broj kopija gena Genome-wide i izraz analiza primarnih želučanih tumora i želučanih staničnim linijama karcinoma

Genom-širok broj kopija gena i izraz analiza primarnih želučanih tumora i staničnih linija karcinoma želuca
apstraktne pregled Pozadina pregled, rak želuca je jedan od najčešćih malignih bolesti u svijetu i drugi najčešći uzrok raka povezane smrti. Broj kopija gena promjene igraju važnu ulogu u razvoju raka želuca i promjene u gen copy je jedan od glavnih mehanizama za stanice raka za kontrolu ekspresije potencijalnih onkogena i gena za suzbijanje tumora.
Metode pregled za istaknuti gene potencijalne biološke i kliničke važnosti kod raka želuca, proveli smo sustavno array-based istraživanje ekspresije gena i broja kopija razine u osnovnim želučanih tumora i želučanih staničnim linijama karcinoma i potvrđene rezultate uz uporabu prijepis analize afiniteta na snimci se temelji ( Trac ispitivanje) i real-time QRT-PCR. pregled Rezultati
Integrirani analize microarray otkrilo je ukupno 256 gena koji su smješteni u periodičan regijama dobitke ili gubitke i imao barem 2 puta copy number- povezane promjene u njihovom ekspresije gena. Razina ekspresije 13 tih gena, ALPK2 Netlogu, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, erbB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
PNMT pregled, PTPRA pregled i OSMR pregled, potvrđene su u ukupno 118 uzoraka želuca korištenjem ili QRT-PCR ili Trac testa. Sve ove 13 gena različito izražena između kancerogenih uzoraka i nemalignih tkiva (p < 0,05) i povezanost između broja kopija i ekspresije gena promjena potvrđen za devet (69,2%) od tih gena (p < 0,05).
Zaključak
U zaključku, integrirani ekspresije gena i broj kopija microarray analiza istaknuo gene koji mogu biti od iznimne važnosti za želučane karcinogeneze. TRAC i QRT-PCR analiza potvrđene rezultate Microarray a time i uloga ovih gena kao potencijalnih biomarkera za rak želuca.
Pozadina
Zbog nedostatka ranih simptoma želučanog adenokarcinoma karakterizira kasnoj fazi dijagnostike i nezadovoljavajućih mogućnosti za liječenje [1, 2]. Unatoč padu u svojoj učestalosti u posljednjih nekoliko desetljeća, raka želuca ostaje drugi najčešći uzrok smrti od raka povezanih svijetu [3]. Oko 90% svih želučanih karcinoma su adenokarcinomi proizlaze iz epitela [4]. Prema klasifikaciji želučanog karcinoma Lauren su podijeljeni u dvije glavne histoloških podtipova, crijevnih i difuzne [5].
Želučanog adenokarcinoma, poput mnogih drugih solidnih tumora epitelnog porijekla, često su složene u smislu kromosomske integriteta [6, 7]. Maligni želučanih tumora su poznati da nose više aberacije u njihovom genomu i takve kromosomskih promjena ključne su za aktivaciju i inaktivacija gena vezanih za rak [8-17]. Gene broj kopija promjena je jedan od glavnih mehanizama za stanice raka za kontrolu ekspresije gena ključnim stanične opstanak i raka progresije [17-22]. Ovi broj kopija promjene često uključuje veliku skupinu gena koji se nalaze u neposrednoj blizini jedna drugoj u istom kromosomu. Na primjer; u želučanim rakova koji se često pojačan 17q12-q21 regija sadrži gene, kao što su erbB2 Netlogu, GRB7 Netlogu, Jup Netlogu, PERLD1, PNMT Netlogu, PPP1R1B Netlogu, STARD3 Netlogu i TOP2A
[14, 17, 23]. Međutim, samo je manjina od ovih gena su vjerojatno da će biti pravi vozač rak geni koji doprinose nastanku tumora, dok drugi može pojačati samo zbog kromosomske blizine sa pojačanje ciljnih gena [24, 25]. Jedan od pristupa razlikovati takve vozač gene iz putničkih mutacija je da se integriraju broj kopija genoma širom i izražavanja podatke, koji omogućuje identifikaciju gena čija transkripcije aktivaciju ili je povezana s promjenom broja kopija u stanici raka. Dakle, kombinirajući informacije iz visoke rezolucije broj kopija gena i ekspresije microarrays, moguće je ne samo definirati kontrolne točke u broja kopija promjena u detalje, ali i za procjenu funkcionalnog značaja tih promjena i stoga možda i identificirati gene koji potiču rak nastanak i progresiju.
za označavanje gene potencijal kao biomarkera ili kliničkih ciljeva u rak želuca, proveli smo sustavno visoke rezolucije array-based pregled broja kopija ekspresije gena razinama u želučanim tkiva raka i staničnim linijama. Naša prethodna array-based analiza pokazala je da su broja kopija dobici i gubici stotine gena povezana uz istovremeno povećanje ili smanjenje ekspresije gena [17]. U ovom istraživanju, povećali smo rezoluciju analize broja kopija preko 20 puta za točnije vizualizirati prijelomnih točaka na broj kopija promjena. Osim toga, mi smo provesti prepisivanja analizu gena koji se nalaze u promijenjenim kromosomskim regijama za identifikaciju gena čija je deregulacija je povezana s malignim fenotipom.
Metode
želučanog tkiva raka i stanične linije
Ovaj istraživački projekt je pregledana i odobren od strane Etičkog povjerenstva Odjela za medicinsku genetiku i kirurgiju i ovlaštena od strane Clinical Review odbora Helsinškog University Central Hospital. uzorci želučane tkiva su prospektivno prikupljeni od pacijenata koji su se podvrgnuli želučane operaciju ili gastroskopija u Srednjoj Sveučilišne bolnice u Helsinkiju između 1999. i 2007. Informirani pristanak dobiven je od svakog pacijenta koji sudjeluje. Trinaest svježe smrznute primarni želučanih tkiva raka i sedam želučanih stanične linije raka su odabrani za analize mikropolja (tablica 1). Materijal tkivo se sastoji od dviju različitih histoloških podtipa crijeva (n = 9) i difuzno (n = 4), a tumori su bili smješteni na dva različita mjesta na želucu, korpusa (n = 8) i antruma (n = 5 ). Ukupno 111 želučani tkiva i 7 rak želuca stanične linije su uključene u QRT-PCR i afinitet za snimanje temelji transkript test (TRAC) analizira (dodatno datoteke 1: klinički parametri). Uzorci tkiva se sastoji od 43 nemaligno i 68 kancerogenih želučanog tkiva i oba histološkoj raka želuca su bili zastupljeni (crijevna, n = 42; difuzna, n = 25; jedan je od nepoznate histologije). Uzorci tkiva su želučani pohranjeni na -80 ° C. Za provjeru postotak tumora i histologije uzoraka, smrznuti uzorci su ugrađene u Tissue-Tek OCT spoj (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) i 5 um smrznute ledene presjeci su pripremljeni i obojeni pomoću triptofan plavog. Histologija želučanih uzoraka raka je ocijenjena od strane iskusnog patologa (M.-L. K.-L.). Tkivo-Tek je uklonjen iz tkiva prije nukleinska kiselina extractions.Table 1 kliničkih parametara za analize uzoraka na niz komparativna genomska hibridizacije (aCGH) i ekspresije niza. Pregled Primary želučani tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Želučani stanične linije raka pregled Age /Sex pregled Histologija pregled podrijetla pregled AGS
54 /F pregled, adeno-karcinom pregled Primarni tumor pregled KATOIII
55 /M
Difuzni pregled Pleuralni izljev pregled MKN-1 pregled 72 /M pregled adeno-karcinom pločastih
limfnog čvora metastaza pregled MKN-7 pregled 39 /M pregled crijeva
limfnih čvorova metastaze pregled MKN-28 pregled, 70 /F pregled crijeva pregled limfnih čvorova metastaze pregled MKN-45 pregled, 62 /F pregled difuznu
metastaze jetre
TMK-1 pregled 21 /M pregled difuznu pregled limfnih čvorova metastaze pregled AGS i KATOIII stanične linije su dobivene od American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) i MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, a TMK-1 stanične linije su bili ljubazni dar Hiroshi Yokozaki, Kobe University Graduate School of medicine, Kobe, Japan [26]. AGS stanice su uzgojene u Kaighn-ov F12 mediju (2 mM glutamin, 10% FBS, 100 U /ml penicilin-streptomicina) KATOIII stanice u IMDM mediju (2 mM glutamina, 10% FBS, 100 U /ml penicilin-streptomicin), a sve druge stanične linije u RPMI-1640 mediju (10% FCS, 2 mM glutamina, 100 u /ml penicilin-streptomicina). Sve stanice se uzgajaju na 37 ° C i 5% CO 2.
RNA i DNA ekstrakcije pregled prije RNA i DNA ekstrakcije, je smrznuti tkivo je uronjen u RNAlater-ICE reagensom (Ambion, Austin, TX , USA) i pohranjena na -80 ° C tijekom 16 sati da se stabilizira RNA. Polovica uzorka tkiva (~ 25 mg) je homogenizirana u RLT-β-merkaptoetanol pufera za lizu (Rneasy mini kit, Qiagen Inc., Hilden, Njemačka), a druga polovica u ATL-puferu (DNeasy krvi i tkiva Kit, Qiagen) pomoću Ultra-Turrax homogenizatora (IKA radi, Wilmington, NC, USA). RNK je ekstrahirana korištenjem Rneasy mini kit, uključujući eventualni DNase obradom i DNA pomoću DNeasy krvi i tkiva Kit. Za stanične linije karcinoma želuca, 1 × 10 7 stanice su lizirane pomoću šprice i igle u bilo RLT-β-merkaptoetanol puferu za liziranje i ATL-puferom prije RNA i DNA ekstrakcije, redom. RNA i DNA koncentracije mjerene su pomoću NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i kvalitete RNA je procijenjena pomoću Agilent-a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Samo RNA pokazuju različite 18S i 28S ribosoma pikove u Bioanalyzer analize i 260/280 omjer iznad 2.0 su prihvaćene za daljnju analizu. Pregled Array CGH i ekspresije gena mikropostrojima analizira pregled analizirani su Trinaest želučanih tumora i sedam želučani stanične linije raka na 244K Human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Tri od tumora i sve stanične linije sedam Također su analizirani pomoću 44K Cijeli ljudski genom ekspresije gena oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (Slika 1). Srednje 260/280 Omjeri tih uzoraka 2,1 za RNA i 1.8 za DNA, te sve uzorke RNA imali jasno 18S i 28S ribosoma vrhunce u Bioanalyzer analiza pokazuje dobru kvalitetu (podaci nisu prikazani). Array CGH pokusi su provedeni upotrebom ljudskog genoma CGH Microarray 244A kita (Agilent Technologies). Označavanje i hibridizacija su provedeni u skladu s Agilent protokola (v5.0, lipanj 2007.). Ukratko, 1,5 ug DNA uzorak i 1,5 ug spolne uparen referentnog DNA (humanog genoma DNA, Promega, Madison, WI, USA) su dvostruko digestiran sa Alui pregled i pregled RsaI restrikcijskih enzima (Promega). Digestiranom DNA je označena primjenom Agilent genomska DNA Labeling Kit Plus. Uzorak DNA je označena CY5-dUTP i referentnim DNK sa Cy3-dUTP, respektivno. Obilježena DNA se pročisti Mikrokonska YM-30 filtera (Millipore, Billerica, MA, USA). Nakon pročišćavanja, uzorak i referentne DNA su sakupljene i hibridizirana u nizu sa 50 ug humanih Cot-1 DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) na 65 ° C, 20 okretaja u minuti tijekom 40 sati. Hibridizacija je provedena s Agilent Oligo aCGH Hybridization Kit. Prije skeniranja, stakalca su isprana prema protokolu. Osim uzorak DNA hibridizacija gore opisano, reference muški DNA (Cy3) se hibridizira s referentnim ženskog DNA (Cy5) u skladu s istim protokolom koji će se koristiti kao referentna niza u analizi aCGH podataka. Slika 1 Dijagram toka koji opisuje različite stupnjeve istraživanja. Eksperimenti izraz pregled Gene su provedena pomoću čitavog ljudskog genoma Oligo Microarray kita (Agilent Technologies), i označavanje i hibridizacije u skladu s Agilent protokola (v5.7, ožujak 2008.). Ukratko, 2 ug ukupne RNA uzorka i referentne RNA (bazen stanične linije 10 od raka ne-želuca, ATCC, Manassas, MA, USA) bio je markiran primjenom Agilent Quick Amp Labeling Kit. Uzorak RNA je označena CY5-dCTP i referentnim DNK sa Cy3-dCTP, respektivno. Obilježen RNA je zatim pročišćen pomoću spin kolonom RNeasy Mini (Qiagen). Hibridizacija je izvedena s Agilent Gene Expression Kit hibridiziranje i uzorci su hibridizirani na 65 ° C, 10 okr 17 h i ispere se u skladu s protokolom prije skeniranja. Oba aCGH i ekspresije gena microarray stakalca su skenirani pomoću DNK Microarray Scanner (Agilent Technologies) i analizirani Ekstrakcija značajki softvera (v9.5.1.1.).
Broj kopija visoke razlučivosti profiliranje pregled Sva broj kopija podataka dostupno na http:. //www cangem org (pristupni broj: CG-EXP-49). [27]. Agilent je CGH Analytics softver (v3.5.14) primijenjen je utvrditi broj kopija promjene. Microarray podaci kvaliteta filtrira pomoću atipične informacije dobivene iz analize izlučivanje značajki. Sonde označeni kao odstupanja su uklonjeni iz daljnje analize. Osim toga, primjenjuju se sljedeća odstupanja filteri: najmanji broj proba u regiji = 3, minimalna apsolutna log 2 omjer za regiju = 0,27, a maksimalni broj neprirodnih regijama = 1000. log 2 omjer 0,27 odgovara 1,2 puta promjene u broju kopija. U CGH Analytics svaki aCGH omjer najprije se prevede u log 2 formatu, nakon čega slijedi Z-normalizaciji. Muško i žene referentnom nizu je korišten kao za kalibriranje niza u analizi podataka. Zbog spolnih razlika između polja koji mogu dovesti do pristranosti u analizi, kromosomi X i Y bili su isključeni iz kalibracije. ADM 2 algoritam s praga 12,0 je iskorišten za dokazivanje broj kopija gena promjene u pojedinačnim uzorcima i stanične linije. izračunate su minimalne zajedničke regije promjena u 20 uzoraka, uključujući i pozicije veličine i kromosomske na promjene u parova baza. Zastranjenje je definirana kao periodičan, ako je prisutan u najmanje 25% uzoraka (tablica 2) .table 2 Minimalni zajedničke regije rekurentnih (≥25%) kopirati broj promjena. Pregled Izmjena
Tkiva (n = 13)
Stanične linije (n = 7)
Frekvencija pregled
veličina (MB)
Pozicija (Mb)
mogućih ciljnih gena
+ 1q41-q43.1 pregled 2 pregled, 3 pregled, 25 % pregled 17.30
216,31-233,61 pregled ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1 pregled 1 pregled 4 pregled, 25% pregled 19.41
30,18-49,60 pregled OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1 pregled 4 pregled 3
35%
4,60 pregled 97,33 - 101,93 pregled CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3 pregled 3
2 pregled, 25%
19,8 pregled 126,45-146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3 pregled 6
3 pregled, 45% pregled 2,23 pregled 143,59-145,82 pregled GML, LYPD, AK3 pregled pregled + 14q11.2
0 pregled 5
25%
1,05 pregled 22,89-23,94 pregled LTB4R
+ 17q12-q21.1 pregled 3 pregled 3
30%
0,28 pregled 35,02-35,30 pregled erbB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2 pregled 2 pregled, 3
25%
13,65 pregled 50,45-64,10 pregled AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter pregled 4 pregled 3 pregled, 35%
29.36 Netlogu 33,89-63,25 pregled CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter pregled 5 Netlogu 3. pregled 40% pregled 57.94
0.04-57.98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-p21 0,1 pregled, 3
4
35%
27.81
1,05-28,86 pregled MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2 pregled 3
5
40% pregled 26.11
39.48-65.59
SMAD7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter pregled 2 pregled, 5
35%
3,69 pregled 70,95-74,65 pregled TSHZ1
-21q11.2-q21.1 pregled 3 pregled 3. pregled 30%
4,07 pregled 14,37-19,44 pregled HSPA13
-Xq28 pregled 4
1 pregled 25%
1,21 pregled 152.24- 153,45 pregled -
Broj slučajeva, veličina minimalnih zajedničkih područja (MB), a kromosomski položaj promjene (MB) su označeni kao mogući cilj geni. CNV regije nisu prikazani u tablici. . Kopiraj broj dobit (+), gubitak broj kopija (-) pregled, Gene analiza ekspresije mikropostrojima pregled svih podataka ekspresije gena dostupno na http: //www cangem org (pristupni broj: CG-EXP.. -49) [27]. Rezultati microarray su kvaliteta filtrirane koristite outliers definirane izlučivanje značajki softvera i normalizirana prema lesu metodom, koja je uključena u programskom paketu. Analiza genske ekspresije bila ograničena na gene koji se nalaze u kromosomskim regijama s rekurentnim aberacije (tablica 2). Cilj ovog pristupa je istaknuti ekspresije gena promjene koje su povezane s promjenama u broju gen copy, pa bi moglo predstavljati potencijalnu onkogena ili tumor supresor gena s funkcionalnim ulogu u rak. Prvo, medijan omjera log10 izraz je izračunata za sve sonde koje ciljaju isti gen. Zatim, u dvije odvojene analize za dobitke i gubitke, srednja razina ekspresije svakog gena u odnosu između uzoraka s broj kopija dobiti /gubitka i uzoraka s normalnom broju kopija procijeniti utjecaj broja kopija promjena na ekspresiju gena. Gene Expression mnogostrukost promjene (FC) su izračunati ili dijeljenjem medijan izražavanje kancerogen uzoraka od medijana ekspresiju nemalignih uzoraka ili dijeljenjem medijan izraz uzoraka raka s brojem kopija promjena (G1) uz medijan ekspresije uzoraka raka s normalnim brojem kopija (G0). Najmanje povezana dva puta broj kopija promjene u ekspresiji gena smatra se značajnim. Na temelju tih podataka, 13 gena ALPK2 pregled, ASAP1 pregled, CEACAM5 pregled, CYP3A4 pregled, ENAH pregled, erbB2, HHIPL2, LTB4R pregled, MMP9, OSMR pregled, PERLD1
PNMT pregled i PTPRA pregled, izabrani su da se dodatno potvrđene sa QRT-PCR analize i TRAC (prijepisa analiza s pomoću afiniteta za hvatanje) testa. Rezultati iz integrirane analize microarray uspoređeni su s tri prethodno objavljenih studija koje su sustavno uključuju broj kopija i ekspresije gena podataka genoma širom [15-17]. Pregled, u stvarnom vremenu QRT-PCR analiza pregled, u stvarnom vremenu qRT- PCR je izvedena za vrijeme 2 gena, ALPK2 pregled (18q21.31-q21.32) i HHIPL2
(1q41). Razina ekspresije su izmjerene u 82 želučanog tkiva (46 kancerozne i 36 nemalignih tkiva), te je u 7 želučanih staničnim linijama karcinoma (dodatne datotečne 1: Klinički parametri). 1 ug ukupne RNA se prevodi u cDNA pomoću Moloney-mišji virus leukemije reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI, USA) i nasumičnih početnika (Invitrogen), u volumenu od 50 ul za 1 sat na 37 ° C. Reakcija je toplinski inaktiviranog (95 ° C, 3 min) i puni se do konačnog volumena od 200 ul vodom molekulske stupnja. Transkripti su kvantificirane pomoću Analize-na-DemandTM ekspresije gena proizvode (Hs01085414_m1 za ALPK2 Netlogu i Hs00226924_m1 za HHIPL2 Netlogu) prema uputama proizvođača (tnom City, CA, USA). Svi su klice nalazi se na eksona-eksona granica. Ukratko, 2 ul cDNA šablone pomiješa se s 1,25 ul specifičnih primera i proba označenih FAM-izvjestiteljske boje. 12,5 ul TaqMan ® Univerzalni PCR Mastermix i RNaza-slobodne vode se dodaju u ukupnom volumenu od 25 ul. Humani 18S rRNA služio kao endogenoj kontroli normalizacije razine ekspresije u slijedećoj kvantitativne analize. Sonda 18S je obilježen sa VIC-reporter boje kako bi se omogućilo multipleks PCR s ciljanim genima. PCR uvjeti su bili kao što slijedi: 50 ° C 2 min, 95 ° C tijekom 10 minuta, a zatim 40 ciklusa od 95 ° C za 15 s i 60 ° C tijekom 1 min. Svaki uzorak izmjerena je u tri primjerka i podaci analizirani su delta-delta metodu za uspoređivanje relativne rezultate izraz (2 - [Kontrolni CT uzorak-CT]) pregled, test TRAC pregled transkripta analiza s pomoću. afinitet za snimanje (TRAC) testa [28] provedena je za 11 različitih gena u 88 želučanog tkiva (53 kancerogeni i 35 nemalignih tkiva) i 7 želučanih staničnim linijama karcinoma (dodatne datotečne 1: Klinički parametri). Geni uključeni u analizu su ENAH pregled (1q42.12), OSMR pregled (5p13.1), CYP3A4 pregled (7q21.1) ASAP1 pregled (8q24.1-q24.2), LTB4R pregled (14q11.2-Q12), PERLD1 pregled (17q12), erbB2 pregled (17q21.1), PNMT pregled (17q21-q22), CEACAM5 pregled (19q13.1-P13 0,2), PTPRA pregled (20p13) i MMP9 pregled (20q11.2-q13.1). Prednost testu Trac je da su razine ekspresije više gena može se mjeriti istovremeno iz jednog uzorka čime se smanjuje količina uzorka RNA potrebnu za analizu. To je osobito važno za analizu uzoraka često deficitarna kliničkih tkiva. Pregled TRAC analiza provedena je na PlexPress (u Helsinkiju, Finska). Prilagođeni TRACPackTM reagensi za mRNA (PlexPress) korištene u analizi. Ukratko, 90 ul Hybridization mješavine (koja sadrži obilježeni gena specifičnih sonde za detekciju i biotiniliranog oligo-dT sonde) po jažici bilo je raspršeno na 96 jažica PCR ploču. Dva mikrograma RNA uzorka primijenjen je u svaku jažicu, u ukupnom volumenu reakcije od 100 jal. Jednaku količinu (30 Amol /reakcija) jednolančane 62-mer sintetičke kontrolu oligonukleotid za hibridizaciju, uključujući poli-A repa, je bio dodan svakom uzorku prije hibridizacije. Hibridizacija je provedena pri 60 ° C, 650 rpm za 120 minuta (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Njemačka). Nakon hibridizacije afiniteta za hvatanje, čišćenje i ispiranje, odrađeno pomoću Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska) magnetski procesora čestica. Streptavidinom-coupled magnetske TRACPACK ™ kuglice (50 ug, PlexPress) doda se u hibridizacijsku smjesu i ostavi da se vežu na biotinilirani mRNA-sonda-oligo (dT) -hybrids 30 minuta, nakon čega su kuglice su isprane 5 puta sa opere pufer bi se uklonio nevezani materijal. Obilježene RNA specifične sonde se ispere sa puferom za ispiranje i detektirati kapilarnom elektroforezom koristeći ABI3100 sekvencera (Applied Biosystems, Cheshire, UK). Podaci su analizirani pomoću TRACParser softvera (PlexPress).
Statistička analiza podataka QRT-PCR
A neparametarskog Mann-Whitney test za dva nezavisna uzorka primijenjen je za određivanje statističke značajnosti razlika u relativnom izrazu mRNA razine ALPK2 Netlogu i HHIPL2 Netlogu u nemalignih i kancerogenih uzoraka želuca, kao iu uzorcima različitih histoloških podtipova ili TNM-faze želučanog karcinoma. P-vrijednost < 0,05 smatrana je statistički značajna (SPSS 17,0). Osim toga, u dvije odvojene analize za dobitke i gubitke, razina ekspresije u uzorcima karcinoma s broja kopija dobitke ili gubitke (G1) uspoređeni su s uzorcima karcinoma s normalnim brojem kopija (G0) procijeniti povezanost između broja kopija gena. Broj kopija bili dostupni podaci za 37 od uzoraka želuca uključene u QRT-PCR analize (Dodatni file 1: Klinički parametri). Gene Expression odustanu promjene su izračunava se dijeljenjem znači izraz jedne skupine (npr uzoraka karcinoma) po srednjem izraza iz druge skupine (npr nemalignih uzoraka). Pregled, Statistička analiza podataka TRAC testa
sintetički kontrole hibridizacije je korišten u normalizaciji podataka kako bi uklonili nebiološkim varijacije u podacima. Za svaki cilj, intenziteta signala u odnosu na ove unutarnje kontrole hibridizacije su izračunate. Za uzorke devet tkiva analizirani u identične znači intenzitet signala je korišten. Neparametrijski Mann-Whitney test za dva nezavisna uzorka primijenjen je za određivanje statističke značajnosti razlika u relativnim razinama ekspresije mRNA ASAP1 Netlogu, CEACAM5 Netlogu, CYP3A4 Netlogu, ENAH Netlogu, erbB2, LTB4R
MMP9, OSMR pregled, PERLD1 pregled, PNMT pregled i PTPRA pregled u nemalignih i kancerogenih uzoraka želuca, kao iu uzorcima različitih histoloških podtipova ili TNM-faze želučanog karcinoma. P-vrijednost < 0,05 smatrana je statistički značajna (SPSS 17,0). Usporedba razina ekspresije gena u uzorcima sa i bez broja kopija promjena je provedena kao što je opisano ranije za QRT-PCR analize. . Broj kopija bili dostupni podaci za 43 uzoraka s rakom želuca uključene u analizu TRAC testnom

• Prognostički značaj omjera neutrofila i limfocita i omjer limfocita trombocita u pacijenata s uznapredovalim rakom želuca liječenih FOLFOX chemotherapy
• Nova metoda, digitalno skeniranje genom otkriva KRAS gena pojačanje u želučanog karcinoma: Uključenost prekomjerno izražen divljeg tipa Kraš u nizvodnom signalizacije i stanica raka growth