Genóm celé číslo kópií génu a expresie analýza primárnych nádorov žalúdka a žalúdočné karcinóm lines

genómu-široký počet kópií génu a expresie analýza primárnych nádorov žalúdka a žalúdočných rakovinových bunkových línií
abstraktné
pozadia
Karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších zhubných nádorov po celom svete a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu súvisiace. Gen počtu kópií zmeny hrajú dôležitú úlohu v rozvoji rakoviny žalúdka a zmeny v počte kópií génu je jedným z hlavných mechanizmov pre rakovinové bunky pre riadenie expresie potenciálnych onkogénov a supresorových génov nádoru.
Metódy
Ak chcete zvýrazniť gény potenciálne biologickú a klinický význam u rakoviny žalúdka, sme vykonali systematický prieskum založená na poli génovej expresie a skopírovať hladiny číslo v primárnych nádorov žalúdka a žalúdočných rakovinových bunkových línií a potvrdené výsledky s použitím analýzu prepisu capture afinita na báze ( Trac test) a real-time QRT-PCR.
Výsledky
integrovaného microarray analýzy odhalili celkom 256 génov, ktoré boli umiestnené v opakujúcich regiónoch zisky alebo straty a mal aspoň spojenú zmenu 2-násobné kópie číslo- v ich génová expresia. Hladiny expresie 13 z týchto génov, ALPK2
ASAP1, CEACAM5
CYP3A4, ENAH
, ErbB2
HHIPL2
LTB4R
MMP9
PERLD1
, PNMT
, PTPRA stroje a OSMR
, boli overené v celkovo 118 vzoriek žalúdočných s použitím buď QRT-PCR alebo TRAC testu. Všetky tieto 13 gény boli odlišne exprimované medzi rakovinovými vzorkami a nemalígna tkanív (p < 0,05) a pridružení medzi počtu kópií a expresie génov zmeny boli potvrdené po dobu deviatich (69,2%) týchto génov (p menšie ako 0,05).
Záver
Záverom možno konštatovať, integrovaný génová expresia a počtu kópií analýza microarray zdôraznila gény, ktoré môžu byť kriticky dôležitá pre žalúdočné rakoviny. TRAC a QRT-PCR analýzy potvrdia výsledkami microarray a preto sa úloha týchto génov ako potenciálnych biomarkerov rakoviny žalúdka.
Pozadie
Vzhľadom na nedostatok skoré príznaky adenokarcinóme žalúdka sa vyznačuje tým, neskoré diagnóza javiskové a neuspokojivých možností následná liečba [1, 2]. Napriek poklesu jeho výskyt v posledných niekoľkých desaťročiach, rakovina žalúdka zostáva druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete [3]. Približne 90% všetkých karcinómov žalúdka sú adenokarcinómy vyplývajúce z epitelu [4]. Podľa klasifikácie karcinómov žalúdka Laurenův sú rozdelené do dvoch hlavných histologických podtypov, črevných a difúzna [5].
Žalúdočné adenokarcinómov, ako mnoho iných solídnych nádorov epiteliálneho pôvodu, sú často zložité z hľadiska integrity chromozomálne [6, 7]. Zhubné nádory žalúdka, sú známe pre prepravu viac odchýlky v ich genóme a také chromozomálne zmeny majú zásadný význam pre aktiváciu a inaktiváciu génov nádorových ochorení [8-17]. Gen zmena počtu kópií, je jedným z hlavných mechanizmov pre rakovinové bunky pre riadenie expresie génov rozhodujúce pre prežitie a rakoviny progresie [17-22]. Tieto počet kópií zmeny často zahrňujú veľkú skupinu génov, umiestnených blízko seba v rovnakom chromozómu. Napríklad; v žalúdočných rakovín na často zosilnený 17q12-Q21 región obsahuje gény, ako ErbB2
GRB7
jup
PERLD1, PNMT
PPP1R1B
STARD3 stroje a top2
[14, 17, 23]. Avšak len menšina z týchto génov môžu byť skutočné ovládače rakoviny gény, ktoré prispievajú k tvorbe nádorov, zatiaľ čo ostatné môžu byť zosilnené len preto, že ich chromozomálne blízkosti s amplifikácie cieľových génov [24, 25]. Jeden prístup k odlíšeniu týchto génov vodiča od priestoru pre cestujúcich mutácií je integrovať celého genómu počet kópií a expresia dát, ktoré umožnia identifikáciu génov, ktorých transkripčný aktivácia alebo represie je spojená so zmenou počtu kópií v rakovinové bunky. Tým, že kombinuje informácie z vysokým rozlíšením génu číslo kópie a expresných microarrays, je možné nielen definovať zlomových bodov počtu kópií zmien vo veľkom detaile, ale tiež posúdiť funkčný význam týchto zmien, a preto je možné identifikovať gény, ktoré riadia rakovinu nástup a progresie.
Ak chcete zvýrazniť gény potenciál ako biomarkery alebo klinických ciele v karcinómu žalúdka, sme vykonali systematickú s vysokým rozlíšením array-založený prehľad o počte kópií a génovej expresie úrovniach v žalúdočných rakovinových tkanív a bunkových línií. Naša analýza predchádzajúci rad na báze ukázala, že počtu kópií zisky a straty stoviek génov sú spojené so súčasným nárastu alebo poklesu génovej expresie [17]. V tejto štúdii sme zvýšili rozlíšenie analýzy počtu kópií viac ako 20-krát presnejšie vizualizovať zarážky na počet kópií úprav. Ďalej sme vykonali analýzu transkripčný génov nachádzajúcich sa v pozmenených chromozómových regiónoch na identifikáciu génov, ktorých deregulácia je spojená s malígnym fenotypu.
Metódy
rakovinou žalúdka tkanív a bunkových línií
Tento výskumný projekt bol preskúmaný a schválená etickou komisiou Ústavu lekárskej genetiky a chirurgia a schválené klinické Review Board of Helsinki University centrálnej nemocnice. Vzorky žalúdočnej tkanivá boli prospektívne získané od pacientov, ktorí podstúpili chirurgický zákrok alebo žalúdočné gastroskopia v Ústrednej nemocnici Helsinki University v rokoch 1999 až 2007 bol získaný informovaný súhlas od každého zúčastneného pacienta. Trinásť čerstvé mrazené primárnej tkaniva karcinómu žalúdka a karcinómu žalúdka sedem bunkové línie boli vybrané pre analýzu microarray (Tabuľka 1). Tkanivo materiál skladal z dvoch rôznych histologických podtypov, črevné (n = 9) a difúzna (n = 4) a nádory boli umiestnené na dvoch rôznych miestach v žalúdku, korpusu (n = 8) a antra (n = 5 ). Celkom 111 žalúdočné tkaniva a 7 žalúdočné rakovina bunkové línie boli zahrnuté do QRT-PCR a vychádza prepis test capture afinita (TRAC) analýzy (dodatočný súbor 1: Klinické parametrov). Vzorky tkaniva sa skladala z 43 nemalígna a 68 rakovinových tkanív žalúdočných a obaja histologické podtypy karcinómu žalúdka boli zastúpené (črevné, n = 42, difúzna, n = 25, jeden z neznámej histológie). Vzorky žalúdočnej tkaniva boli skladované pri -80 ° C. Pre overenie percentuálny nádoru a histológiu vzoriek, mrazené vzorky boli vložené do Tissue Tek OCT-zlúčeniny (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) a 5 um mrazené ľadovej rezy boli pripravené a zafarbené za použitia trypánovej modrej. Histologické vyšetrenie vzoriek s karcinómom žalúdka bolo hodnotených skúseným patológom (pani K.-L.). Tissue-Tek bol odstránený z tkaniva pred nukleových kyselín extractions.Table 1 Klinické parametre analyzovaných vzoriek na array komparatívna genomická hybridizácia (aCGH) a expresných čipov.
Primárne žalúdočné tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Žalúdočné rakovina bunkové línie
Vek /pohlavia
histológia
pôvodu
AGS
54 /F
Adeno-karcinóm
Primárne tumor
KATOIII
55 /M
difúznu
Pleurálny výpotok
MKN-1
72 /M
prasitrynes-karcinómu dlaždicových
lymfatických uzlín
MKN-7
39 /M
Črevné
lymfatických uzlín
MKN-28
70 /F
Črevné
lymfatických uzlín
MKN-45
62 /F
Difúzna
pečeňových metastáz
TMK-1
21 /M
Difúzne uzlín
Lymfatická
AGS a KATOIII bunkové línie boli získané z American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) a MKCH-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, a TMK-1 bunkové línie boli láskavým darom od Hiroshi Yokozaki, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, Japonsko [26]. AGS bunky boli pestované v Kaighn F12 médiu (2 mM glutamínom, 10% FBS, 100 U /ml penicilínu-streptomycínu), KATOIII bunky v médiu IMDM (2 mM glutamínom, 10% FBS, 100 U /ml penicilínu-streptomycínu) a všetkých iné bunkové línie v médiu RPMI-1640 (10% FCS, 2 mM glutamínu, 100 U /ml penicilínu-streptomycín). Všetky bunky boli pestované pri teplote 37 ° C a 5% CO 2.
RNA a extrakcia DNA
Pred RNA a DNA extrakciu, mrazené tkaniva bola ponorená do RNAlater-ICE činidla (Ambion, Austin, TX , USA) a skladované pri teplote -80 ° C počas 16 hodín pre stabilizáciu RNA. Polovica vzorky tkaniva (~ 25 mg) bola homogenizované v RLT-β-mercaptoetanolu lyzačním pufra (RNeasy mini kit, Qiagen Inc., Hilden, Nemecko), a druhá polovica v ATL-pufri (DNeasy krvi a tkanív Kit, Qiagen) za použitia homogenizátora Ultra-Turrax (IKA Works, Wilmington, NC, USA). RNA bola extrahovaná s použitím súpravy RNeasy mini, vrátane voliteľného liečbe DNázy a DNA pomocou DNeasy krvi a tkanív Kit. Pre žalúdočné rakovinové bunkové línie, 1 x 10 7 boli bunky lyžovanie za použitia injekčnej striekačky a ihly buď RLT-β-mercaptoetanolu lyzačním pufra alebo ATL-pufri pred RNA a DNA extrakcie, v danom poradí. Koncentrácia RNA a DNA boli merané pomocou NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a kvalita RNA bola hodnotená pomocou Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Iba RNA vykazujúce odlišné 18S a 28S ribozomálnej vrcholy v analýze Bioanalyzer a 260/280 pomery nad 2,0 boli prijaté pre ďalšiu analýzu.
Array CGH a expresie génu microarray analýzy
boli analyzované trinásť gastrických nádorov a sedem žalúdočné rakovina bunkové línie na 244K Human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Tri z týchto nádorov a všetky zo siedmich bunkových línií boli tiež analyzované pomocou 44K Celý ľudský genóm génovej expresie oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (obrázok 1). Priemerné pomery 260/280 pre tieto vzorky boli 2,1 pre RNA a 1,8 pre DNA, a všetky vzorky RNA mal jasne 18S a 28S ribozomálnej vrcholy v analýze Bioanalyzer indikujúca dobrej kvality (dáta nie sú uvedené). Array CGH experimenty boli vykonávané s použitím Human Genome CGH Microarray 244a kit (Agilent Technologies). Značenie a hybridizácia boli vykonané v súlade s Agilent protokolu (v5.0, jún 2007). V stručnosti, 1,5 ug vzorky DNA a 1,5 ug pohlavia uzavreté referenčnej DNA (DNA ľudského genómu, Promega, Madison, WI, USA) bol dvakrát rozštiepený Alul stroje a Rsal
reštrikčnými enzýmami (Promega). Štiepená DNA sa značí za použitia Agilent genómovej DNA Labeling Kit Plus. Vzorka DNA sa značí Cy5-dUTP a referenčné DNA s Cy3-dUTP, resp. Značené DNA sa čistí MicroCon YM-30 filtrov (Millipore, Billerica, MA, USA). V nadväznosti na čistenie, a referenčná vzorka DNA boli spojené a hybridizovány k poľu s 50 ug ľudskej DNA Cot-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) pri 65 ° C, 20 otáčok za minútu po dobu 40 hodín. Hybridizácia bola vykonaná s Agilent Oligo aCGH hybridizačním Kit. Pred skenovaním, bola sklíčka umytá v závislosti na protokole. Okrem vzorky DNA hybridizácie popísaných vyššie, referenčné male DNA (Cy3) bola hybridizována proti referenčnému ženskej DNA (Cy5) podľa rovnakého protokolu, ktorý sa má použiť ako referenčné polia v analýze dát aCGH. Obrázok 1 Vývojový diagram popisujúci rôzne kroky v rámci štúdie.
Génové expresie experimenty boli vykonávané za použitia celého ľudského genómu Oligo Microarray kit (Agilent Technologies) a značenie a hybridizácia v súlade s protokolom Agilent (v5.7, marec 2008). V stručnosti, 2 ug celkovej RNA vzorky a referenčnej RNA (kaluži bunkových línií 10 s rakovinou, non-žalúdka, ATCC, Manassas, MA, USA) boli značené za použitia Agilent Quick Amp súpravy pre značenie. Vzorka RNA bol označený s Cy5-dCTP a referenčné DNA s Cy3-dCTP, resp. Značené RNA bol potom čistený pomocou RNeasy mini spin kolóny (Qiagen). Hybridizácia bola vykonaná s Agilent Gene Expression Kit hybridizácia a vzorky boli hybridizovány pri 65 ° C, 10 otáčok za minútu počas 17 hodín a premyje podľa protokolu pred skenovania. Obaja aCGH a génovej expresie microarray sklíčka boli kontrolované pomocou DNA microarray skener (Agilent Technologies) a analyzované s Feature Extraction Software (v9.5.1.1.).
S vysokým rozlíšením počtom kópií profilovanie
All počet kópií dát je k dispozícii na adrese http: //www. Čang org (prístupové číslo: CG-EXP-49). [27]. CGH softvér Analytics Agilent (v3.5.14) bol aplikovaný identifikovať zmeny v počte kópií. Microarray dáta boli kvalita filtrovaný pomocou outlier informácie získané z analýzy Feature Extraction. Sondy označený ako odľahlej hodnoty boli odstránené z ďalšej analýzy. Ďalej boli použité nasledujúce filtre aberácie: minimálny počet sond v regióne = 3, minimálna absolútna log 2 pomer pre región = 0,27, a maximálny počet aberantne regiónoch = 1000. Protokol 2 pomer 0,27 zodpovedá 1,2-násobné zmeny v počte kópií. V CGH Analytics, každý pomer aCGH bola najprv prevedená do protokolu 2 pomeru nasleduje Z-normalizácie. Samec vs. ženské referenčným poľom bol použitý ako kalibračné poľa v analýze dát. Vzhľadom na rozdiely medzi pohlaviami medzi poľami, ktoré by mohli spôsobiť zaujatosť v analýze, chromozómy X a Y boli z kalibráciou vylúčené. Algoritmus ADM-2 s prahom 12,0 bola použitá na identifikáciu génov počet kópií zmeny v jednotlivých vzorkách a bunkových línií. bola vypočítaná minimálne spoločné oblasti zmeny v 20 vzoriek, vrátane polohy pre formát a chromozomálne zmeny do párov báz. Úchylka bola definovaná ako recidivujúce, či to bolo prítomných aspoň 25% vzoriek (tabuľka 2) .Table 2 Minimálna spoločné regióny recidivujúce (≥25%) počet kópií zmeny.
Zmena
Tkanivá (n = 13)
bunkové línie (n = 7)
frekvencia

Veľkosť (MB)
Position (Mb)
Možné cieľové gény
+ 1q41-q43.1
2 Sims 3
25 %
17,30
216,31 - 233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1
1
4
25%
19,41
30,18-49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1
4 Sims 3
35%
4,60
97,33-101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3 Sims 3
2
25%
19,8
126,45 - 146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3
6 Sims 3
45%
2,23
143,59 - 145,82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0
5
25%
1,05
22,89-23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1 Sims 3 Sims 3
30%
0,28
35,02-35,30
ErbB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2
2 Sims 3
25%
13,65
50,45-64,10
AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter
4 Sims 3
35%
29.36
33,89-63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57,94
0.04-57.98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-P21 0,1 Sims 3
4
35%
27,81
1,05-28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2 Sims 3
5
40%
26.11
39.48-65.59
Smad7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter
2
5
35%
3,69
70,95-74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1 Sims 3
3
30%
4,07
14,37-19,44
HSPA13
-Xq28
4
1
25%
1,21
152.24- 153,45 -
Počet prípadov, veľkosť minimálnych spoločných oblastiach (MB) a chromozómové pozície zmeny (MB) sú označené rovnako ako možných cieľových génov. CNV oblasti nie sú uvedené v tabuľke. . Počet kópií zisk (+), strata počtu kópií (-)
Expresia génu microarray analýzy
Všetky génovej expresie údajov je k dispozícii na adrese http: //www Čang org (prístupové číslo: CG-EXP .. -49) [27]. Výsledky boli microarray kvality filtruje za použitia odľahlých hodnôt definované funkcie extrakčnou softvér a normalizované podľa metódy, spraš, ktorá bola zahrnutá do softvérového balíka. Analýza génovej expresie bola obmedzená na génov nachádzajúcich sa v chromozómových oblastiach s opakujúcimi sa aberácia (tabuľka 2). Cieľom tohto prístupu bolo zdôrazniť génovej expresie zmeny, ktoré boli spojené so zmenami v počte kópií génu, a mohli by preto predstavovať potenciálne onkogény alebo supresorové gény nádoru s funkčnou úlohu v rakovine. Po prvé, stredné log10 výraz pomer bol vypočítaný pre všetky sondy, ktoré cielia na rovnaký gén. Potom sa v dvoch samostatných analýz pre ziskov a strát, stredná úroveň expresie každého génu bolo vykonané porovnanie medzi vzorkami s počtu kópií zisk /a vzorky s normálnym počtom kópií pre vyhodnotenie účinku počtu kópií zmien v génovej expresii. Expresia génu sklopné zmeny (FC) boli vypočítané buď tak, že sa stredná expresiu nádorových vzoriek strednej expresiou nemalígna vzoriek, alebo tak, že sa stredná expresia vzoriek s nádormi a počtu kópií zmeny (G1) o strednej expresiou karcinómov s normálnym počtom kópií (G0). Aspoň bola považovaná za významnú 2násobné počet kópií spojené zmeny v génovej expresii. Na základe týchto údajov, 13 gény ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ErbB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT stroje a PTPRA
, boli vybrané byť ďalej overená pomocou QRT-PCR analýzu a TRAC (prepis analýzy s pomocou afinitnej zachytávacie) testu. Výsledky z integrovaného microarray analýzy boli porovnané s tromi skôr publikovaných štúdií, ktoré systematicky integrujú počtu kópií a dát génovej expresie genómu-široký [15-17].
V reálnom čase QRT-PCR analýza
reálnom čase qRT- PCR bola vykonávaná po dobu 2 gény, ALPK2
(18q21.31-q21.32) a HHIPL2
(1q41). Hladiny expresie boli merané v 82 žalúdočných tkanivách (46 rakovinový a 36 nemalígna tkanív) a v 7 žalúdočných rakovinových bunkových línií (ďalší súbor 1: Klinické parametrov). 1 ug celkovej RNA bola prevedená na cDNA za použitia Moloney-vírusu myší leukémie reverznej transkriptázy (Promega, Madison, WI, USA) a náhodných primerov (Invitrogen) v objeme 50 ul po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C. Reakcia bola tepelne inaktivovaného (95 ° C, 3 min) a naplnená do konečného objemu 200 ul sa stupňom vodou molekulárnej. Prepisy boli kvantifikované pomocou génovej expresie produkty Testy-on-DemandTM (Hs01085414_m1 pre ALPK2 stroje a Hs00226924_m1 pre HHIPL2
) podľa protokolu výrobcu (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Všetky primery boli umiestnené na exon-exon hraníc. Stručne, 2 ul cDNA templátu bol zmiešaný s 1,25 ul špecifických primérov a sond značených FAM-oznamovacieho farbivá. 12,5 ul TaqMan ® Universal PCR Mastermix a prosté RNázy vody sa pridá do celkového objemu 25 ul. Ľudský 18S rRNA slúžila ako vnútorná kontrola normalizovať hladiny expresie v následnej kvantitatívnej analýzy. 18S Sonda bola značená VIC-oznamovacieho farbivá, aby multiplex PCR s cieľovými génmi. Podmienky PCR boli nasledujúce: 50 ° C po dobu 2 minút, 95 ° C počas 10 minút, nasleduje 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd a 60 ° C po dobu 1 min. Každá vzorka bol meraný v troch opakovaniach a údaje boli analyzované pomocou delta-delta spôsobom, porovnávajúca výsledky expresie (2 - [kontrolná vzorka Ct-Ct])
TRAC test
Prepis analýzy s pomocou. afinita capture (TRAC) test [28] bolo vykonané na 11 rôznych génov v 88 žalúdočných tkanivách (53 rakovinové a 35 nemalígna tkanív) a 7 žalúdočných rakovinových bunkových línií (ďalší súbor 1: Klinické parametrov). Gény zahrnuté do analýzy boli ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1), CYP3A4
(7q21.1) ASAP1
(8q24.1-q24.2), LTB4R
(14q11.2-Q12), PERLD1
(17q12), ErbB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-q13 0,2), PTPRA
(20p13) a MMP9
(20q11.2-q13.1). Výhodou testu TRAC je, že hladiny expresie mnohých génov môžu byť merané súčasne z jednej vzorky, a tým znižuje množstvo vzorky RNA pri analýze. To je dôležité najmä pre analýzu často obmedzených vzoriek klinických tkanív.
Analýza bola vykonaná pri TRAC PlexPress (Helsinki, Fínsko). Vlastné TRACPackTM činidlá pre mRNA (PlexPress) boli použité v analýze. V stručnosti, 90 ul hybridizačného Mix (obsahujúci značené gén špecifický detekčnej sondy a biotinylizované oligo-dT sondy) na jamku bolo rozdelené na 96-jamkové PCR doštičky. Dva mikrogramy RNA vzorky bol aplikovaný do každej jamky v 100 ul celkového objemu reakčnej. Rovnakého množstva (30 Amol /reakciu) jednoreťazcový 62-merná oligonukleotid syntetické riadenie hybridizácie, vrátane poly-A chvost, pridané do každej vzorky pred hybridizáciou. Hybridizácia bola vykonaná pri 60 ° C, 650 otáčok za minútu 120 minút (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Nemecko). Po zachytení hybridizácia afinity, čistenie, a elúcia sa vykonáva pomocou Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Fínsko) magnetické častice procesora. magnetické guličky TRACPACK ™ streptavidínom v spojení (50 ug, PlexPress) boli pridané do zmesi hybridizačnej a nechá sa viazať na biotinylizované mRNA-sondou-oligo (dT) -hybrids počas 30 minút, po ktorých sa guličky boli premyté 5krát pomocou umývanie pufer pre odstránenie nenaviazaného materiálu. Značené RNA špecifické sondy boli eluované elučným pufrom a detekované pomocou kapilárnej elektroforézy s použitím ABI3100 sekvenceru (Applied Biosystems, Cheshire, Veľká Británia). Dáta boli analyzované s použitím softvéru TRACParser (PlexPress).
Štatistickou analýzu dát QRT-PCR
neparametrické Mann-Whitneyho testu pre dva nezávislé vzoriek bola použitá pre stanovenie štatistickej významnosti rozdielov v relatívnej expresiu mRNA hladiny ALPK2 stroje a HHIPL2
nemalígna a rakovinových žalúdočných vzoriek, rovnako ako vo vzorkách žalúdočné rakovinou rôznych histologických podtypov alebo TNM etáp. Hodnota p < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú (SPSS 17,0). Okrem toho, v dvoch oddelených analýz pre ziskov a strát, hladiny expresie vo vzorkách s nádormi a počtu kópií ziskov a strát (G1) boli v porovnaní so vzorkami s rakovinou s normálnym počtom kópií (G0) na posúdenie vzťah medzi počtom kópií a expresie génov. boli k dispozícii číslo kópie dát pre 37 žalúdočných vzoriek zahrnuté v analýze QRT-PCR (ďalšie súbor 1: Klinické parametre). Expresia génu sklopné zmeny boli vypočítané vydelením strednej hodnoty expresie jednej skupiny (napr karcinómov), od strednej hodnoty expresie inej skupiny (napr nemalígna vzoriek).
Štatistická analýza TRAC testovacích dát
syntetický kontrolu hybridizácie bol použitý v normalizácie dát pre odstránenie non-biologickej variácie v dátach. Pre každý cieľ, intenzita signálu vo vzťahu k tejto vnútornej kontroly hybridizácia boli vypočítané. U deviatich vzoriek tkaniva analyzovaných v replikáciu znamená bola použitá intenzita signálu. Neparametrické Mann-Whitneyho test na dvoch nezávislých vzoriek bola použitá pre stanovenie štatistickej významnosti rozdielov v relatívnych hladín expresie mRNA ASAP1
, CEACAM5
CYP3A4
ENAH
, ErbB2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT stroje a PTPRA
v nemalígna a rakovinových žalúdočných vzoriek, rovnako ako vo vzorkách žalúdočné rakovinou rôznych histologických podtypov alebo TNM etáp. Hodnota p < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú (SPSS 17,0). Porovnanie hladín génovej expresie vo vzorkách s alebo bez počtu kópií zmien bola vykonaná, ako bolo popísané vyššie pre analýzu QRT-PCR. . Boli k dispozícii pre 43 vzoriek s karcinómom žalúdka číslo kopírovanie dát do analýzy zahrnuté TRAC teste
výsledky
Gene počtu kópií aberácie
All počet kópií génu sa zmení v jednotlivých vzorkách sú uvedené v dodatkovom súboru 2: Kopírovanie čísla sa zmení detekované aCGH analýzou. Minimálne spoločné oblasti recidivujúce (≥25%) zmeny, ako aj ich veľkosť, frekvencia, potenciálne cieľové gény, a chromozomálne pozície v párov báz sú uvedené v tabuľke 2. opakujúce sa získala oblasti boli umiestnené na 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), a 20p13-qter (40%). Opakujúce sa vypúšťa oblasti boli umiestnené na 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), a Xq28 (25%). Všetky opakujúce sa počet kópií zmeny boli detekovateľné ako v primárnych karcinómov žalúdka a v žalúdočných rakovinové bunkové línie, s výnimkou 14q11.2, ktorý bol zmenený iba v piatich bunkových línií. EU Počet kópií génovej expresie spojené mení
celkom 256 jednotlivých gény (10% všetkých génov nachádzajúcich sa opakujúcich chromozomálnych regiónoch s počtom kópií zmenami) vykázali aspoň 2-krát počet kópií spojenú zmenu v ich výrazu (rozmedzie 2,0 až 34,6, medián 3,8) (Ďalší súbor 3: kopírovanie číslo priradené gén výraz sa zmení). 226 z týchto génov bolo nadmerne vystavený a nachádza sa v opakujúcich regiónoch počte kópií zisky, zatiaľ čo 30 gény boli underexpressed a nachádza sa v opakujúcich regiónoch počte kópií strát. Násobné zmeny v génovej expresii bola vypočítaná porovnaním hladín expresie vzoriek s počtom kópií zmeny na vzorky s normálnym počtom kópií v danom génu. Preto pozitívna zmena fold sa vzťahuje k nárastu počtu kópií zisk týkajúci sa v génovej expresii, zatiaľ čo záporná zmena fold označuje počet kópií straty súvisiace zníženie génovej expresie.
HHIPL2
(HHIP podobný 2) gén, zosilnený v oblasti 1q41-q43.1, ukázal najvyšší počet kópií zisk spojený zvýšenú expresiu u rakoviny žalúdka podľa integrovaného microarray analýzy (FC = 26,9). Všeobecne platí, že najvyššie génovej expresie zložiť zmeny medzi vzorkami s nádorovým ochorením a bez počtu kópií zisky boli zistené u 19q regiónu od von zo 40 génov, ktoré ukazujú > 5-násobný počet kópií spojené zmeny v ich vyjadrení, 19 (47,5%) boli umiestnené v 19q kraji (ďalší súbor 3: kopírovanie číslo priradené génovej expresie zmenami). Najviac underexpressed gén opakujúcich regiónoch strát počtu kópií bolo ALPK2
(alfa-kinázu 2) (FC = -34,6) so sídlom v 18q12.3-q22.2.
Predtým tri štúdie podľa nás a iní bolo publikované, že systematicky integrovať počtu kópií a dát génovej expresie genómu-široký pre identifikáciu génov, ktorých výraz sa zmenil v dôsledku zmeny počtu kópií u rakoviny žalúdka [15-17]. Porovnanie prekrývajúcich génov medzi týmito štúdiami a súčasnej štúdia odhalila 20 génov TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), MTAP
(9q21 0,3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), ErbB2
(17q12-Q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-Q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2), a TUBB1
(20q13.32), ktoré boli buď získané a nadmerne exprimovaný alebo odstránené a underexpressed v našej štúdii, a aspoň v jednom z predtým publikovaných štúdií. Predtým publikovaných dát spolu s aktuálne výsledky poskytujú ďalší dôkaz biologickej úloha týchto génov u karcinómu žalúdka.
Overenie potenciálnych cieľových génov karcinómu žalúdka
v reálnom čase QRT-PCR analýza ukázala, že expresia HHIPL2
7,4-krát vyššia vo vzorkách s karcinómom žalúdka v porovnaní s nemalígna žalúdočné tkaniva (p menšie ako 0,05). Okrem toho je zvýšená expresia HHILP2
boli významne spojené s počtu kópií ziskom (p menšie ako 0,05), ako vyjadrenie HHIPL2
17,4-krát vyššia vo vzorkách s nádorovým ochorením a počtu kópií zisk HHIPL2
(g1 ) než u vzoriek s karcinómom s normálnou počet kópií tohto génu (G0) (tabuľky 3 a 4). Podľa analýzy QRT-PCR došlo ku 2,9-násobné underexpression z ALPK2
karcinómov žalúdka s počtom kópií strát (G1) v porovnaní s karcinómov žalúdka s normálnym počtom kópií ALPK2
(G0) (s menej ako 0,05 ). Prekvapivo sa však výrazom ALPK2
žalúdočné rakoviny v všeobecne bola 1,9 krát vyššia (P 0,05) ako u nemalígna žalúdočných tkanivách (tabuľky 3 a 4). Histologický podtyp alebo TNM-fáza nemal štatisticky významný vplyv na expresiu HHIPL2
alebo ALPK2
(tabuľka 3) .Table 3 Výsledky neparametrické Mann-Whitneyho testu pre QRT-PCR a analýzy dát TRAC (SPSS17.0).
Gene
Chromozóm
Cancer vs. non-malígne
črevné vs. difúzna
g1 vs. G0
M0 vs. M1
T1-2 T3-4 vs.

N0 vs. N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0,05
p = 0,104
p Hotel < 0,05
p = 0,451
p = 0,072
p = 0,378
ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0,001
p = 0,319
p = 0,396
p = 0,208
p = 0,232
p = 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0,001
p = 0,061
p = 0,254
p = 0,543
p = 0,197
p = 0,253
CYP3A4

• Prognostický význam pomeru neutrofilov lymfocytov a krvných doštičiek pomeru lymfocytov u pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka liečení chemoterapiou FOLFOX
• Spôsob román, digitálne skenovanie genómu detekuje KRAS amplifikáciu génu v žalúdočnej rakoviny: zapojenie nadmerne vystavený divokým typom KRAS vo signalizácie downstream a rastu rakovino…