Genome-wide genkopitallet og uttrykk analyse av primære mage svulster og mage kreft cellelinjer

Genome-wide genkopitallet og uttrykk analyse av primære mage svulster og magekreft cellelinjer
Abstract
Bakgrunn
Magekreft er en av de vanligste kreftformen i verden og den nest vanligste årsaken til kreft dødsfall. Genkopitallet endringer spiller en viktig rolle i utviklingen av magekreft og en endring i genkopitallet er en av hovedmekanismene for en kreftcelle for å kontrollere ekspresjonen av potensielle onkogener og tumorsuppressorgener.
Methods
for å fremheve gener av potensiell biologisk og klinisk relevans i magekreft, gjennomførte vi en systematisk rekke basert undersøkelse av genekspresjon og kopiere antall nivåer i grunnskolen mage svulster og mage kreft cellelinjer og validert resultatene med en affinitet fangst basert transkripsjon analyse ( TRAC analyse) og real-time QRT-PCR.
Resultater
Integrert microarray analyse avdekket til sammen 256 gener som lå i tilbakevendende regioner av gevinster eller tap og hadde minst en to-fold kopi nummer-forbundet endring i deres genuttrykk. Uttrykket nivåer av 13 av disse genene, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, erbB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
, PNMT
, PTPRA
, og OSMR
, ble validert i totalt 118 mage prøver å bruke enten QRT-PCR eller TRAC analysen. Alle disse 13 genene ble uttrykt forskjellig mellom kreft prøver og ikke-ondartede vev (p 0,05) og assosiasjonen mellom kopitall og genekspresjon endringer ble validert for ni (69,2%) av disse genene (p 0,05).
Konklusjon
i konklusjonen, integrert genekspresjon og kopi nummer microarray analyse uthevet gener som kan være kritisk viktig for magekreftutvikling. TRAC og QRT-PCR-analyser validert microarray resultater og dermed rollen av disse genene som potensielle biomarkører for magekreft.
Bakgrunn
På grunn av mangel på tidlige symptomer adenokarsinom i ventrikkel er preget av sent stadium diagnose og utilfredsstillende muligheter for kurativ behandling [1, 2]. Til tross for nedgangen i sin forekomst i de siste tiårene, er fortsatt magekreft den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden [3]. Omtrent 90% av alle mage-kreft er adenokarsinomer som oppstår fra Epitel [4]. Ifølge Lauren klassifiserings mage kreft er delt inn i to hoved histologiske subtyper, tarm og diffuse [5].
Gastric adenokarsinomer, som mange andre solide tumorer av epitel opprinnelse, er ofte komplekse med tanke på kromosom integritet [6, 7]. Ondartede mage svulster er kjent for å bære flere avvik i deres genom og slike kromosom endringer er avgjørende for aktivering og inaktivering av kreftrelaterte gener [8-17]. Genkopitallet endringer er en av de viktigste mekanismene for en kreftcelle for å kontrollere uttrykket av gener sentrale til celle overlevelse og kreft progresjon [17-22]. Disse kopi antall endringer ofte innebære en stor gruppe av gener som befinner seg nær hverandre i det samme kromosomet. For eksempel; i mage kreft den ofte forsterket 17q12-Q21 regionen inneholder gener som ErbB2
, GRB7
, JUP
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
, og TOP2A
[14, 17, 23]. Men bare et fåtall av disse genene er sannsynlig å være den sanne kreft driver gener som bidrar til tumorigenesis, mens andre kan bli forsterket bare på grunn av deres kromosom nærhet med forsterkning målgener [24, 25]. En fremgangsmåte for å skille slike driver gener fra passasjer mutasjoner er å integrere genom-bred kopiantall og ekspresjonsdata, som muliggjør identifisering av gener hvis transkripsjonen aktivering eller undertrykkelse er forbundet med et kopiantall endring i en kreftcelle. Således, ved å kombinere informasjonen fra høyoppløselige genkopitallet og uttrykk mikromatriser, er det mulig ikke bare å definere stoppunkter for kopitall endringer i stor detalj, men også for å vurdere den funksjonelle betydningen av disse endringene og derfor muligens identifisere gener som driver kreft utbruddet og progresjon.
å markere gener potensielle biomarkører eller kliniske mål i magekreft, gjennomførte vi en systematisk høy oppløsning matrise-basert undersøkelse av eksemplar nummer og genuttrykk nivåer i mage kreft vev og cellelinjer. Vår tidligere matrise-basert analyse viste at kopitall gevinster og tap av hundrevis av gener er assosiert med en samtidig økning eller reduksjon i genuttrykk [17]. I denne studien har vi økt oppløsningen av kopien nummer analyse over 20 ganger mer nøyaktig visualisere de svake punktene på kopien antall endringer. Videre har vi gjennomført en transkripsjonen analyse av gener som ligger i endrede kromosom regioner for å identifisere gener som deregulering er assosiert med malign fenotype.
Metoder
magekreft vev og cellelinjer
Dette forskningsprosjektet har blitt anmeldt og godkjent av etisk komité ved Institutt for medisinsk genetikk og kirurgi og godkjent av Clinical Review Board of Helsinki University Central Hospital. Gastric vevsprøver ble prospektivt samlet inn fra pasienter som gjennomgikk mage kirurgi eller gastroskopi i Helsinki University Central Hospital mellom 1999 og 2007. Informert samtykke ble innhentet fra hver deltakende pasient. Tretten Dypfryst primære mage kreft vev og sju magekreftcellelinjer ble valgt for microarray analyse (tabell 1). Vevet materiale besto av to forskjellige histologiske undertyper, intestinal (n = 9) og diffuse (n = 4) og tumorene ble plassert på to ulike steder av magen, corpus (n = 8) og antrum (n = 5 ). Til sammen 111 mage vev og 7 mage kreft cellelinjer ble inkludert i QRT-PCR og tilhørighet fangstbasert karakteranalyse (TRAC) analyser (tilleggsfiler 1: Kliniske parametre). Vevsprøver besto av 43 nonmalignant og 68 kreft mage vev og begge histologiske subtyper av magekreft var representert (intestinal, n = 42; diffus, n = 25, en av ukjent histologi). Gastriske vevsprøver ble lagret ved -80 ° C. Hvis du vil kontrollere svulsten prosent og histologi av prøvene ble det frosne prøvene innebygd i Tissue-Tek oktober Forbindelse (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) og 5 mikrometer frossen is-seksjoner ble utarbeidet og farget ved hjelp av trypanblått. Histologi av magekreft prøver ble vurdert av en erfaren patolog (M.-L. K.-L.). Tissue-Tek ble fjernet fra vev før nukleinsyremolekyler extractions.Table 1 Kliniske parametre for de analyserte prøvene på rekke komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og uttrykk mikromatriser.
Primær gastric tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Gastric kreftcellelinjer
Alder /kjønn
Histologi
Origin
AGS
54 /F
Adeno-karsinom
primær tumor
KATOIII
55 /M
Diffuse
Pleuraeffusjon
MKN-en
72 /M
Adeno-plateepitel karsinom
lymfeknutemetastase
MKN-7
39 /M
Tarm
lymfeknutemetastase
MKN-28
70 /F
Tarm
lymfeknutemetastase
MKN-45
62 /F
Diffuse
levermetastaser
TMK-1
21 /M
diffust
lymfeknutemetastase
AGS og KATOIII cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) og MKN-1 MKN-7 , MKN-28, MKN-45, og TMK-1 cellelinjer var en slags gave fra Hiroshi Yokozaki, Kobe universitet Graduate School of Medicine, Kobe, Japan [26]. AGS-celler ble dyrket i Kaighn F12-medium (2 mM glutamin, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-streptomycin), KATOIII celler i IMDM-medium (2 mM glutamin, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-streptomycin) og alle andre cellelinjer i RPMI-1640 medium (10% FCS, 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin-streptomycin). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO 2.
RNA og DNA-ekstraksjon
Forut for RNA- og DNA-ekstraksjoner av det frosne vev ble nedsenket i RNAlater-ICE-reagens (Ambion, Austin, TX , USA) og lagret ved -80 ° C i 16 timer for å stabilisere RNA. Halvparten av vevsprøve (~ 25 mg) ble homogenisert i RLT β-merkaptoetanol lyseringsbuffer (RNeasy Mini Kit, Qiagen Inc., Hilden, Tyskland) og den andre halvparten i ATL-buffer (DNeasy blod og vev Kit, Qiagen) ved hjelp av Ultra-Turrax homogenisator (IKA Works, Wilmington, NC, USA). RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy Mini Kit, inklusive valgfri DNase-behandling, og DNA ved hjelp av DNeasy blod og vev Kit. For gastrisk kreft-cellelinjer, 1 x 10 7-celler ble lysert ved anvendelse av en sprøyte og nål i enten RLT β-merkaptoetanol lyseringsbuffer eller ATL-buffer før RNA og DNA-ekstraksjoner, respektivt. RNA og DNA-konsentrasjonene ble målt ved hjelp av NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og RNA kvalitet ble evaluert med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Bare RNA som viser tydelige 18S og 28S ribosomale toppene i Bioanalyzer analyse og 260/280 ratio over 2,0 ble akseptert for videre analyse.
Array CGH og genuttrykk microarray analyser
Tretten mage svulster og sju magekreftcellelinjer ble analysert på 244K human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Tre av svulster og alle de syv cellelinjer ble også analysert ved hjelp av 44K Hele menneskelige genom genuttrykk oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (figur 1). De midlere 260/280 Graden for disse prøvene var 2,1 for RNA og 1,8 for DNA, og alle de RNA prøver hadde klare 18S og 28S ribosomale topper i Bioanalyzer analysen indikerer god kvalitet (data ikke vist). Array CGH eksperimenter ble utført ved hjelp av Human Genome CGH Microarray 244A kit (Agilent Technologies). Merking og hybridisering ble utført i henhold til Agilent protokoll (v5.0, juni 2007). I korte trekk, 1,5 mikrogram av prøve-DNA og 1,5 mikrogram av sex-matchet henvisning DNA (humant genomisk DNA, Promega, Madison, WI, USA) var dobbelt-fordøyd med Alul Hotell og RSAI
restriksjonsenzymer (Promega). Den fordøyd DNA ble merket med Agilent Genomisk DNA Merking Kit Plus. Prøve-DNA ble merket med Cy5-dUTP og referanse-DNA med Cy3-dUTP, respektivt. Merkede DNA ble renset med Microcon YM-30 filtre (Millipore, Bille, MA, USA). Etter rense, prøve- og referanse DNA ble slått sammen og hybridisert til matrisen med 50 ug av Menneskelig Cot-1 DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 65 ° C, 20 rpm i 40 timer. Hybridisering ble utført med Agilent Oligo aCGH Hybridisering Kit. Før skanning, ble platene vasket i henhold til protokollen. I tillegg til de eksempel DNA-hybridiseringer som er beskrevet ovenfor, ble henvisning hann-DNA (Cy3) hybridisert mot henvisning kvinnelig DNA (Cy5) i henhold til den samme protokoll som skal brukes som en referanse matrisen i aCGH dataanalyse. Figur 1 Flytskjema som beskriver ulike trinn i studien.
Genuttrykk ble utført ved hjelp av Whole Human Genome Oligo Microarray kit (Agilent Technologies), og merking og hybridisering henhold til Agilent protokollen (v5.7, mars 2008). I korte trekk, 2 pg av total RNA prøve og referanse-RNA (en pool av 10 cancercellelinjer, ikke-gastrisk, ATCC, Manassas, MA, USA) ble merket ved bruk av Agilent hurtig Amp Labeling Kit. Prøve RNA ble merket med Cy5-dCTP og referanse-DNA med Cy3-dCTP, respektivt. Merket RNA ble deretter renset ved anvendelse av RNeasy minispinnkolonner (Qiagen). Hybridisering ble utført med Agilent Gene Expression hybridisering Kit og prøver ble hybridisert ved 65 ° C, 10 rpm i 17 timer og vasket i henhold til protokollen før skanningen. Begge aCGH og genuttrykk microarray lysbilder ble skannet med DNA microarray Scanner (Agilent Technologies) og analysert med Feature Extraction programvare (v9.5.1.1.).
Kopiantall Høy oppløsning profilering
All kopiantall data er tilgjengelig på http: //www. cangem org (tiltredelse nummer~~POS=HEADCOMP: CG-EXP-49). [27]. Agilent CGH Analytics programvare (v3.5.14) ble brukt for å identifisere kopien antall endringer. Microarray data ble kvalitet filtrert med avvikende informasjon innhentet fra Feature Extraction analyse. Prober merket som uteliggere ble fjernet fra videre analyse. I tillegg ble følgende aberrasjon filtre brukt: minimum antall sonder i regionen = 3, minimum absolutt log 2 ratio for region = 0,27, og maksimalt antall avvik regioner = 1000. log 2-forhold på 0,27 svarer til en 1,2-gangers endring i kopitallet. I CGH Analytics, ble hver aCGH forholdet først omdannes til en log 2-forhold etterfulgt av en Z-normalisering. Den mannlige vs. hunn referansesettet ble anvendt som en kalibreringsenhet i dataanalysen. På grunn av kjønnsforskjellene mellom arrays som kan føre til skjevhet i analysen, ble kromosomer X og Y ekskludert fra kalibreringen. ADM-2-algoritme med et terskelnivå på 12,0 ble anvendt for å identifisere genkopitallet endringer i enkeltprøvene og cellelinjer. Minimale felles regioner av forandringer i de 20 prøvene ble beregnet, inkludert størrelsen og kromosomal plassering av endring i basepar. Et avvik ble definert som tilbakevendende, hvis det var til stede i minst 25% av prøvene (tabell 2) .table 2 Minimal vanlige regioner av tilbakevendende (≥25%) kopiere antall endringer.
Endring
Vev (n = 13)
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP (n = 7)
Frequency

Size (Mb)
Position (Mb)
Mulige målgener product: + 1q41-q43.1
2
3
25 %
17,30
216,31 til 233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8 product: + 5p13.3-q11.1
1 4
25%
19.41
30,18 til 49,60
OSMR, RNASEN product: + 7q21.3-q22.1
4
3
35%
4,60
97,33 til 101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF product: + 8q24.13-q24.3
3
2
25%
19,8
126,45 til 146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3 product: + 8q24.3
6
3
45%
2.23
143,59 til 145,82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0
5
25%
1.05
22,89 til 23,94
LTB4R product: + 17q12-q21.1
3
3
30%
0,28
35,02 til 35,30
ErbB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT product: + 17q22-q24.2
2
3
25%
13.65
50,45 til 64,10
AXIN2, RNF43 product: + 19q12-qter
4
3
35%
29.36
33,89 til 63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1 product: + 20p13-qter
5
3
40%
57.94
0,04 til 57,98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-p21 0,1
3
4
35%
27.81
1,05 til 28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2
3
5
40%
26,11
39,48 til 65,59
SMAD7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter
2
5
35%
3,69
70,95 til 74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1
3
3
30%
4,07
14,37 til 19,44
HSPA13
-Xq28
4
1 25%
1,21
152.24- 153,45 -

Antall tilfeller er størrelsen på minimale felles områder (mb), og kromosom posisjonen til endring (Mb) indikerte samt mulige målgener. CNV regionene er ikke vist i tabellen. . Kopier nummer gevinst (+), kopiere nummer tap (-)
Gene uttrykk microarray analyse
All genuttrykk data er tilgjengelig på http: //www cangem org (tiltredelse Nummer: CG-EXP.. -49) [27]. Microarray resultater ble kvalitet filtrert ved hjelp av uteliggere som er definert av Feature Extraction Programvare og normalisert i henhold til Loess metoden, som ble inkludert i programvarepakken. Genuttrykksanalysen var begrenset til gener som befinner seg i kromosomale regioner med tilbakevendende avvik (tabell 2). Målet med denne tilnærmingen var å markere genuttrykk endringene som ble assosiert med endringer i genkopitallet, og kan derfor representere potensielle onkogener eller tumorsuppressorgener med en funksjonell rolle i kreft. Først ble en median log10 uttrykk ratio beregnes for alle sondene rettet mot samme genet. Så, i to separate analyser for gevinster og tap, ble median uttrykk nivået av hvert gen sammenliknet mellom prøvene med kopi nummer gevinst /tap og prøver med normal kopi nummer for å evaluere effekten av kopinummer endringer på genuttrykk. Genekspresjon fold endringer (FC) ble beregnet enten ved å dividere den midlere ekspresjon av kreftprøvene ved medianen ekspresjon av ikke-ondartede prøver eller ved å dividere den midlere ekspresjon av kreft prøver med kopitall endringer (G1) ved median ekspresjon av kreftprøvene med normal kopi nummer (G0). I det minste en to-gangers kopiantall tilhørende forandring i gen-ekspresjon ble betraktet som signifikant. Basert på disse dataene, 13 gener ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, erbB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
, og PTPRA
, ble valgt ut til å bli ytterligere validert med QRT-PCR-analyse og TRAC (transkripsjon analyse med hjelp av affinitet fangst) analyse. Resultatene fra den integrerte microarray analyse ble sammenlignet med tre tidligere publiserte studier som systematisk integrerer genom-wide kopi nummer og genuttrykk data [15-17].
Real-time QRT-PCR-analyse i sanntid
qRT- PCR ble utført for 2 gener, ALPK2 plakater (18q21.31-q21.32) og HHIPL2 plakater (1q41). Uttrykket nivåene ble målt i 82 mage vev (46 kreft og 36 ikke-ondartede vev) og i 7 mage kreft cellelinjer (Tilleggs fil 1: Kliniske parametre). 1 ug total RNA ble omdannet til cDNA ved anvendelse av Moloney murin leukemi virus-revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA) og vilkårlige primere (Invitrogen) i et volum på 50 pl i 1 time ved 37 ° C. Reaksjonen var varme-inaktivert (95 ° C, 3 min) og fylt til et sluttvolum på 200 ul med molekyl karakter vann. Transkripsjonene ble kvantifisert ved hjelp av analyser-on-DemandTM genuttrykk produkter (Hs01085414_m1 for ALPK2 Hotell og Hs00226924_m1 for HHIPL2
) i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle primere ble plassert på ekson-ekson grenser. I korte trekk ble 2 mikroliter av cDNA templat blandet med 1,25 mL av spesifikke primere og prober merket med FAM-reporter fargestoff. 12,5 ul av TaqMan ® Universal PCR Mastermix og RNase-fritt vann ble tilsatt til et totalvolum på 25 ul. Menneskelig 18S rRNA fungert som en endogen kontroll for å normalisere uttrykket nivåer i den påfølgende kvantitativ analyse. Den 18S-proben ble merket med VIC-reporter fargestoff for å tillate multipleks PCR med de aktuelle gener. PCR-betingelsene var som følger: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Hver prøve ble målt i tre eksemplarer og dataene ble analysert av delta-deltaet metode for å sammenligne relative uttrykk resultater (2 - [Ct sample-Ct kontroll])
TRAC analysen
transkripsjon analyse med hjelp av. affinitet fangst (TRAC) analyse [28] ble utført for 11 ulike gener i 88 mage vev (53 kreft og 35 ikke-ondartede vev) og 7 mage kreft cellelinjer (Tilleggs fil 1: Kliniske parametre). Genene som er inkludert i analysen var ENAH plakater (1q42.12), OSMR plakater (5p13.1), CYP3A4 plakater (7q21.1) ASAP1 plakater (8q24.1-q24.2), LTB4R product: (14q11.2-Q12), PERLD1 plakater (17q12), erbB2 plakater (17q21.1), PNMT plakater (17q21-q22), CEACAM5 plakater (19q13.1-Q13 0,2), PTPRA plakater (20p13), og MMP9 plakater (20q11.2-q13.1). Fordelen med den TRAC analysen er at uttrykket nivåer av multiple gener kan måles samtidig fra en enkelt prøve og dermed redusere mengden av prøve-RNA som er nødvendig for analysen. Dette er spesielt viktig for analyse av ofte begrensede kliniske vevsprøver.
TRAC analyse ble utført ved PlexPress (Helsinki, Finland). Custom TRACPackTM reagenser for mRNA (PlexPress) ble brukt i analysen. I korthet ble 90 ul Hybridisering Mix (inneholdende merket genspesifikke deteksjonsprober og biotinylerte oligo-dT-prober) per brønn ble dispensert til en 96-brønners PCR-plate. To mikrogram RNA-prøven ble påført til hver brønn i en 100 pl totalt reaksjonsvolum. En like stor mengde (30 amol /reaksjon) av enkeltkjedet 62-mer syntetisk oligonukleotid hybridisering kontroll, inkludert en poly-A-hale, ble tilsatt til hver prøve før hybridisering. Hybridisering ble utført ved 60 ° C, 650 rpm i 120 minutter (termomikser komfort, Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Etter hybridisering affinitet fangst, rensing og eluering ble gjort ved hjelp av Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) magnetiske partikler prosessor. Streptavidin-koblet magnetiske TRACPACK ™ kuler (50 ug, PlexPress) ble tilsatt til blandingen og hybridisering tillates å binde til biotinylerte mRNA-probe-oligo (dT) -hybrids i 30 minutter, hvoretter kulene ble vasket 5 ganger ved bruk av vaske buffer for å fjerne ubundet materiale. Merkede RNA-spesifikke prober ble eluert med elueringsbuffer og detektert ved kapillær elektroforese, ved hjelp av ABI3100 sequencer (Applied Biosystems, Cheshire, UK). Dataene ble analysert ved hjelp av TRACParser programvare (PlexPress).
Statistisk analyse av QRT-PCR data, En parametriske Mann-Whitney test for to uavhengige utvalg ble brukt for å bestemme statistisk signifikans av forskjeller i relativ mRNA uttrykk nivåer av ALPK2 Hotell og HHIPL2
i ikke-ondartede og kreft mage prøver samt i magekreft prøver av ulike histologiske subtyper eller TNM-etapper. En p-verdi < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant (SPSS 17.0). I tillegg, i to separate analyser for gevinster og tap, ble uttrykket nivåer i kreftprøver med kopitall gevinster eller tap (G1) i forhold til kreftprøver med normal kopi nummer (G0) for å vurdere sammenhengen mellom kopiantall og genuttrykk. Kopier nummer data var tilgjengelig for 37 av mage prøvene inngår i QRT-PCR-analyse (tilleggsfiler 1: Kliniske parametre). Genekspresjon fold endringer ble beregnet ved å dividere den midlere uttrykk for en gruppe (for eksempel kreft prøver) av den midlere ekspresjon av den andre gruppen (for eksempel ikke-ondartede prøver).
Statistisk analyse av de TRAC analysedataene, En syntetisk kontroll-hybridisering ble anvendt i data normalisering for å fjerne eventuelle ikke-biologisk variasjon i dataene. For hvert mål, signalintensitetene i forhold til denne interne kontroll-hybridisering ble beregnet. For de ni vevsprøver analysert i replikere bety signalintensitet ble brukt. En parametriske Mann-Whitney test for to uavhengige utvalg ble brukt for å bestemme statistisk signifikans av forskjeller i de relative mRNA uttrykk nivåer av ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, erbB2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
, og PTPRA
i ikke-ondartede og kreft mage prøver samt i magekreft prøver av ulike histologiske subtyper eller TNM-etapper. En p-verdi < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant (SPSS 17.0). Sammenligningen av genuttrykk nivåer i prøver med og uten kopinummer endringer ble utført som ble beskrevet tidligere for QRT-PCR-analyse. . Kopier nummer data var tilgjengelige for 43 mage kreftprøver inkludert i TRAC analysen analysen
Resultater
genkopitallet avvik
All genkopitallet endringer i enkeltprøver er vist i tilleggsfiler 2: Kopier nummer endringer oppdaget av aCGH analyse. Minimal vanlige regioner av tilbakevendende (≥25%) endringer samt deres størrelse, frekvens, mulige målgener, og kromosom posisjon i basepar er vist i tabell 2. gående fått regioner ble plassert på 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), og 20p13-qter (40%). Den tilbakevendende slettet regioner ble plassert på 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), og Xq28 (25%). Alle vendende kopitall endringene var detekterbare både i primær- mage cancer og gastrisk kreft i cellelinjer med unntak av 14q11.2, som ble endret bare i fem cellelinjer.
Eks rekke forbundet genekspresjon forandrer
Tilsammen 256 individuell gener (10% av alle genene som ligger i de tilbakevendende kromosomale regioner med kopi nummer endringer) viste minst to ganger kopi rekke forbundet endring i deres uttrykk (range 2,0 til 34,6, median 3,8) (tilleggsfiler 3: Kopier rekke forbundet genet uttrykk endringer). 226 av disse genene ble overexpressed og ligger i tilbakevendende regioner av kopitall gevinster, mens 30 gener ble underexpressed og ligger i tilbakevendende regioner av kopi nummer tap. Fold endring i genekspresjon ble beregnet ved å sammenligne uttrykket nivåer av prøver med kopi nummer endringer i prøver med normal kopi nummer i en gitt gen. Derfor refererer en positiv ganger endring til en kopi nummer gevinst relatert økning i genuttrykk mens en negativ ganger endring refererer til en kopi nummer tap relatert nedgang i genuttrykk.
HHIPL2 product: (HHIP lignende 2) genet, forsterket i 1q41-q43.1 regionen, viste det høyeste antall kopier gevinst forbundet overekspresjon i magekreft i henhold til den integrerte microarray analyse (FC = 26,9). Vanligvis har den høyeste genuttrykk fold endringer mellom kreftprøver med og uten kopitall gevinster ble oppdaget på 19q regionen siden av de 40 genene viser > 5-fold kopi nummer tilknyttet endringer i sitt uttrykk, 19 (47,5%) ble plassert i 19q region (tilleggsfiler 3: Kopier rekke forbundet genuttrykk endringer). Den mest underexpressed genet i de tilbakevendende regioner i kopitall tap var ALPK2 plakater (alpha-kinase 2) (FC = -34,6) ligger på 18q12.3-q22.2.
Tidligere tre studier av oss og andre har blitt publisert som systematisk integrere genom-wide kopi nummer og genuttrykk data for å identifisere gener som uttrykk har endret seg på grunn av en kopi nummer endring i magekreft [15-17]. Sammenligningen av de overlappende gener mellom disse studiene og den aktuelle studien viste 20 gener TOMM20 plakater (1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), MTAP plakater (9q21 0,3), ASAP1 plakater (8q24.1-q24.2), PPP1R1B plakater (17q12), erbB2 plakater (17q12-Q21), SERPINB3 plakater (18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7 plakater (18q21.2-q22), HIF3A plakater (19q13.32), ZNF480 plakater (19q13.33), IL4I1 plakater (19q13.3-q13.4 ), CST3 plakater (20p11.21), PTPRA plakater (20p13), SLC13A3 plakater (20q12-q13.1), DDX27 plakater (20q13.13), PARD6B plakater (20q13.13 ), SGK2 plakater (20q13.2), og TUBB1 plakater (20q13.32) som enten ble oppnådd og overuttrykt eller slettes og underexpressed i vår studie og i minst ett av de tidligere publiserte studier. Tidligere publiserte data sammen med dagens resultater gir ytterligere bevis for den biologiske rollen av disse genene i magekreft.
Validering av potensielle mage kreft målgener
Real-time QRT-PCR-analyse viste at uttrykket av HHIPL2
var 7,4 ganger høyere i magekreft prøvene sammenlignet med ikke-ondartede mage vev (p < 0,05). I tillegg ble overekspresjon av HHILP2
signifikant assosiert med kopitall forsterkning (p 0,05) som uttrykk for HHIPL2
var 17,4 ganger høyere hos cancerprøver med kopiantall vinning av HHIPL2 plakater (g1 ) enn hos kreft prøver med normal kopiantallet av genet (G0) (tabell 3 og 4). Ifølge QRT-PCR-analyse var det en 2,9-fold underexpression av ALPK2
i mage kreft med kopi nummer tap (g1) sammenlignet med mage kreft med normal kopi antall ALPK2 plakater (G0) (p < 0,05 ). Overraskende har imidlertid ekspresjonen av ALPK2
i mage kreft generelt var 1,9 ganger høyere (p 0,05) enn i de ikke-ondartede gastrisk vev (tabellene 3 og 4). Histologisk subtype eller TNM-stadium hadde ikke en statistisk signifikant effekt på uttrykk for HHIPL2
eller ALPK2 product: (Tabell 3) .table 3 Resultater av parametriske Mann-Whitney test for QRT-PCR og TRAC analyse av data (SPSS17.0).
Gene
kromosom
Cancer vs. ikke-ondartet
tarm vs. diffuse
g1 vs. G0
M0 vs. M1
T1-2 vs. T3-4

N0 vs. N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0,05
p
= 0,104
p
< 0,05
p
= 0,451
p
= 0,072
p
= 0,378
ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0.001
p
= 0,319
p
= 0,396
p
= 0,208
p
= 0,232
p
= 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0.001
p
= 0,061
p
= 0,254
p
= 0,543
p
= 0,197
p
= 0,253
CYP3A4
7q21.1
p <

• Prognostisk betydning av nøytrofile lymfocytt forhold og blodplater lymfocytt forholdet i avanserte magekreftpasienter behandlet med FOLFOX chemotherapy
• En ny metode, oppdager digital genomet skanning KRAS genet forsterkning i mage kreft: involvering av overexpressed villtype KRAS i nedstrøms signalering og kreftcelle growth