Genome-larga número de cópias do gene e análise de tumores gástricos primários e expressão lines

célula cancerosa gástrica Genome-wide número de cópias do gene e análise de tumores gástricos primários e linhas celulares de cancro gástrico expressão da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico é uma das neoplasias mais comuns em todo o mundo e a segunda causa mais comum de morte relacionada com cancro. alterações no número de cópias de genes desempenham um papel importante no desenvolvimento do cancro gástrico e uma mudança no número de cópias do gene é um dos principais mecanismos para uma célula de cancro para controlar a expressão de um potencial oncogenes e genes supressores tumorais.
Métodos
para destacar genes de potencial relevância biológica e clínica no câncer gástrico, realizamos uma pesquisa baseada em array sistemática da expressão gênica e copiar níveis numéricas em tumores gástricos primários e linhas celulares de cancro gástrico e validou os resultados utilizando uma análise transcrição base de captura por afinidade ( TRAC ensaio) e em tempo real qRT-PCR.

resultados da análise de microarray Integrado revelou um total de 256 genes que foram localizados em regiões recorrentes de ganhos ou perdas e tiveram pelo menos uma mudança associada 2 vezes cópia numeração na sua expressão genetica. Os níveis de 13 desses genes, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, ERBB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1 , PNMT
, PTPRA
e OSMR
, foram validadas em um total de 118 amostras gástricas que utilizam tanto o qRT-PCR ou ensaio TRAC. Todos estes 13 genes foram diferencialmente expressos entre amostras cancerosas e tecidos não malignos (p < 0,05) e a associação entre o número e expressão do gene de cópia mudanças foi validados por nove (69,2%) desses genes (p < 0,05).
conclusão
Em conclusão, a expressão do gene integrado e análise de microarray número de cópias destaque genes que podem ser criticamente importante para a carcinogênese gástrica. TRAC e qRT-PCR análises validou os resultados de microarray e, portanto, o papel destes genes como potenciais biomarcadores para o câncer gástrico.
Fundo
Devido à falta de sintomas precoces adenocarcinoma gástrico é caracterizada por diagnóstico fase tardia e opções insatisfatórias para tratamento curativo [1, 2]. Apesar do declínio de sua incidência nas últimas décadas, o câncer gástrico continua a ser a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [3]. Aproximadamente 90% de todos os cancros gástricos são adenocarcinomas resultantes do epitélio [4]. De acordo com cancros gástricos classificação de Lauren são divididos em dois principais subtipos histológicos, intestinais e difusa [5].
Adenocarcinomas gástricos, como muitos outros tumores sólidos de origem epitelial, são muitas vezes complexas em termos de integridade cromossômica [6, 7]. tumores gástricos malignos são conhecidos para transportar várias aberrações no seu genoma e tais alterações cromossômicas são cruciais para a ativação e inativação de genes relacionados ao câncer [8-17]. Gene alteração do número de cópia é um dos principais mecanismos para uma célula de cancro para controlar a expressão de genes cruciais para a sobrevivência celular e cancro progressão [17-22]. Estas alterações no número de cópias geralmente envolvem um grande grupo de genes localizados perto um do outro no mesmo cromossoma. Por exemplo; em cancros gástricos da região 17q12-q21 frequentemente amplificada contém genes tais como ERBB2
, GRB7
, JUP
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
e TOP2A
[14, 17, 23]. No entanto, apenas uma minoria destes genes são susceptíveis de ser os verdadeiros genes que contribuem para o cancro do controlador tumorigénese, enquanto outros podem ser amplificados simplesmente devido à sua proximidade cromossómico com os genes alvo de amplificação [24, 25]. Uma abordagem para distinguir tais genes do controlador das mutações de passageiros é integrar número de cópias do genoma e expressão de dados, o que permite a identificação de genes cuja transcrição de activação ou de repressão está associado com uma mudança do número de cópias numa célula cancerosa. Assim, através da combinação de informações dos de alta resolução de cópia do gene Número e expressão microarrays, é possível não só para definir pontos de interrupção de alterações no número de cópias em grande detalhe, mas também para avaliar o significado funcional destas mudanças e, portanto, possivelmente, identificar genes que impulsionam o cancro aparecimento e progressão.
Para destacar potenciais genes como biomarcadores ou alvos clínicos em câncer gástrico, realizou-se um inquérito de base de matriz de alta resolução sistemática de número de cópias e expressão gênica níveis em tecidos com câncer gástrico e linhas celulares. A nossa análise baseia-matriz anterior mostrou que os ganhos e perdas do número de cópia de centenas de genes estão associados com um aumento simultâneo ou diminuição na expressão do gene [17]. No presente estudo, nós aumentamos a resolução da análise do número de cópias ao longo de 20 vezes a visualizar com mais precisão os pontos de interrupção das alterações no número de cópias. Além disso, temos realizado uma análise da transcrição de genes localizados nas regiões cromossômicas alterados para identificar genes cuja desregulação está associado com o fenótipo maligno.
Métodos
tecidos de câncer gástrico e linhas celulares
Este projeto de pesquisa foi revisto e aprovado pela Comissão de Ética do Departamento de Genética médica e Cirurgia e autorizado pela Clínica Conselho de Helsinki University Central Hospital Review. amostras de tecido gástrico foram prospectivamente coletados de pacientes submetidos à cirurgia gástrica ou gastroscopia no Hospital Central da Universidade de Helsínquia, entre 1999 e 2007. O consentimento informado foi obtido de cada paciente participante. Treze tecidos frescos congelados primárias gástricas cancerosas e sete linhas de células de cancro gástrico foram escolhidos para análise de micro-arranjo (Tabela 1). O material tecido consistiu de dois subtipos histológicos diferentes, intestinal (n = 9) e difusa (n = 4) e os tumores estavam localizados em dois locais diferentes do estômago, do corpus (n = 8) e o antro (n = 5 ). No total, 111 tecidos gástricos e 7 linhas celulares de cancro gástrico foram incluídos no qRT-PCR e no ensaio de transcrição baseado captura de afinidade (TRAC) analisa (arquivo adicionais 1: Os parâmetros clínicos). As amostras de tecido consistiu de 43 nonmalignant e 68 tecidos gástricos cancerosas e ambos os subtipos histológicos de câncer gástrico foram representados (intestinal, n = 42; difusa, n = 25; um dos histologia desconhecida). amostras de tecido gástrico foram armazenadas a -80 ° C. Para verificar a percentagem do tumor e histologia das amostras, as amostras congeladas foram embebidos em Tissue-Tek outubro Composto (Sakura Finetek, Torrance, CA, EUA) e 5 fiM de gelo-secções congeladas foram preparadas e coradas utilizando Azul de Tripano. Histologia dos espécimes de cancro gástrico foi avaliada por um patologista experimentado (M.-L. K.-L.). Tissue-Tek foi removida dos tecidos antes de Ácido Nucleico extractions.Table 1 Os parâmetros clínicos para as amostras analisadas na matriz comparativa hibridação genómica (aCGH) e microarranjos de expressão.
primários gástrico tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
linhas celulares de cancro gástrico
Idade /sexo
Histologia
Origem
AGS
54 /F
adeno-carcinoma
tumor primário
KATOIII
55 /M
difusa
derrame pleural
MKN-1 | 72 /M
carcinoma adeno-escamoso
metástases linfonodais
MKN-7
39 /M
intestinal
metástases linfonodais
MKN-28
70 /F
intestinal
metástases linfonodais
MKN-45
62 /F
difusa metástase hepática

TMK-1 | 21 /M
difusa metástase
linfa
linhas celulares AGS e KATOIII foram obtidas de American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA) e MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, e linhas celulares TMK-1 foram um presente amável de Hiroshi Yokozaki, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, Japão [26]. células AGS foram cultivadas em meio F12 de Kaighn (2 mM de glutamina, 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina-estreptomicina), células KATOIII em meio IMDM (2 mM de glutamina, 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina-estreptomicina) e todos outras linhas de células em meio RPMI-1640 (10% de FCS, glutamina 2 mM, 100 U /ml de penicilina-estreptomicina). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO 2.
ARN e extracção de ADN
Antes de extracções de ADN e ARN, o tecido congelado foi imerso em reagente RNAlater-ICE (Ambion, Austin, TX , EUA) e armazenou-se a -80 ° C durante 16 horas para estabilizar o ARN. Metade da amostra de tecido (~ 25 mg) foi homogeneizado em tampão de RLT-β-mercaptoetanol lise (RNeasy Mini Kit, Qiagen Inc., Hilden, Alemanha) e a outra metade em ATL-tampão (DNeasy Blood and Tissue Kit, Qiagen) usando o homogeneizador Ultra-Turrax (IKA Works, Wilmington, NC, EUA). O ARN foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit, incluindo o tratamento com DNase opcional, e ADN utilizando o DNeasy Blood and Tissue kit. Para as linhas celulares de cancro gástrico, 1 × 10 7 células foram lisadas usando uma seringa e uma agulha em tampão de lise, quer RLT-β-mercaptoetanol ou ATL-tampão antes de extracções de ADN e ARN, respectivamente. As concentrações de RNA e de DNA foram medidos usando NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e a qualidade do RNA foi avaliada usando Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA). Apenas os ARN que mostram distintas 18S e 28S ribosomal picos na análise Bioanalyzer e 260/280 rácios superiores a 2,0 foram aceites para mais análises. Analisa
arrayCGH e expressão de genes de microarranjos
Treze tumores gástricos e sete linhas de células de cancro gástrico foram analisados nas oligoarrays 244K Human Genome CGH (G4411B, Agilent Technologies). Três dos tumores e todas as sete linhas celulares também foram analisados ​​utilizando o 44K Total genoma humano oligoarrays de expressão de genes (G4112F, Agilent Technologies) (Figura 1). As médias 260/280 proporções para estas amostras foram de 2,1 e 1,8 para ARN para ADN, e todas as amostras de ARN tinha picos 18S e 28S ribosomal claras na análise Bioanalyzer indicando boa qualidade (dados não mostrados). CGH matriz experiências foram realizadas utilizando o kit do Genoma Humano CGH Microarray 244A (Agilent Technologies). Etiquetagem e hibridação foram realizadas de acordo com o protocolo do Agilent (v5.0, Junho de 2007). Em resumo, 1,5 ug de ADN de amostra e 1,5 ug de de ADN de referência sexo correspondentes (DNA genómico humano, Promega, Madison, WI, EUA) foram duplamente digeridos com Alui
e Rsal
enzimas de restrição (Promega). O DNA digerido foi marcado usando o Agilent Genomic DNA Labeling Kit Plus. A amostra de ADN foi marcada com Cy5-dUTP e ADN de referência com Cy3-dUTP, respectivamente. ADN marcado foi purificado com Microcon YM-30 filtros (Millipore, Billerica, MA, EUA). Após a purificação, de amostra e de referência ADN foram reunidas e hibridado com a matriz com 50 ug de ADN Cot-1 humano (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a 65 ° C, 20 rpm durante 40 h. A hibridação foi realizada com o Kit Agilent Oligo aCGH hibridação. Antes da digitalização, as lâminas foram lavadas de acordo com o protocolo. Além das hibridações de ADN da amostra descrito acima, macho referência ADN (Cy3) foi hibridado contra ADN fêmea referência (Cy5) de acordo com o mesmo protocolo a ser utilizado como uma matriz de referência para a análise de dados aCGH. Figura 1 Fluxograma descrevendo diferentes etapas do estudo.
Gene experiências de expressão foram realizadas utilizando o kit Human Genome Oligo Microarray inteiro (Agilent Technologies), e rotulagem e hibridação de acordo com o protocolo Agilent (v5.7, março de 2008). Resumidamente, 2 mg de RNA total da amostra de referência e de ARN (um conjunto de linhas de células de cancro 10, não-gástrica, ATCC, Manassas, MA, EUA) foram marcadas utilizando o Agilent Breve Amp Labeling Kit. ARN da amostra foi marcado com Cy5-dCTP e de ADN de referência com Cy3-dCTP, respectivamente. ARN marcado foi então purificado utilizando RNeasy mini-colunas de centrifugação (Qiagen). A hibridação foi realizada com Gene Expression Kit Agilent A hibridação e as amostras foram hibridadas a 65 ° C, 10 rpm durante 17 h e lavada de acordo com o protocolo antes da digitalização. Ambos os aCGH e expressão gênica lâminas de microarray foram escaneados usando o DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies) e analisados ​​com Extração de Características Software (v9.5.1.1.).
Número de cópias de alta resolução de perfis
Todos os dados do número de cópias é disponível em http: //www. cangem org (número de acesso: CG-EXP-49). [27]. software Analytics CGH da Agilent (v3.5.14) foi aplicado para identificar as alterações no número de cópias. dados de Microarray foi qualidade filtrada usando as informações outlier obtido a partir da análise de extracção de recursos. Sondas marcadas como valores extremos foram removidos de uma análise mais aprofundada. Além disso, foram aplicados os seguintes filtros de aberração: número mínimo de sondas na região = 3, log mínimo absoluto 2 rácio para a região = 0,27, eo número máximo de regiões aberrantes = 1000. O log 2 proporção de 0,27 corresponde a uma alteração de 1,2 vezes no número de cópias. Em CGH Analytics, cada relação aCGH foi convertido primeiro a um log 2 rácio seguido por um Z-normalização. O macho versus matriz fêmea de referência foi utilizada como uma matriz de calibração para a análise de dados. Devido às diferenças de género entre as matrizes que podem causar imprecisões na análise, os cromossomas X e Y foram excluídos da calibração. algoritmo de ADM-2 com um nível de limiar de 12,0 foi usado para identificar as alterações no número de cópias do gene em amostras individuais e linhas celulares. regiões comuns mínimas de alterações nas 20 amostras foram calculados, incluindo o tamanho e posição cromossómica do alteração em pares de bases. Uma aberração foi definida como recorrente, se ele estava presente em pelo menos 25% das amostras (Tabela 2) .table 2 regiões comuns mínimas de recorrente (≥25%) copiar alterações numéricas.
Alteração
tecidos (n = 13)
linhas celulares (n = 7)
Frequency

Tamanho (MB)
Position (Mb)
genes alvo possíveis
+ 1q41-q43.1 Página 2 Sims 3
25 %
17.30
216,31-233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-Q11.1
1 4
25%
19,41
30,18-49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1 4
3
35%
4,60
97,33-101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3 Sims 3 Página 2
25%
19,8
126,45-146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3
6 Sims 3
45%
2,23
143,59-145,82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0
5
25%
1,05
22,89-23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1 Sims 3 Sims 3
30%
0,28
35,02-35,30
ERBB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2 Página 2 Sims 3
25%
13,65
50,45-64,10
AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter 4
3
35%
29,36
33,89-63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57,94
,04-57,98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-p21 .1 Sims 3 4
35%
27,81
1,05-28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2 Sims 3
5
40%
26,11
39,48-65,59
SMAD7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter Página 2
5
35%
3,69
70,95-74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1 Sims 3
3
30%
4,07
14,37-19,44
HSPA13
-Xq28 4
1 | 25%
1,21
152.24- 153,45 viajantes -
Número de casos, o tamanho das regiões comuns mínimas (MB) e a posição cromossômica da alteração (Mb) são indicados, bem como possíveis genes alvo. CNV regiões não são mostrados na tabela. . Ganho de número de cópia (+), a perda do número de cópias (-)
Gene análise de expressão microarray
Todos os dados de expressão gênica está disponível em http: //www cangem org (número de acesso: CG-EXP.. -49) [27]. resultados de microarray foram qualidade filtrada usando valores aberrantes definidas pelo Software Feature Extraction e normalizadas de acordo com o método do loess, o qual foi incluído no pacote de software. A análise da expressão do gene foi restringida aos genes localizados nas regiões cromossómicas com aberrações recorrentes (Tabela 2). O objetivo desta abordagem foi destacar as mudanças de expressão de genes que foram associados com alterações no número de cópias do gene, e poderia, portanto, representam potenciais oncogenes ou genes supressores de tumor com um papel funcional no cancro. Em primeiro lugar, uma proporção log10 expressão mediana foi calculada para todas as sondas de segmentação do mesmo gene. Em seguida, em duas análises separadas para os ganhos e perdas, o nível de expressão mediana de cada gene foi comparado entre as amostras com número de cópia de ganho /perda e amostras com número de cópia normal, para avaliar o efeito de alterações no número de cópias de expressão do gene. expressão génica dobram mudanças (FC) foram calculados quer dividindo-se a expressão média das amostras cancerosas pela expressão média das amostras não malignas ou dividindo a expressão média de amostras de cancro com alterações no número de cópias (G1) através da expressão média de amostras de cancro com o número de cópia normal (G0). Pelo menos uma alteração de 2 vezes do número de cópias associado na expressão de genes foi considerada significativa. Com base nesses dados, 13 genes ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
e PTPRA
, foram escolhidos para ser ainda validado com a análise de qRT-PCR e TRAC (análise de transcrição com o auxílio de afinidade captura) de ensaio. Os resultados da análise microarray integrado foram comparados com três estudos publicados anteriormente que integram sistematicamente número de cópias e expressão gênica de dados do genoma [15-17].
Em tempo real análise de qRT-PCR
em tempo real qRT- a PCR foi realizada durante 2 genes, ALPK2
(18q21.31-q21.32) e HHIPL2
(1q41). Os níveis de expressão foram medidos em 82 tecidos gástricos (46 cancerosos e 36 tecidos não malignos) e em 7 linhas celulares de cancro gástrico (arquivo adicional 1: parâmetros clínicos). 1 ug de ARN total foi convertido em cDNA usando reversa do vírus da leucemia de Moloney de murino-transcriptase (Promega, Madison, WI, EUA) e iniciadores aleatórios (Invitrogen) num volume de 50 uL durante 1 hora a 37 ° C. A reacção foi inactivada pelo calor (95 ° C, 3 min) e preenchido para um volume final de 200 ul com água de grau molecular. Os transcritos foram quantificados utilizando os produtos de expressão do gene Ensaios-on-DemandTM (Hs01085414_m1 para ALPK2
e Hs00226924_m1 para HHIPL2
) de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Todos os iniciadores foram situem nas fronteiras exão-exão. Resumidamente, 2 mL de modelo de cDNA foi misturado com 1,25 ul de iniciadores e sondas específicas marcadas com corante FAM-repórter. 12,5 ul de TaqMan ® Universal PCR Mastermix e água isenta de RNase foram adicionados a um volume total de 25 ul. Humana 18S rRNA serviu como um controle endógeno para normalizar os níveis de expressão na análise quantitativa subsequente. A sonda de 18S foi marcado com corante VIC-repórter para permitir PCR multiplex com os genes alvo. As condições de PCR foram como se segue: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Cada amostra foi medida em triplicado e os dados foram analisados ​​pelo método delta-delta para a comparação de resultados de expressão relativa (2 - [Ct de controlo da amostra-Ct]) Ensaio TRAC
análise Transcrição com ajuda de. captura de afinidade (TRAC) de ensaio [28] foi realizada por 11 genes diferentes em 88 tecidos gástricos (53 cancerosos e 35 tecidos não malignos) e 7 linhas celulares de cancro gástrico (arquivo adicional 1: parâmetros clínicos). Os genes incluídos na análise foram ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1), CYP3A4
(7q21.1) ASAP1
(8q24.1-q24.2), LTB4R
(14q11.2-q12), PERLD1
(17q12), ERBB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-q13 0,2), PTPRA
(20p13) e MMP9
(20q11.2-q13.1). A vantagem do ensaio de TRAC é que os níveis de expressão de múltiplos genes pode ser medida simultaneamente a partir de uma única amostra reduzindo assim a quantidade de ARN de amostra necessário para a análise. Isto é especialmente importante para a análise de amostras de tecido clínicos frequentemente escassos. Análise TRAC
foi realizada a PlexPress (Helsinki, Finlândia). reagentes TRACPackTM personalizado para ARNm (PlexPress) foram usadas na análise. (Sondas contendo marcados específicos para o gene de detecção de sondas e oligo-dT biotinilados) Resumidamente, 90 uL de mistura por poço hibridação foi dispensada a uma placa de 96 poços de PCR. Dois microgramas de amostra de ARN foi aplicada a cada poço num volume total de reacção de 100 uL. Uma quantidade igual (30 amol /reacção) de comando único de hibridação de oligonucleótido sintético 62-mero de cadeia, incluindo uma cauda poli-A, foi adicionado a cada amostra antes da hibridação. A hibridação foi realizada a 60 ° C, 650 rpm durante 120 minutos (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Após a captura de hibridação de afinidade, purificação e eluição foram feitas usando o martim-pescador Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlândia) processador de partículas magnéticas. grânulos TRACPACK ™ magnéticas acopladas com estreptavidina (50 ug, PlexPress) foram adicionados à mistura de hibridação e deixou-se ligar ao ARNm biotinilado-sonda oligo (dT) -hybrids durante 30 minutos, após o que as pérolas foram lavadas 5 vezes, utilizando de lavagem tampão para remover qualquer material não ligado. As sondas específicas de ARN marcado foram eluídas com tampão de eluição e detectados por electroforese capilar, utilizando o sequenciador ABI3100 (Applied Biosystems, Cheshire, Reino Unido). Os dados foram analisados ​​usando o software TRACParser (PlexPress).
A análise estatística dos dados qRT-PCR
Um teste de Mann-Whitney não paramétrico para duas amostras independentes foi aplicado para determinar a significância estatística de diferenças na expressão de mRNA em relação níveis de ALPK2
e HHIPL2
em amostras gástricas cancerosas e não malignas, bem como em amostras de cancro gástrico de diferentes subtipos histológicos ou TNM-etapas. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (SPSS 17.0). Além disso, em duas análises separadas para ganhos e perdas, os níveis de expressão em amostras de câncer com ganhos número de cópias ou perdas (G1) foram comparados com amostras de câncer com número de cópia normal (G0) para avaliar a associação entre o número de cópias e a expressão do gene. dados de número de cópias estavam disponíveis para 37 das amostras gástricas incluídos na análise qRT-PCR (arquivo adicionais 1: Os parâmetros clínicos). expressão gênica dobram alterações foram calculadas dividindo a expressão média de um grupo (por exemplo, amostras de câncer) pela expressão quer dizer do outro grupo (por exemplo, amostras de não-malignas).
A análise estatística dos dados do ensaio TRAC
Um controle de hibridação sintética foi utilizado na normalização dos dados para remover qualquer variação não-biológica nos dados. Para cada alvo, sinalizar intensidades relativas a este controle de hibridização interna foram calculados. Para as amostras nove tecido analisado em replicar significa intensidade do sinal foi utilizado. Um teste de Mann-Whitney não paramétrico para duas amostras independentes foi aplicado para determinar a significância estatística das diferenças nos níveis de expressão de mRNA relativas de ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
, e PTPRA
em amostras gástricas cancerosas e não malignas, bem como em amostras de cancro gástrico de diferentes subtipos histológicos ou TNM-estágios. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (SPSS 17.0). A comparação dos níveis de expressão de genes em amostras com e sem alterações no número de cópias foi realizada tal como foi descrito antes para a análise de qRT-PCR. . De dados de número de cópias estavam disponíveis para 43 amostras com câncer gástrico incluídos na análise do ensaio TRAC

Resultados da cópia do gene Número aberrações
All número de cópias do gene muda em amostras individuais são mostrados no arquivo adicional 2: número de cópias mudanças detectado por análise aCGH. regiões mínimas comuns da recorrente (≥25%) alterações, bem como a sua dimensão, a frequência, possíveis genes-alvo, ea posição cromossômica em pares de bases são apresentados na Tabela 2. O recorrente ganhou regiões foram localizados em 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-Q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), e 20p13-qter (40%). As regiões suprimidas recorrentes foram localizados em 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), e Xq28 (25%). Todas as alterações no número de cópias de repetição eram detectáveis ​​tanto em cancros gástricos primários e em linhas celulares de cancro gástrico, excepto para a 14q11.2, que se altera apenas em cinco linhas de células.
Número de cópia a expressão do gene associado muda
No total 256 indivíduo genes (10% de todos os genes localizados nas regiões cromossômicas recorrentes com alterações no número de cópias) apresentaram pelo menos um número de cópias de 2 vezes mudança associada em sua expressão (intervalo 2,0-34,6, mediana 3,8) (arquivo adicionais 3: Copiar número associado gene mudanças de expressão). 226 destes genes foram overexpressed e localizados em regiões recorrentes de número ganhos de cópias, enquanto que 30 genes foram underexpressed e localizados em regiões recorrentes de perdas no número de cópias. Dobra mudança na expressão do gene foi calculada através da comparação dos níveis de amostras com alterações no número de cópias de expressão para amostras com o número de cópia normal num determinado gene. Por isso, uma alteração dobra positiva refere-se a um aumento do número de cópias ganho relacionados na expressão do gene enquanto que uma mudança dobra negativa refere-se a uma diminuição do número de cópias perda relacionada da expressão do gene.
HHIPL2
(HHIP-like 2) o gene, amplificado na região 1q41-q43.1, apresentou o maior ganho de número de cópias superexpressão associada no câncer gástrico de acordo com a análise de microarray integrado (FC = 26,9). Geralmente, a mais alta expressão do gene dobre mudanças entre amostras de câncer com e sem número ganhos cópias foram detectados na região 19q desde dos 40 genes que mostram > no número de cópias de 5 vezes associada mudanças em sua expressão, 19 (47,5%) foram localizados nos 19q região (arquivo adicional 3: alterações Copiar número associado gene de expressão). O gene mais underexpressed nas regiões recorrentes de perdas no número de cópias foi ALPK2
(alfa-quinase 2) (FC = -34,6) localizado em 18q12.3-q22.2.
Anteriormente, três estudos por nós e os outros foram publicados que integram sistematicamente número de cópias e expressão gênica de dados do genoma para identificar genes cuja expressão foi alterada devido a uma série alteração cópia no câncer gástrico [15-17]. A comparação dos genes sobrepostos entre estes estudos e no estudo atual revelou 20 genes TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), MTAP
(9q21 0,3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), ERBB2
(17q12-q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2) e TUBB1
(20q13.32) que foram ou adquirida e overexpressed ou excluído e underexpressed em nosso estudo e em pelo menos um dos estudos publicados anteriormente. Anteriormente os dados publicados juntamente com os resultados atuais fornecem mais uma prova do papel biológico destes genes no câncer gástrico.
Validação de potenciais genes alvo câncer gástrico
em tempo real análise de qRT-PCR mostrou que a expressão de HHIPL2
foi 7,4 vezes mais elevada em amostras de cancro gástrico em comparação com os tecidos não malignos gástricas (p < 0,05). Além disso, a superexpressão de HHILP2
foi significativamente associada com o ganho de número de cópia (p < 0,05) como a expressão de HHIPL2
foi de 17,4 vezes maior em amostras de câncer com o ganho de número de cópias de HHIPL2
(g1 ) do que em amostras de câncer com número normal cópia deste gene (G0) (Tabelas 3 e 4). De acordo com a análise de qRT-PCR houve uma subexpressão 2,9 vezes de ALPK2
em cancros gástricos com perdas no número de cópias (g1), em comparação com os cânceres gástricos com número normal cópia do ALPK2
(G0) (p < 0,05 ). Surpreendentemente, no entanto, a expressão de ALPK2
em cancros gástricos, em geral, foi 1,9 vezes superior (p < 0,05) do que nos tecidos gástricos não malignas (Tabelas 3 e 4). subtipo histológico ou TNM-fase não tem um efeito estatisticamente significativo sobre a expressão de HHIPL2
ou ALPK2
(Tabela 3) .table 3 Os resultados do teste de Mann-Whitney não paramétrico de análise de dados para o TRAC qRT-PCR e (SPSS17.0).
Gene
Chromosome
Cancer vs.
não-malignas
intestinal vs. difusa
g1 vs. g0
M0 vs. M1
T1-2 T3-4 vs.

N0 vs. N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32 p < 0,05
p
= 0,104
p Art < 0,05
p
= 0,451
p
= 0,072
p
= 0,378
ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0,001
p
= 0,319
p
= 0,396
p
= 0,208
p
= 0,232
p
= 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0,001
p
= 0,061
p
= 0,254
p
= 0,543
p
= 0,197
p
= 0,253
CYP3A4

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