Genome vsej število kopij genov in analiza izraz primarnih želodčnih tumorjev in želodčnega raka celičnih linijah

Genome vsej število kopij genov in analiza izraz primarnih želodčnih tumorjev in celičnih linij raka želodca
Abstract
Ozadje
raka želodca, je eden od najpogostejših malignih bolezni po vsem svetu, in drugi najpogostejši vzrok raka povezanih smrti. Gene kopiranje število sprememb imajo pomembno vlogo pri nastanku raka želodca in spremembo genov številu kopij je eden glavnih mehanizmov za rakave celice za nadzor izražanje možnih onkogenov in zaviralnih genov.
Metode
da bi poudarili gene morebitnih bioloških in klinično pomembni pri raku želodca, smo izvedli sistematično, ki temelji na niz raziskavo o izražanju genov in kopiranje ravni število v osnovnih želodčnih tumorjev in želodčnega raka celičnih linijah in potrdili rezultate s pomočjo analize prepis temelji zajem afiniteto ( Trac test) in v realnem času QRT-PCR.
Rezultati
celostne analize mikromrež pokazala povsem 256 genov, ki so nahajajo v ponavljajočih regijah dobička ali izgube in so imeli vsaj povezano spremembo 2-krat kopija Številčno v svojih izražanje genov. Ravni izraz za 13 od teh genov, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, erbB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
PNMT
, PTPRA
in OSMR
, so bili potrjeni v skupno 118 želodca vzorcev z uporabo bodisi QRT-PCR ali TRAC testom. Vse te 13 genov so različno izražena med rakavimi vzorcev in nemaligna tkiva (p < 0,05) in povezave med število kopij ter izražanja genov sprememb je bilo potrjenih za devet (69,2%) teh genov (p < 0,05).
Zaključek
Skratka, integrirano izražanje genov in število kopij analize mikromrež poudaril gene, ki so lahko ključnega pomena za želodčne rakotvornost. TRAC in QRT-PCR analize potrdil rezultate mikromrež, zato je vloga teh genov, kot potencialnih biomarkerjev za raka želodca.
Ozadja
Zaradi pomanjkanja zgodnjih simptomov želodca adenokarcinom je značilna poznem stadiju diagnozo in nezadovoljivih možnosti za kurativno zdravljenje [1, 2]. Kljub padcu v svoji pojavnosti v zadnjih nekaj desetletjih, želodčni rak ostaja drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu [3]. Približno 90% vseh rakov želodca so adenokarcinomov, ki izhajajo iz epitela [4]. Po razvrščanja želodčnega raka Lauren so razdeljene v dve glavni histoloških podtipe, črevesne in razpršeno [5].
Želodca adenokarcinomov, kot mnogo drugih trdnih tumorjev epitelijskega izvora, so pogosto zapletene v smislu integritete kromosomsko [6, 7]. Maligni želodca tumorjev je znano, da nosijo več aberacije v svojem genomu in tovrstnih kromosomskih sprememb so ključnega pomena za aktivacijo in deaktivacijo povezane z rakom genov [8-17]. Gene sprememba število kopij je eden glavnih mehanizmov za rakave celice za nadzor izražanje genov, ključnih za mobilne preživetja in raka napredovanja [17-22]. Ta številka kopija spremembe pogosto vsebujejo veliko skupino genov, ki se nahajajo blizu drug drugemu v istem kromosomu. Na primer; v želodčnih raka pogosto dopolnjena 17q12-Q21 regija vsebuje gene, kot erbB2
, GRB7
, jup
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
in TOP2A
[14, 17, 23]. Vendar pa je le manjši del teh genov so verjetno pravi voznik rak genov, ki prispevajo k tumorigeneze, medtem ko se drugi lahko dopolnjena zgolj zaradi njihove kromosomske bližine s ciljnimi pomnoževanje genov [24, 25]. Eden od pristopov za razlikovanje teh gonilnikov gene iz osebnih mutacij je vključevanje genom za celotno število kopij in podatke izražanja, ki omogoča identifikacijo genov, katerih transkripcijska aktivacijska ali represije je povezana s spremembo števila kopij v rakavi celici. Tako, s kombiniranjem informacij iz genov število kopij ter izražanja mikromrež z visoko ločljivostjo, je mogoče ne le za določitev prekinitvene točke copy število sprememb v zelo podrobno, ampak tudi za oceno funkcionalne pomen teh sprememb in zato možno identificirati gene, ki vozi raka pojav in napredovanje.
Da bi poudarili gene potencialne kot biomarkerjev ali kliničnih ciljev pri bolnikih z rakom želodca, smo izvedli sistematično raziskavo na diod visoke ločljivosti s številko kopije in izražanja genov ravni v želodčnih tkiv rakom in celičnih linij. Naša analiza temelji diod prejšnje pokazala, da se število kopij dobički in izgube na stotine genov, povezanih z hkratnem povečanju ali zmanjšanju genske ekspresije [17]. V tej študiji smo povečali ločljivost analize števila kopij več kot 20-krat bolj natančno vizualizirati prelomnih točk od števila kopij sprememb v. Poleg tega smo izvedli transkripcijski analize genov, ki se nahajajo v spremenjeni kromosomskih regijah identificirati gene, katerih deregulacija je povezana z malignim fenotipa.
Metode
želodčnega raka tkiva in celične linije
Ta raziskovalni projekt je bil pregledan in odobrila etični odbor oddelka za medicinsko genetiko in kirurgijo in Kliničnega Review Board Helsinki University Central Hospital dovoljeno. Vzorci želodca tkiva so naprej zbirali od bolnikov, ki so doživeli želodčne operacijo ali gastroskopija v Helsinki University Central Hospital med letoma 1999 in 2007. Informirano soglasje je bilo pridobljeno iz vsake sodelujoče bolnika. Trinajst sveže zamrznjene primarni želodčni rak tkiva in sedem želodčnih rakave celične linije so bile izbrane za analizo mikromrež (tabela 1). Material tkivo sestavljena iz dveh različnih histoloških podvrstami, črevesju (n = 9) in razpršeno (n = 4) in tumorji bili nameščeni na dveh različnih lokacijah v želodcu, korpusa (n = 8) in antruma (n = 5 ). Izdanih je bilo 111 želodca tkiva in 7 želodčnih rakave celične linije so bile vključene v QRT-PCR in zajemanje afiniteta temelji Prepis test (TRAC) analize (Dodatne datoteke 1: Klinični parametrov). Vzorci tkiva sestavljena iz 43 nemaligna in 68 rakavih želodčnega tkiva in so bili zastopani obe histološke podvrste raka želodca (črevesne, n = 42, difuzna, n = 25; eden od neznano histologijo). Vzorce želodčne tkiva smo hranili pri -80 ° C. Če želite preveriti odstotek tumorja in histologijo vzorcev, so bili zamrznjeni vzorci vgrajeni v Tissue-Tek ČDO spojine (Sakura Finetek, Torrance, CA, ZDA) in 5 mikrometrov zamrznjenega ledu oddelkov so pripravili in obarvajo z uporabo Trypan Blue. Histologija želodčnih vzorcev raka je ocenil izkušeni patolog (M.-L. K.-L.). Tissue-Tek je bil odstranjen iz tkiva pred nukleinske kisline, extractions.Table 1 kliničnih parametrov analiziranih vzorcih na paleto primerjalne genomske hibridizacije (aCGH) in izražanja mikromrež.
Primary želodca tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Želodčne rakave celične linije
starost /spol
Histologija
izvora
AGS
54 /F
Adeno-karcinom
Primarni tumor
KATOIII
55 /M
difuzna
plevralni izliv
MKN-1
72 /M
adeno-ploščatocelični karcinom
bezgavko metastaze
MKN-7
39 /M
Črevesne
limfnega vozla metastaze
MKN-28
70 /F
Črevesne
limfnega vozla metastaze
MKN-45
62 /F
razpršenih
metastaz jeter
TMK-1
21 /M
razpršenih
bezgavko metastaze
AGS in KATOIII celične linije so bile pridobljene iz American Type Culture Collection (Rockville, MD, ZDA) in MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, in TMK-1 celične linije so bile neke vrste darilo Hiroshi Yokozaki, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, Japonska [26]. AGS celice gojimo v Kaighn je F12 mediju (2 mM glutamina, 10% FBS, 100 U /ml penicilin-streptomicin), KATOIII celice v IMDM medija (2 mM glutamina, 10% FBS, 100 U /ml penicilin-streptomicin) in vseh druge celične linije v RPMI-1640 medij (10% FCS, 2 mM glutamina, 100 E /ml penicilina-streptomicina). Vse celice smo gojili pri 37 ° C in 5% CO 2.
RNK in ekstrakcija DNA
Pred RNA in DNA ekstrakcije, zamrznjeno tkivo je potopljen v RNAlater-ICE reagenta (Ambion, Austin, TX , ZDA) in shranili pri -80 ° C za 16 ur, da stabilizira RNA. Polovico vzorca tkiva (~ 25 mg) smo homogenizirali v RLT-β-merkaptoetanola liznega pufra (RNeasy mini kit, Qiagen Inc., Hilden, Nemčija) in druga polovica v ATL-pufra (DNeasy krvi in ​​tkiv Kit, Qiagen) z Ultra-Turrax homogenizatorjem (IKA delavcev, Wilmington, NC, ZDA). RNA je bila vzeta s kompletom za RNeasy mini, vključno z izbirno zdravljenje DNaze in DNA z DNeasy krvi in ​​Tissue Kit. Za želodčnih raka celičnih linij, 1 x 10 7 celice smo lizirali brizgo in iglo bodisi RLT-β-merkaptoetanola liznega pufra ali ATL-pufrom pred RNK in DNK ekstrakciji oz. RNA in DNA koncentracije so bile izmerjene z uporabo NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) in kakovost RNA je bila ocenjena s pomočjo Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, ZDA). Samo RNA, ki prikazujejo različne 18S in 28S ribosomske vrhove v analizo Bioanalyzer in 260/280 razmerja nad 2,0 so bili sprejeti za nadaljnjo analizo.
Array CGH in izražanje genov mikromrež analize
smo analizirali trinajst želodčnih tumorjev in sedem želodčnih rakave celične linije na 244K Human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Trije tumorji in vseh sedmih celičnih linij so bili tudi analizirani z uporabo 44K Cela človeškega genoma genske ekspresije oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (slika 1). Srednje 260/280 razmerja teh vzorcev je bilo 2,1 za RNA in 1,8 DNA, in vsi vzorci RNA imel jasne 18S in 28S ribosomske vrhove pri analizi Bioanalyzer kaže dobre kakovosti (podatki niso prikazani). Array CGH eksperimenti so bili izvedeni s pomočjo človeškega genoma CGH Mikromrežni 244A komplet (Agilent Technologies). Označevanja in hibridizacije smo izvedli po protokolu Agilent (5.0, junij 2007). Na kratko, je bilo 1,5 mikrogramov vzorca DNK in 1,5 ig spolnega ujema referenčno DNK (človeške genomske DNA, Promega, Madison, WI, ZDA), dvojno razgradili z AluI
in RSAI
restrikcijskih encimov (Promega). Prebavljena DNA je bil označen z Agilent genomske DNA označevanje Kit Plus. Vzorec DNK smo označili s Cy5-dUTP in referenčno DNK s Cy3-dUTP oz. Označeno DNA čistimo z Microcon YM-30 filtrov (Millipore, Billerici, MA, ZDA). Po čistilne, vzorcev in referenčne DNA združimo in hibridiziramo v paleto s 50 ug človeškega Zibelka-1 DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) na 65 ° C, 20 min pri 40 h. Hibridizacija je bila opravljena z Agilent Oligo aCGH hibridizacija Kit. Pred skeniranjem, so drsi izperemo skladu s protokolom. Poleg hibridizacije v vzorcu DNA so opisani zgoraj, je bila omenjena ženska DNA (Cy3) hibridiziramo proti referenčni ženskega DNA (Cy5) v skladu z istim protokolom, ki se uporablja kot referenčno niz v analizi podatkov aCGH. Slika 1 Shema opisuje različne faze študije.
Genske ekspresije eksperimenti so bili izvedeni s pomočjo Whole Human Genome Oligo mikromrež komplet (Agilent Technologies), in označevanja in hibridizacije v skladu s protokolom Agilent (v5.7, marec 2008). Na kratko, 2 ug celotne RNA vzorca in referenčno RNA (bazen celičnih linij 10 rakavih, non-želodca, ATCC, Manassas, MA, ZDA) sta označeni z Agilent Quick Amp označevanja Kit. Vzorec RNA je bila označena z Cy5-dCTP in referenčno DNK s Cy3-dCTP oz. Označene RNA smo potem očistili z uporabo RNeasy mini spin stolpce (Qiagen). Hibridizacijo smo izvedli s Agilent Gene Expression hibridizacijo Kit in vzorce smo hibridizirali pri 65 ° C, 10 min pri 17 h in jo sprali v skladu s protokolom pred skeniranjem. Oba aCGH in genov izraz mikromrež drsi bilo skeniranih z DNA mikromrež Scanner (Agilent Technologies) in analizirali z Feature Pridobivanje programske opreme (v9.5.1.1.).
Število kopij visoke ločljivosti profiliranje
Vsi številka kopije podatkov na voljo na spletni strani http: //. www cangem org (število pristop: CG-EXP-49). [27]. CGH software Analytics Agilent (v3.5.14) je bila uporabljena za ugotavljanje sprememb števila kopij. podatkov mikromrež je kakovost filtrira z izločena podatke, pridobljene iz analize Feature Extraction. Sonde označenih kot osamelce so bili odstranjeni iz nadaljnje analize. Poleg tega so bile uporabljene naslednje aberacija filtri: Najmanjše število sond v regiji = 3, minimalna absolutna log 2 razmerje za regijo = 0,27, in največje število zmotna regije = 1000. log 2 Razmerje od 0,27 ustreza 1,2-kratno spremembo v številu kopij. V CGH Analytics je bil vsak razmerje aCGH najprej pretvoriti v dnevnik 2 razmerje, ki mu sledi Z-normalizacije. Moški vs ženski referenčno zaporedje smo uporabili kot umeritveni niz pri analizi podatkov. Zaradi razlik spolnih med nizi, ki lahko povzročijo pristranskosti v analizi so kromosomi X in Y izključene iz kalibracije. ADM-2 algoritem z mejno vrednostjo 12,0 je bila uporabljena za identifikacijo genov kopiranja število sprememb v posameznih vzorcih in celičnih linij. so bili izračunani minimalni skupni regije sprememb v 20 vzorcev, vključno z velikostjo in kromosomske položaju spremembe v baznih parov. Aberacija je bila opredeljena kot ponavljajočega se, če bi bil prisoten v vsaj 25% vzorcev (tabela 2) .table 2 Minimalne skupne regije ponavljajočim (≥25%) število kopij sprememb.
Sprememba
tkiva (n = 13)
Celične linije (n = 7)
frekvenca

Velikost (Mb)
Položaj (Mb)
možne ciljne geni
+ 1q41-q43.1
2
3
25 %
17.30
216,31-233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1
1
4
25%
19.41
30,18-49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1
4
3
35%
4,60
97,33-101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3
3
2
25%
19,8
126,45-146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3
6
3
45%
2.23
143,59-145,82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0
5
25%
1,05
22,89-23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1
3
3
30%
0,28
35,02-35,30
erbB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2
2
3
25%
13.65
50,45-64,10
AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter
4
3
35%
29,36
33,89-63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57.94
0.04-57.98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP-7
-9p24.3-p21 0,1
3
4
35%
27.81
1,05-28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2
3
5
40%
26.11
39.48-65.59
Smad7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter
2
5
35%
3,69
70,95-74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1
3
3
30%
4,07
14,37-19,44
HSPA13
-Xq28
4
1
25%
1,21
152.24- 153,45 -

Število primerov, velikost minimalnih skupnih regije (Mb) in kromosomski položaju spremembe (Mb) so označene kot možne ciljne geni. CNV regije niso prikazani v tabeli. . Kopiraj številko dobiček (+), izguba številka kopije (-)
Gene analiza izraz mikromrež
Vse genske ekspresije podatkov je na voljo na spletni strani http: //www cangem org (pristop številka: CG-EXP.. -49) [27]. Rezultati mikromrež so kakovost filtrirati z uporabo napačnih vrednosti, določene s Feature Extraction programske opreme in normalizirali po metodi puhlica, ki je bila vključena v paket programske opreme. analiza izražanje genov je bila omejena na gene, ki se nahajajo v kromosomskih regijah s ponavljajočimi aberacije (tabela 2). Cilj tega pristopa je, da označite spremembe izražanja genov, ki so bile povezane s spremembami v številu kopij gena, in bi tako lahko predstavljajo potencialne onkogeni ali zaviralnih genov s funkcionalno vlogo pri raku. Prvič, mediana razmerje log10 ekspresijo smo izračunali za vse sond, ki ciljajo na isti gen. Potem, v dveh ločenih analiz za dobičke in izgube, je bila v primerjavi mediana raven izražanja vsakega gena med vzorci s kopiranjem število dobiček /izguba in vzorcev z normalnim številom kopij oceniti vpliv števila kopij sprememb v izražanju genov. Gen izraz kratno spremembe (FC) smo izračunali bodisi z deljenjem mediane ekspresijo rakavih vzorcev s srednjo izražanje nemaligna vzorcev ali z deljenjem srednjo izražanje vzorcev raka s številko kopije sprememb (g1) s srednjo izražanje vzorcev raka z običajnim številom kopij (G0). Vsaj bil 2-krat število kopij povezano spremembo izražanja genov pomembna. Na podlagi teh podatkov, 13 geni ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5

CYP3A4, ENAH
, erbB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
PNMT
in PTPRA
, so se odločili, da je treba še dodatno potrjena z analizo in TRAC QRT-PCR (analiza Prepis s pomočjo afinitetno zajetje) preizkus. Rezultati iz celovite analize mikromrež smo primerjali s tremi predhodno objavljenih študij, ki sistematično integracijo število kopij in genska izražanja podatkov o genomu vsej [15-17].
Realnem času analize QRT-PCR
realnem času qRT- PCR smo izvedli 2 genov, ALPK2
(18q21.31-q21.32) in HHIPL2
(1q41). Ravni izraz bile izmerjene v 82 želodčnih tkiva (46 rakasto in 36 nemaligna tkiva) in 7 želodčne raka celičnih linijah (Dodatni datotek 1: Klinični parametri). 1 ug celotne RNA smo pretvorili v cDNA z uporabo virusa Moloney-mišje levkemije reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI, ZDA) in naključne primerjev (Invitrogen) v volumnu 50 ul za 1 uro pri 37 ° C. Reakcija je bila toplotno inaktiviramo (95 ° C, 3 min) in dopolnimo do končnega volumna 200 ul z molekularno razred vodo. Prepisi so kvantitativno uporabo izdelkov genske ekspresije Testi-na-DemandTM (Hs01085414_m1 za ALPK2
in Hs00226924_m1 za HHIPL2
) po protokolu proizvajalca (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Vse primerji so se nahajali na ekson-eksonu meja. Na kratko smo 2 ul iz cDNA predlogo zmešamo z 1,25 ul specifičnih primerjev in sond, označene z FAM-reporterskim barvilom. 12.5 xl TaqMan ® Universal PCR izhodiščne in RNazo proste vode dodamo k skupnim volumnom 25 ul. Human 18S rRNA služil kot endogeni nadzor normalizirati raven izražanja v naslednjem kvantitativno analizo. Sonda 18S je bila označena z VIC-reporter barvilom, da multipleks PCR s ciljnimi geni. Pogoji PCR so bili naslednji: 50 ° C za 2 min, 95 ° C za 10 minut, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 15 sekund in 60 ° C 1 min. Vsak vzorec je bil izmerjen v trojniku in podatke smo analizirali z metodo delta-delta za primerjanje relativne rezultatov izrazom (2 - [kontrolni vzorec Ct-Ct])
Trac vsebnosti
analize transkripta s pomočjo. afiniteto zajem (TRAC) test [28] je bilo opravljeno za 11 različnih genov v 88 želodčnega tkiva (53 rakavi in ​​35 nemaligna tkiva) in 7 želodčnega raka celičnih linijah (Dodatni datotek 1: Klinični parametri). Geni vključeni v analizo so bili ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1),
CYP3A4 (7q21.1) ASAP1
(8q24.1-q24.2), LTB4R
(14q11.2-Q12), PERLD1
(17q12), erbB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-V13 0,2), PTPRA
(20p13), in MMP9
(20q11.2-q13.1). Prednost TRAC testa je, da se ekspresijski nivoji več genov lahko meri istočasno iz enega samega vzorca s tem zmanjša količino vzorca RNA potreben za analizo. To je še posebej pomembno za analizo pogosto omejenih vzorcev kliničnih tkiva.
Analiza TRAC je bila izvedena na PlexPress (Helsinki, Finska). Meri TRACPackTM reagenti za mRNA (PlexPress) so bile uporabljene v analizi. Na kratko, 90 ul hibridizacije Mix (vsebujejo označene sonde za odkrivanje genskih specifične in Biotinilirane oligo-dT sonde) na vrtino se je odpraviti na 96-dobro PCR plošče. Dve mikrogramov RNA vzorca smo uporabili za vsako vdolbino v 100 ul celotni reakcijski volumen. Enaka količina (30 Amol /reakcija) enojna nasedlega 62-mer sintetičnega kontrolo oligonukleotid hibridizacijo, vključno s poli-A repa, dodamo vsakemu vzorcu pred hibridizacije. Hibridizacijo smo izvedli pri 60 ° C, 650 rpm 120 minut (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Nemčija). Po zajemu hibridizacija afinitetno, čiščenje in elucijo so bile narejene s pomočjo vodomca Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska), magnetni procesorja delcev. -Streptavidin povezan magnetni kroglice TRACPACK ™ (50 ug, PlexPress) dodamo k zmesi hibridizacije in pustimo, da se veže na biotiniliranega mRNA-sondo-oligo (dT) -hybrids 30 minut, nakar so bile krogljice 5-krat sprali s pomočjo pranje buffer, da odstranite vse nevezan material. Označene RNA specifične sonde eluiramo z elucijskim pufrom in odkrita s kapilarno elektroforezo, z ABI3100 sekvencer (Applied Biosystems, Cheshire, Velika Britanija). Podatke smo analizirali z uporabo programske opreme TRACParser (PlexPress).
Statistična analiza podatkov QRT-PCR
A neparametricnim testom Mann-Whitney za dva neodvisna vzorca je bila uporabljena za določitev statistične pomembnosti razlik v relativni ekspresijo mRNA ravni ALPK2
in HHIPL2
v nemaligna in rakavih želodčne vzorcev kot tudi v vzorcih želodčne rakom različnih histoloških podtipov ali TNM-fazah. A p-vrednost < 0.05 smo imeli za statistično značilne (SPSS 17,0). Poleg tega so v dveh ločenih analiz za dobički in izgubami, stopnje izraženosti v vzorcih z rakom, pri papirju dobička ali izgube število (g1) smo primerjali z vzorci z rakom, pri normalnem številu kopij (G0), da se oceni povezavo med številom kopij in genske ekspresije. Podatki izvod številka bili na voljo za 37 želodca vzorcev, vključenih v analizo QRT-PCR (Dodatni datotek 1: Klinični parametri). Gene izraz kratno spremembe smo izračunali tako, da pomeni izraz ene skupine (npr vzorcih raka), ki jih pomeni izraz druge skupine (npr nemaligna vzorcev).
Statistična analiza podatkov TRAC testnimi
A sintetično nadzor hibridizacija je bila uporabljena v normalizacijo podatkov, da odstranite vse, ki niso biološko razlike v podatkih. Za vsako tarčo, signalizirati intenzivnosti relativne te notranje kontrole hibridizacije so izračunane. Za vzorce tkiva devetih analiziranih v ponovitvenih pomeni bila uporabljena jakost signala. Nanesemo neparametrični Mann-Whitney test za dva neodvisna vzorca za ugotavljanje statistične pomembnosti razlik v relativnih ravni mRNA izraženosti ASAP1
, CEACAM5
,
CYP3A4, ENAH
, erbB2, LTB4R
MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
in PTPRA
in nemaligna in rakavih želodčne vzorcev kot tudi v vzorcih želodčne rakom različnih histoloških podtipov ali TNM-fazah. A p-vrednost < 0.05 smo imeli za statistično značilne (SPSS 17,0). Primerjava ravni izražanja genov v vzorcih z in brez papirju število sprememb smo izvedli kot je bilo opisano prej za analizo QRT-PCR. . So bili na voljo za 43 želodčnih vzorcih raka podatki kopija število vključenih v analizo TRAC testa
Rezultati
Gene število kopij aberacije
Vse gen obrazec številka spremembe v posameznih vzorcev so prikazani v dodatni datoteki 2: Kopiranje število sprememb zaznati z analizo aCGH. Minimalni skupni regije ponavljajočim (≥25%) sprememb, kot tudi njihov obseg, pogostost, možne ciljne geni in kromosomi položaj v baznih parov so prikazani v tabeli 2. Ponovitev dobil regije so se nahajali na 1q41-q43.1 (25% ) 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%) in 20p13-qter (40%). Ponavljajoči izbrisan regije so se nahajali na 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %) in Xq28 (25%). Vse ponavljajoče kopiranje spremembe številka bilo mogoče zaznati tudi v primarnih želodčnih raka in raka na želodcu celičnih linijah, razen 14q11.2, ki je spremenila le v petih celičnih linijah.
Kopiranje številko povezano izražanje genov spreminja
Skupaj 256 posamezniku genov (10% vseh genov, ki se nahajajo v ponavljajočih se kromosomskih regijah z števila kopij spremembami) je pokazala, vsaj 2-krat številko copy povezano spremembo v svojem izrazu (razpon 2,0-34,6, mediana 3.8) (Dodatni datoteka 3: Kopiraj številko povezan gen spremembe izražanje). 226 od teh genov so prekomerno in se nahaja v ponavljajočih regijah število kopij dobička, medtem ko je bilo 30 genov underexpressed in se nahaja v ponavljajočih regijah izgub števila kopij. Kratna sprememba v izražanju genov je bila izračunana na podlagi primerjave ravni izražanja vzorcev s številko kopije sprememb na vzorcih z običajnim številom kopij na določenem genu. Zato je pozitivna sprememba krat sklicuje na podobno število kopij dobiček povečanje genske ekspresije ker negativna sprememba krat nanaša na povezane izgube število kopij zmanjšanju genske ekspresije.
HHIPL2
(HHIP podoben 2) gen, ojačani v 1q41-q43.1 regiji, je pokazala najvišje število kopij dobiček povezano čezmerno pri raku želodca po celovite analize mikromrež (FC = 26,9). Na splošno je najvišja izražanje genov krat spremembe med vzorci z rakom, in ne na papirju številka dobičkov so bile odkrite na 19q regiji, saj iz 40 genov, ki kažejo > so se nahajali 5-kratno število kopija, povezanih sprememb v njihovem izražanju, 19 (47,5%) v 19q regije so (Dodatni datotek 3: spremembe Kopiranje številka, povezana izražanja genov). Najbolj underexpressed gen v ponavljajočih regijah izgub število kopij je ALPK2
(alfa-kinaze 2) (FC = -34,6), ki se nahaja na 18q12.3-q22.2.
Pred tem je tri študije z nami in drugimi so bile objavljene, ki sistematično integracijo število kopij in genska izražanja podatkov o genomu vsej identificirati gene, katerih izražanje se je spremenila zaradi števila kopij spremenjenega rakom želodca [15-17]. Primerjava prekrivajočih genov med temi študijami in aktualna študija je razkrila 20 genov TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43)
CYP3A4 (7q21.1), MTAP
(9q21 0,3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), erbB2
(17q12-Q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2), in TUBB1
(20q13.32), ki so bodisi pridobljene in prekomerno ali odstranjena underexpressed v naši raziskavi in ​​v vsaj enem od predhodno objavljenih študij. Predhodno objavljene podatke skupaj s sedanjimi rezultati predložijo dodatne dokaze o biološki vlogi teh genov pri raku želodca.
Validacija potencialnih želodca ciljnih rak genov
realnem času QRT-PCR analiza je pokazala, da je izraz HHIPL2
je 7,4-krat večja pri vzorcih raka želodca v primerjavi z nemaligna želodčnega tkiva (p < 0,05). Poleg tega je bilo prevelike količine HHILP2
značilno povezana z števila kopij dobiček (p < 0,05) kot izraz HHIPL2
je bila 17,4-krat večja pri vzorcih z rakom števila kopij dobiček HHIPL2
(g1 ) kot v vzorcih raka z normalnim številom kopij tega gena (G0) (tabeli 3 in 4). Glede na analizo QRT-PCR je bila 2,9-krat premalo izraženo ALPK2
v želodcu raka z izgubami števila kopij (g1) v primerjavi z želodčnih raka z normalnim številom kopij za ALPK2
(G0) (p < 0,05 ). Presenetljivo pa je bil izraz ALPK2
v želodcu raka na splošno 1,9-krat večja (p < 0,05) kot v nemaligna želodčnega tkiva (tabeli 3 in 4). Histološki podtip ali TNM fazi ni bilo statistično značilno vpliva na izražanje HHIPL2
ali ALPK2
(tabela 3) .table 3 Rezultati neparametrični preizkus Mann-Whitney za QRT-PCR in podatke analize TRAC (SPSS17.0).
Gene
kromosomov
Rak vs. non-maligna
intestinal vs. difuzna
g1 vs g0
M0 vs. M1
T1-2 vs. T3-4

N0 vs. N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0.05
p
= 0,104
p
< 0.05
p
= 0,451
p
= 0,072
p
= 0,378
ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0,001
p
= 0,319
p
= 0,396
p
= 0,208
p
= 0,232
p
= 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0,001
p
= 0,061
p
= 0,254
p
= 0,543
p
= 0,197
p
= 0,253
CYP3A4
7q21.1
p <

• Prognostični pomen razmerja nevtrofilcev limfocitov in razmerje limfocitov trombocitov pri bolnikih z napredovalo želodca z rakom, zdravljenih s FOLFOX chemotherapy
• Roman metoda, digitalni genom skeniranje zazna KRAS amplifikacijo gena v želodcu raka: udeležba prekomerno divjim tipom KRAS v prodajnem signalizacijo in raka celice growth