Genomra kiterjedő génkópiaszámra expressziós analízisét primer gyomor tumorok és gyomorrák sejtvonalakon

Genomra kiterjedő génkópiaszámra expressziós analízisét primer gyomor tumorok és gyomorrák sejtvonalakon
Abstract Background katalógusa katalógusa Gyomorrák az egyik leggyakoribb rosszindulatú világszerte a második leggyakoribb oka a rák okozta halál. Gene kópiaszámától fontos szerepet játszanak a fejlesztés a gyomorrák és a változás gén kópiaszám egyik fő mechanizmusok egy rákos sejt, hogy ellenőrizzék a kifejezése lehetséges onkogének és tumorszuppresszor gének.
Módszerek
Ahhoz, hogy kiemelje a gének potenciális biológiai és klinikai jelentősége gyomorrákban végeztünk szisztematikus tömbalapú felmérés génexpresszió és kópiaszám szint primer gyomor tumorok és gyomorrák sejtvonalakon és validált eredmények felhasználásával egy affinitás elfog alapú átirat elemzés ( TRAC vizsgálat) és a valós idejű qRT-PCR. katalógusa Eredmények katalógusa integrált microarray analízis kimutatta, összesen 256 gént, amelyek található ismétlődő régiókban nyereség vagy veszteség, és legalább 2-szeres másolás számozással kapcsolatos változást a génexpressziót. Az expressziós szintje 13 ilyen gének, ALPK2 katalógusa, ASAP1, CEACAM5 katalógusa, a CYP3A4, ENAH
, ERBB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
, PNMT katalógusa, PTPRA katalógusa, és OSMR extracelluláris doménjai katalógusa, hitelesítették összesen 118 gyomor minták segítségével akár a qRT-PCR vagy TRAC vizsgálattal. Mindezek a 13 gén eltérő expressziót között rákos minták és rosszindulatú szövetekben (p < 0,05), és a szövetség között kópiaszám és génexpressziós változások érvényesítették kilenc (69,2%) a gének (p < 0,05).
Következtetés
Összefoglalva, az integrált génexpresszió és kópiaszám microarray kiemelt gének lehetnek kritikusan fontos a gyomor kialakulásában. TRAC és qRT-PCR analízis érvényesített microarray eredményeket, ezért a szerepe ezeknek a géneknek a potenciális biomarkerek gyomorrák. Katalógusa Háttér katalógusa hiánya miatt a korai tünetek gyomor adenokarcinóma jellemzi késői szakaszában a diagnózis és kielégítő lehetőségek kuratív kezelés [1, 2]. Annak ellenére, hogy a csökkenés annak előfordulási az elmúlt évtizedekben, a gyomorrák továbbra is a második leggyakoribb oka a rák összefüggő halálesetek világszerte [3]. Körülbelül 90% -a az összes gyomor adenokarcinóma származó epithelium [4]. Szerint Lauren besorolás gyomorrák vannak osztva két fő szövettani altípus, bél- és diffúz [5].
Gyomor adenocarcinoma, mint sok más szolid tumorok epiteliális eredetű, gyakran összetett szempontjából a kromoszóma integritását [6, 7]. Rosszindulatú daganatok gyomor ismert, hogy készítsen több aberrációk a genomban, és az ilyen kromoszomális változások elengedhetetlenek az aktiválás és inaktiválása rákkal kapcsolatos gének [8-17]. Gén kópiaszámának változás egyik fő mechanizmusok egy rákos sejt, hogy ellenőrizzék a gének expressziójának sarkalatos sejtek túlélését és a rák progressziójának [17-22]. Ezek kópiaszámától gyakran járnak egy nagy csoport gének közel egymáshoz ugyanazon a kromoszómán. Például; A gyomor rák a gyakran felerősített 17q12-q21 régióban géneket tartalmaz, mint például ERBB2 katalógusa, GRB7 katalógusa, JUP katalógusa, PERLD1, PNMT katalógusa, PPP1R1B katalógusa, STARD3 katalógusa, és TOP2A
[14, 17, 23]. Azonban csak egy kis töredéke a gének valószínűleg az igazi rák vezető gének hozzájárulnak tumorigenezis, míg másokat a felerősített egyszerűen azért, mert a kromoszomális közelségre erősítés célgének [24, 25]. Az egyik megközelítés, hogy megkülönböztessék az ilyen vezető gének az utas mutációk, hogy integrálja genomot kópiaszám és expressziós adatok, ami lehetővé teszi a gének azonosítása, akiknek a transzkripciós aktiválás vagy elnyomás van társítva kópiaszámú változás egy rákos sejtben. Így kombinálásával információt a nagy felbontású gén kópiaszámának és expressziós microarray, lehetséges, nem csupán meghatározni töréspontok kópiaszám változások nagy részletességgel, hanem, hogy értékelje a funkcionális jelentősége ezeknek a változások, és ezért esetleg gének azonosítására, hogy a meghajtó a rák kialakulása és progressziója.
kijelöléséhez gének potenciállal biomarkerek vagy a klinikai célok gyomorrák végeztünk rendszeres nagyfelbontású array-alapú felmérés kópiaszám és génexpressziós szinten gyomorrák szövetek és sejtvonalak. A mi korábbi tömb-alapú analízis azt mutatta, hogy kópiaszám nyereséget és veszteséget a több száz gén társított egyidejű növekedése vagy csökkenése a génexpressziót [17]. A jelen tanulmányban, mi nőtt a felbontás a kópiaszám elemzés több mint 20-szor, hogy pontosabban láthatóvá töréspontok a kópiaszámától. Továbbá végeztünk egy transzkripciós gének vizsgálata található megváltozott kromoszóma régiók gének azonosítására, amelyeknek a dereguláció társított malignus fenotípus. Katalógusa módszerek
Gyomorrák szövetek és sejtvonalak
Ez a kutatási projekt már megvizsgálták, és jóváhagyta az Etikai Bizottságának ÁOK Orvosi Genetikai és sebészet és a Hatóság által Clinical Review Board of Helsinki Egyetemi Központi Kórház. A gyomor szöveti mintákat prospektív gyűjtött átesett betegek gyomor műtét vagy gasztroszkópia a Helsinki Egyetemi Központi Kórház 1999 és 2007 között Tájékozott beleegyezésüket adták az egyes részt vevő beteg. Tizenhárom friss fagyasztott elsődleges gyomorrák szövetek és hét gyomorrák sejtvonalat választottuk microarray (1. táblázat). A szövet anyag állt két különböző szövettani altípus, bél (n = 9) és diffúz (n = 4), és a tumorokat található két különböző helyen a gyomor, a corpus (n = 8), és az antrum (n = 5 ). Összesen 111 gyomor szövetek és 7 gyomor rákos sejtvonalakban vontunk be a QRT-PCR és az affinitás befogás alapú transzkriptum assay (TRAC) elemzések (Plusz fájl 1: klinikai paraméterek). A szöveti mintákat állt 43 rosszindulatú és 68 rákos gyomor szövetek és mindkét szövettani altípusok gyomorrák képviselte (bél, n = 42; diffúz, n = 25, az egyik ismeretlen szövettan). Gyomor szöveti mintákat -80 ° C-on. Annak ellenőrzésére, a daganat százalékos aránya és szövettani minták, fagyasztott mintákat ágyazva Tissue-Tek OCT vegyület (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) és 5 um fagyasztott jég-metszeteket készítettünk és megfestettük tripánkék. Szövettan gyomorrák példányok úgy értékeltük, hogy egy tapasztalt patológus (M.-L K.-L.). Tissue-Tek lekerült a szövetek előtt nukleinsav extractions.Table 1 klinikai paraméterek a vizsgált mintákat a tömb összehasonlító genomi hibridizáció (aCGH) és expressziós microarray. Katalógusa Elsődleges gyomor tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
A gyomorrák-sejtvonalak katalógusa Kor /szex katalógusa szövettan katalógusa Eredeti katalógusa AGS katalógusa 54 /F katalógusa adeno-karcinóma katalógusa elsődleges daganat katalógusa KATOIII
55 /M
A diffúz katalógusa Mellkasi folyadékgyülem katalógusa MKN-1 katalógusa 72 /M katalógusa adeno-laphámrák katalógusa nyirokcsomó metasztázis katalógusa MKN-7 katalógusa 39 /M katalógusa Bél
nyirokcsomó metasztázis katalógusa MKN-28 katalógusa 70 /F katalógusa Bél katalógusa nyirokcsomó metasztázis katalógusa MKN-45 katalógusa 62 /F katalógusa Diffúz katalógusa májmetasztázisos
TMK-1
21 /M
Diffúz
nyirokcsomó áttétek
AGS és KATOIII sejtvonalakat az American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) és MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, és TMK-1 sejtvonal egyfajta ajándéka Hiroshi Yokozaki, Kobe Egyetem Graduate School of Medicine, Kobe, Japán [26]. AGS sejteket Kaighn-féle F12 tápközeget (2 mM glutaminnal, 10% FBS-sel, 100 egység /ml penicillin-sztreptomicin), KATOIII sejteket IMDM tápoldatban (2 mM glutaminnal, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-sztreptomicin), és minden más sejtvonalak RPMI-1640 táptalajban (10% FCS-t, 2 mM glutamint, 100 U /ml penicillin-sztreptomicin). Minden sejteket szaporítunk 37 ° C-on és 5% CO 2.
RNS és DNS-extrakció
megelőzően RNS és DNS extrakciót, a fagyasztott szövetet merítjük RNAlater-ICE reagenst (Ambion, Austin, TX , USA) és -80 ° C-on 16 órán át, hogy stabilizálják a RNS-t. Fele a szövet minta (~ 25 mg) homogenizáltunk RLT-β-merkapto-etanol lízispufferben (RNeasy Mini Kit, Qiagen Inc., Hilden, Németország), és a másik fele a ATL-pufferben (DNeasy vér és a szövet Kit, Qiagen) használva az Ultra-Turrax homogenizáló (IKA Works, Wilmington, NC, USA). RNS-t extraháltunk az RNeasy Mini Kit, beleértve az opcionális DNáz kezelés, és a DNS segítségével a DNeasy vér és a szövet Kit. Gyomorrák sejtvonalak, 1 × 10 7 sejteket lizáltuk fecskendővel és tűvel vagy RLT-β-merkapto-etanol lízispufferben vagy ATL-puffer előtt RNS és DNS kivonást, ill. RNS és DNS-koncentrációk alkalmazásával mértük NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), és RNS minőség alkalmazásával értékeltük Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Csak RNS mutatja különböző 18S és 28S riboszóma csúcsokat Bioanalyzer elemzés és 260/280 arány 2,0 felett elfogadták a további vizsgálatokhoz. Katalógusa Array CGH és génexpressziós microarray analízis katalógusa tizenhárom gyomor daganatok és hét gyomor rákos sejtvonalak elemeztük a 244K Human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Három a tumorok és mind a hét sejtvonalak szintén analizáltuk a 44K egész emberi genom génexpressziós oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (1. ábra). Az átlagos 260/280 arányokat Ezeket a mintákat 2.1 RNS és 1.8 DNS-t, és az összes RNS minták voltak világosak 18S és 28S riboszomális csúcsok a Bioanalyzer elemzés azt jelzi, jó minőségű (az adatokat nem mutatjuk). Array CGH kísérleteket hajtottunk végre Humán Genom CGH Microarray 244A készlet (Agilent Technologies). Címkézés és a hibridizáció szerint végeztünk az Agilent protokoll (v5.0, 2007 június). Röviden, 1,5 ug minta DNS-t és 1,5 ug nemű referencia-DNS (humán genomikus DNS, Promega, Madison, WI, USA) kettős emésztésnek AluI
és RsaI
restrikciós enzimekkel (Promega). Az emésztett DNS-t jelzett a Agilent Genomi DNS Labeling Kit Plus. Minta DNS-t Cy5 jelölt-dUTP-vel és a referencia DNS-Cy3-dUTP-vel, ill. Jelölt DNS-t tisztítottuk Microcon YM-30 szűrő (Millipore, Billerica, MA, USA). Miután a tisztítás, a minta és a referencia-DNS-eket egyesítettük, és hibridizáltuk a tömb 50 ug humán Cot-1 DNS-t (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 65 ° C hőmérsékleten, 20 rpm-mel 40 órán át. Hibridizációt végeztünk Agilent Oligo aCGH Hybridization Kit. Beolvasás előtt, a lemezeket mostuk protokoll szerint. Amellett, hogy a minta-DNS hibridizáció fent leírt referencia hím DNS-t (Cy3) hibridizáljuk ellen referencia női DNS-t (Cy5) szerint ugyanazt a protokollt kell használni, mint egy referencia tömböt az aCGH adatok elemzését. 1. ábra folyamatábra, ami leírja a különböző lépéseket a tanulmány. Katalógusa génexpressziós kísérletet végeztünk az egész Human Genome Oligo microarray kit (Agilent Technologies), és a címkézés és a hibridizáció szerint Agilent protokoll (v5.7, 2008 március). Röviden, 2 ug teljes minta-RNS és a referencia RNS-t (egy medence a 10 rákos sejtvonalban, a nem-gyomor, ATCC, Manassas, MA, USA) jelölt felhasználásával Agilent Quick Amp Labeling Kit. Minta RNS-t Cy5 jelölt-dCTP-t és a referencia DNS-Cy3-dCTP-t, ill. Jelölt RNS ezután tisztítottuk RNeasy Mini spin-oszlopokban (Qiagen). Hibridizációt végeztünk Agilent Gene Expression Hybridization Kit és mintákat hibridizáltuk 65 ° C hőmérsékleten, 10 rpm-en 17 órán és mossuk a protokoll szerint megelőzően szkennelés. Mindkét aCGH és génexpressziós microarray lemezeket beolvasott a DNS Microarray Scanner (Agilent Technologies), és vizsgáljuk a Feature Extraction Software (v9.5.1.1.).
Nagy felbontású kópiaszám profilalkotás Tanuld az összes kópiaszám adatok a http: //www. cangem. org (nyilvántartási száma: CG-EXP-49) [27]. Agilent CGH Analytics szoftver (v3.5.14) alkalmazták, hogy azonosítsa a kópiaszám változások. Microarray adatok minőségének szűrve a kilógó nyert információk Feature Extraction elemzés. Szondák megjelölve kiugró távolítani a további elemzésből. Ezen túlmenően, a következő aberráció szűrőket alkalmazva: minimális számú szondák régióban = 3, minimális abszolút log 2 arány régió = 0,27, és maximális száma aberráns régiók = 1000. A log 2 arány 0,27 megfelel egy 1,2-szeres változás a kópiaszám. Ebben CGH Analytics minden aCGH aránya először alakítjuk log 2 arányban, majd egy Z-normalizálás. A hím vs. nőstény referencia tömb használunk egy kalibrációs tömböt az adatok elemzését. Mivel a nemek közötti különbségek a tömbök okozhat torzítást az elemzés, kromoszómák X és Y kizárták a kalibrálást. ADM-2 algoritmus egy küszöbérték a 12.0-ben azonosítására használt gén kópiaszámának elváltozások egyes minták és sejtvonalak. Minimális közös régiói változások a 20 mintát számoltuk, beleértve a méretét és kromoszomális pozícióját a változás bázispár. Aberráció definiáltuk visszatérő, ha jelen volt legalább 25% a minták (2. táblázat) .table 2 Minimális közös régiói visszatérő (≥25%) kópiaszámától.
Változtatás Matton szövetek (n = 13) Matton sejtvonalak (n = 7) Matton Frequency katalógusa
méret (MB) Matton helyzet (Mb) Matton Lehetséges célgénjeit Matton + 1q41-q43.1 katalógusa 2

• Prognosztikai neutrofil limfocita arány és vérlemezke limfocita arány előrehaladott gyomorrákban FOLFOX kezelést kapott betegek chemotherapy
• Egy új módszer, digitális genom felismeri a KRAS gén amplifikáció gyomorrák: bevonását túlzott mértékben a vad típusú KRAS a jelátviteli és a ráksejtek growth