden gebruikt in de analyse. Kort, 90 gl hybridisatiemengsel (bevattende gemerkte genspecifieke probes detectie en gebiotinyleerd oligo-dT probes) per putje werd verdeeld op een 96-well PCR plaat. Twee microgram RNA monster werd aan elk putje in 100 gl totaal reactievolume. Een gelijke hoeveelheid (30 amol /reactie) enkelstrengs 62-meer synthetisch oligonucleotide hybridisatie controle, waaronder een poly-A-staart, werd aan elk monster voor hybridisatie toegevoegd. Hybridisatie werd uitgevoerd bij 60 ° C, 650 rpm gedurende 120 minuten (Thermomixer Comfort Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Na hybridisatie affiniteit capture, zuivering en elutie werd uitgevoerd met behulp van de ijsvogel Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) magnetische deeltjes processor. Streptavidine gekoppelde magnetische korrels TRACPACK ™ (50 ug, PlexPress) werden aan het mengsel toegevoegd en de hybridisatie liet binden aan het gebiotinyleerde mRNA-probe-oligo (dT) -hybriden gedurende 30 minuten, waarna de korrels 5 keer middels wassen werden gewassen buffer om eventuele niet-gebonden materiaal te verwijderen. Gemerkte RNA-probes werden geëlueerd met elutiebuffer en gedetecteerd door capillaire elektroforese met de ABI3100 sequencer (Applied Biosystems, Cheshire, UK). De gegevens werden geanalyseerd met het software TRACParser (PlexPress).
Statistische analyse van de qRT-PCR data
een niet-parametrische Mann-Whitney test voor twee onafhankelijke monsters werd toegepast om de statistische significantie van verschillen in de relatieve mRNA-expressie te bepalen niveaus van ALPK2 Kopen en HHIPL2
in nonmalignant en kankercellen maag monsters, alsook bij maagkanker monsters van de verschillende histologische subtypes of TNM-stadia. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant (SPSS 17.0). Daarnaast is in twee afzonderlijke analyses voor winsten en verliezen, de expressie niveaus bij kanker monsters met een aantal kopieën winsten of verliezen (g1) werden vergeleken met kanker monsters met een normale kopie aantal (G0) naar het verband tussen het aantal kopieën en genexpressie te beoordelen. aantal exemplaar gegevens beschikbaar waren voor 37 van het maag-samples opgenomen in de qRT-PCR-analyse (Extra file 1: Klinische parameters). Genexpressie veelvoudveranderingen werden berekend door de gemiddelde expressie van één groep (zoals kanker monsters) te delen door de gemiddelde expressie van de andere groep (bijv nonmalignant monsters).
Statistische analyse van TRAC analysegegevens
een synthetisch hybridisatie control werd gebruikt in de gegevensnormalisatie alle niet-biologische variatie in de gegevens te verwijderen. Voor elk doel, signaal intensiteiten ten opzichte van deze interne hybridisatie controle werden berekend. Voor de negen weefselmonsters in duplo geanalyseerd betekenen intensiteit van het signaal werd gebruikt. Een niet-parametrische Mann-Whitney test voor twee onafhankelijke monsters werd toegepast om de statistische significantie van verschillen in de relatieve mRNA-expressieniveaus van ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, LTB4R , MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
en PTPRA
in nonmalignant en kankercellen maag monsters, alsook bij maagkanker monsters van de verschillende histologische subtypes of TNM-stadia. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant (SPSS 17.0). De vergelijking van genexpressie niveaus in monsters met en zonder wijzigingen kopieaantal werd uitgevoerd zoals eerder is beschreven voor de qRT-PCR analyse. . Aantal exemplaar gegevens waren beschikbaar voor 43 maagkanker monsters die worden TRAC assay analyse
Resultaten
Gene copy number afwijkingen
Al-gen duplicaties bij individuele monsters worden getoond in het aanvullend file 2: Copy aantal veranderingen gedetecteerd door aCGH analyse. Minimale gemeenschappelijke gebieden van recidiverende (≥25%) wijzigingen alsmede de omvang, frequentie, mogelijk doelwit genen en chromosomale positie basenparen worden getoond in Tabel 2. De terugkerende verworven gebieden werden gevestigd bij 1q41-q43.1 (25% ) 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%) en 20p13-qter (40%). De terugkerende verwijderde gebieden werden gevestigd op 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), en Xq28 (25%). Alle periodieke duplicaties detecteerbaar in zowel de primaire maagkanker en maagkanker cellijnen, behalve de 14q11.2, die slechts vijf cellijnen werd veranderd.
Exemplaarnummer gekoppeld genexpressie verandert
totaal 256 individuele genen (10% van alle genen in het terugkerende chromosomale regio's met een kopie aantal wijzigingen) vertoonden ten minste een 2-voudige aantal kopieën geassocieerd verandering in hun expressie (range 2,0-34,6, mediaan 3,8) (Extra file 3: kopiëren is gekoppeld gen expressie veranderingen). 226 van deze genen werden tot overexpressie gebracht en gelegen in terugkerende regio's van de kopie aantal winsten, terwijl 30 genen werden underexpressed en gelegen in terugkerende regio's van copy number verliezen. Voudige verandering in genexpressie werd berekend door de expressieniveaus van monsters met kopie-aantal veranderingen aan monsters met een normale kopie aantal in een bepaald gen. Daarom is een positieve fold change verwijst naar een copy number winst gerelateerde toename in genexpressie terwijl een negatieve fold change verwijst naar een aantal kopieën verlies gerelateerde afname van de genexpressie.
HHIPL2
(HHIP-achtig 2) gen, versterkt in de 1q41-q43.1 regio, toonde de hoogste copy number winst geassocieerd overexpressie bij maagkanker volgens de geïntegreerde microarray-analyse (FC = 26,9). In het algemeen, de hoogste genexpressie fold veranderingen tussen de monsters van kanker met en zonder copy number winsten werden gedetecteerd bij het 19q regio sinds uit de 40 genen tonen > 5-voudige copy number geassocieerde veranderingen in hun expressie, 19 (47,5%) waren gevestigd in het 19q regio (Extra file 3: kopiëren is gekoppeld genexpressie veranderingen). De meest underexpressed-gen in de steeds terugkerende gebieden van copy number verliezen was ALPK2
(alfa-kinase 2) (FC = -34,6) gevestigd in 18q12.3-q22.2.
Eerder drie studies door ons en anderen gepubliceerd die systematisch integreren genoom-brede aantal kopieën en genexpressie data naar genen waarvan de expressie is veranderd te identificeren als gevolg van een aantal kopieën verandering in maagkanker [15-17]. De vergelijking van de overlappende genen tussen deze studies en de huidige studie bleek 20 genen TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), MTAP
(9q21 0,3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), ERBB2
(17q12-Q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ) SGK2
(20q13.2) en TUBB1
(20q13.32) die ofwel behaald en overexpressie gebrachte of verwijderd en underexpressed in onze studie en in ten minste één van de eerder gepubliceerde studies. Eerder gepubliceerde gegevens alsook de huidige resultaten verder bewijs van de biologische rol van deze genen bij maagkanker.
Validatie potentiële maagkanker doelwitgenen
Realtime qRT-PCR analyse toonde aan dat de expressie van HHIPL2
was 7,4 keer hoger bij maagkanker monsters vergeleken met de nonmalignant maag weefsels (p < 0,05). Bovendien werd de overexpressie van HHILP2
significant geassocieerd met copy number gain (p <0,05) als uitdrukking van HHIPL2
17,4-voudig hoger in kankermonsters met copy number winst van HHIPL2
(g1 ) dan bij kanker monsters normale aantal kopieën van dit gen (g0) (tabellen 3 en 4). Volgens de qRT-PCR-analyse was er een 2,9-voudige onderexpressie van ALPK2
in maagkanker met copy number verliezen (G1) in vergelijking met maagkanker met normale kopie aantal ALPK2
(G0) (p < 0,05 ). Verrassend echter de expressie van ALPK2
van maagkanker in het algemeen 1,9-voudig hoger (p < 0,05) dan in de nonmalignant gastrische weefsels (tabellen 3 en 4). Histologische subtype of TNM-stadium had geen statistisch significant effect op de expressie van HHIPL2 golfreizen of niet ALPK2
(tabel 3) .table 3 Resultaten van de niet-parametrische Mann-Whitney test voor de qRT-PCR en TRAC analysegegevens (SPSS17.0).
Gene
Chromosome
Cancer vs. niet-kwaadaardige
intestinale vs. diffuse
g1 vs. G0
M0 vs. M1
T1-2 vs. T3-4

N0 versus N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0.05
p = 0,104

p
< 0.05
p = 0,451

p = 0,072

p = 0,378

ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0.001
p = 0,319

p = 0,396

p = 0,208

p = 0,232

p = 0,289

CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0.001
p = 0,061

p = 0,254

p = 0,543

p = 0,197

p = 0,253

CYP3A4
7q21.1
p <

• Prognostische betekenis van neutrofielen lymfocyten ratio en bloedplaatjes lymfocyten verhouding in gevorderde maagkanker patiënten behandeld met FOLFOX chemotherapy
• Een nieuwe methode, digitaal genoom scannen detecteert KRAS genamplificatie bij maagkanker: betrokkenheid van overexpressie wild-type KRAS in downstream signalering en kankercel growth