Genomo genų kopijų skaičiaus ir išraiška analizė Pirminių skrandžio navikų ir skrandžio vėžio ląstelių lines

genomo genų kopijų skaičiaus ir išraiška analizė Pirminių skrandžio navikų ir skrandžio vėžio ląstelių linijų
Anotacija
Background
Skrandžio vėžys yra vienas iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų visame pasaulyje ir antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių. Genų kopijų skaičiaus pokyčiai vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio vystymusi bei genų kopijų skaičiaus kaita yra vienas iš pagrindinių mechanizmų vėžio ląstelių kontroliuoti potencialių onkogenų ir naviko slopintuvas genų ekspresiją.
Metodai
Norėdami paryškinti genus galimo biologinio ir klinikinio EEE skrandžio vėžio, mes atlikti sistemingą masyvo pagrindu apklausą genų ekspresiją ir kopijų skaičiaus lygį pirminių skrandžio navikų ir skrandžio vėžio ląstelių linijų ir patvirtinti rezultatus naudojant artima surinkimo remiantis stenogramą analizę ( trac tyrimas) ir realiu laiku KRL PGR.
rezultatai
integruotos mikrogardeliq analizė atskleidė viso 256 genų, kurie buvo įsikūrę pasikartojančių regionuose pelnas arba nuostoliai ir turėjo bent 2 kartus kopija Numeris susijusį pakeitimą savo genų ekspresiją. Sąvoka lygiai 13 iš šių genų, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, erbb2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
PNMT
, PTPRA
ir OSMR
, buvo patvirtinta per 118 skrandžio mėginius Naudodama KRL PGR ar TRAC tyrimą iš viso. Visi šie 13 genų buvo skirtingai išreikšta tarp vėžinių pavyzdžių ir nonmalignant audinių (p < 0,05) ir tarp kopijų skaičiaus ir genų ekspresijos pokyčių buvo patvirtinta devynių (69,2%) iš šių genų (p < 0,05) asociacijos.
Išvada
Apibendrinant, integruota genų ekspresijos ir kopijų skaičiaus Mikrogardelė analizė išryškino genus, kurie gali būti labai svarbus skrandžio kancerogenezėje. Trac ir KRL-PGR analizės patvirtintas mikrogardeliq rezultatų, todėl šių genų, kaip potencialių biologinių žymenų, skirtų skrandžio vėžio vaidmenį.
Background
Dėl pirmųjų simptomų nebuvimas skrandžio adenokarcinoma yra būdingas vėlai diagnozuoti ir nepatenkinamus variantų gydomųjų [1, 2]. Nepaisant jo dažnis per pastaruosius kelis dešimtmečius nuosmukio, skrandžio vėžys išlieka antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio mirčių visame pasaulyje [3]. Maždaug 90% visų skrandžio vėžio yra adenokarcinoma, kylantys iš epitelio [4]. Pagal Lauren klasifikacinių skrandžio vėžio yra skirstomi į dvi pagrindines histologinių potipių, žarnyno ir difuzinis [5].
Skrandžio adenokarcinoma, kaip ir daugelis kitų kietų navikų epitelio kilmės, dažnai sudėtingų, kalbant apie chromosomų vientisumą [6, 7]. Piktybinio skrandžio navikai yra žinoma, kad atlikti daug aberacijų jų genomą ir tokių chromosomų pakitimai yra labai svarbūs įjungimo ir nukenksminimo vėžio susijusių genų [8-17]. Genų kopijų skaičiaus kaita yra vienas iš pagrindinių mechanizmų vėžio ląstelių kontroliuoti genų lemiamas ląstelių išlikimas ir vėžio progresavimo [17-22] išraiška. Šie kopijos numerį, pakitimai dažnai apima didelę grupę genų, esančių arti viena kitos toje pačioje chromosomoje. Pavyzdžiui; skrandžio vėžio į dažnai sustiprina 17q12-Q21 regionas yra genų, pavyzdžiui, erbb2
, GRB7
, jup
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
ir TOP2A
[14, 17, 23]. Tačiau tik šių genų mažuma gali būti tikrieji vėžys vairuotojas genai, prisidedantys prie Tumorigenesis, o kiti gali būti papildytas vien dėl jų chromosomų artumo su amplifikacijos tikslinių genų [24, 25]. Vienas metodas atskirti tokius vairuotojo genus iš lengvųjų mutacijų yra integruoti genomo kopijų skaičių ir išraiška duomenis, kurie leidžia genų, kurių transkripcijos aktyvavimo ar represijų yra susijęs su kopijų skaičiaus pokyčius vėžio ląstelių identifikavimą. Taigi, derinant informaciją iš didelės raiškos genų kopijų skaičiaus ir raiškos mikrogardelių, tai galima ne tik nustatyti ribines vertes kopiją skaičius keisis labai išsamiai, bet taip pat įvertinti funkcinę reikšmę šių pokyčių, ir todėl galbūt nustatyti genus, kurie vairuoti vėžį pasireiškimo laiką bei eigą.
Norėdami paryškinti genus potencialius kaip biologinių žymenų ar klinikinių tikslų skrandžio vėžio, mes atlikti sistemingą didelės skiriamosios gebos matrica-paremtą tyrimą kopija skaičių ir genų ekspresijos lygių skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų. Mūsų Ankstesnis masyvo pagrindu analizė parodė, kad kopijos numerį, pelnas ir nuostoliai šimtų genų yra susiję su tuo pačiu metu padidinti ar sumažinti genų ekspresiją [17]. Šioje studijoje, mes padidino kopijų skaičiaus analizės rezoliuciją nei 20 kartų tiksliau vizualizuoti kopijos numeris pokyčių ribines vertes. Be to, mes turime atlikti transkripcijos analizę genų, esančių pakitusiu chromosomų regionai identifikuoti genus, kurių reguliavimo panaikinimas yra susijęs su piktybinio fenotipą.
Metodai
skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų
Ši mokslinių tyrimų projektas buvo peržiūrėtas ir patvirtino etikos į medicininės genetikos katedros komiteto ir chirurgijos ir įgaliotas klinikinės ekspertizės valdyba Helsinkio universiteto centrinėje ligoninėje. Skrandžio audinio mėginiai buvo perspektyviai surinkti iš pacientų, kuriems buvo atlikta skrandžio operacija arba gastroskopija Helsinkio universiteto centrinėje ligoninėje tarp 1999 ir 2007 m Informuotas sutikimas buvo gautas iš kiekvienos dalyvaujančios pacientui. Trylika šviežios šaldytos pirminis navikas audiniai ir septyni skrandžio vėžio ląstelių linijos buvo pasirinkta mikrogardeliq analizė (1 lentelė). Audinių medžiaga sudaryta iš dviejų skirtingų histologinio potipio, žarnyno (n = 9) ir difuzinis (n = 4) ir navikai buvo esantis dviejose skirtingose ​​vietose, skrandžio, tekstyno (n = 8) ir Ertmė (n = 5 ). Iš viso 111 skrandžio audiniai ir 7 skrandžio vėžio ląstelių linijos buvo įtrauktos į KRL-PGR ir giminystės surinkimo remiantis stenograma analizė (TRAC) analizuoja (papildomas failą 1: Klinikiniai parametrus). Audinių mėginiai sudarė 43 nonmalignant ir 68 vėžinių skrandžio audinių ir atstovavo abu histologiniai potipiai skrandžio vėžiu (žarnyno, N = 42; difuzinis, N = 25; viena nežinoma histologiją). Skrandžio audinio mėginiai buvo laikomi -80 ° C temperatūroje. Norėdami patikrinti, ar naviko procentą ir histologinių mėginių, šaldytos mėginiai buvo įdėta į audinių Tek UŠT junginys (Sakura Finetek, Torrance, CA, JAV) ir 5 mkm ledas sekcijos buvo parengta ir dažomi Trypan mėlyna. Histologija skrandžio vėžio egzempliorių buvo įvertintas patyręs patologas (M.-L. K.-L.). Audinių Tek buvo pašalintas iš audinių prieš nukleorūgščių extractions.Table 1 klinikinį parametrus analizuotų ant masyvas lyginamoji genomo hibridizacijos (aCGH) mėginius ir išraiška mikrogardelių Pradinių.
skrandžio tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Skrandžio vėžio ląstelių linijas
Amžius /Sex
Histologija
kilmės
AGS
54 /F
adeno-karcinoma
Pirminis navikas
KATOIII
55 /M
Difuzinė
Skystis pleuros ertmėje
MKN-1
72 /m
adeno-suragėjusių karcinoma pervežimas limfmazgių metastazių
MKN-7
39 /m
Žarnų
Limfmazgių metastazės
MKN-28
70 /F
Žarnų
Limfmazgių metastazės
MKN-45
62 /M
Difuzinė
metastazių kepenyse
TMK-1
21 /M
Difuzinė
limfmazgių metastazių
AGS ir KATOIII ląstelių linijos buvo gautos iš Amerikos tipas kultūros kolekcijos (Rockville, MD, JAV) ir MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45 ir TMK-1 ląstelių linijos buvo natūra dovana Hiroshi Yokozaki, Kobe universiteto Graduate School of Medicine, Kobė, Japonija [26]. AGS ląstelės buvo auginamos Kaighn s F12 terpėje (2 mM glutamino, 10% FBS, 100 V /ml penicilino-streptomicino), KATOIII ląstelės IMDM terpės (2 mM glutamino, 10% FBS, 100 V /ml penicilino-streptomicino) ir visų kitų ląstelių linijos RPMI-1640 terpėje (10% FCS, 2 mM glutamino, 100 U /ml penicilino-streptomicino). Visos ląstelės buvo auginamos 37 ° C temperatūroje ir 5% CO 2.
RNR ir DNR ekstrakcija
Prieš Traukiant RNR ir DNR, sušaldytos audinių buvo panardintas į RNAlater-ICE reagento (Ambion, Austin, TX , JAV), ir prie -80 ° C temperatūroje 16 valandų stabilizuoti RNR. Pusė audinio mėginio, kontaktavimo (~ 25 mg) buvo homogenizuoti RLT-β-merkaptoetanolio lizės buferiniame tirpale (RNeasy mini rinkinys, Qiagen Inc, Hilden, Vokietija), o kita pusė į ATL-buferio (DNeasy kraujo ir audinių rinkinys, Qiagen) naudojant Ultra Thurex homogenizatorių (IKA darbai, Wilmington, NC, JAV). RNR išskirta naudojant RNeasy mini rinkinys, įskaitant neprivalomą dezoksiribonukleazės gydymo ir DNR naudojant DNeasy kraujo ir audinių rinkinys. Skrandžio vėžio ląstelių linijų, 1 × 10 7 ląstelės buvo lizuoti Naudojant švirkštą ir adatą arba RLT-β-merkaptoetanolio lizės buferyje ar ATL-buferio iki Traukiant RNR ir DNR, atitinkamai. RNR ir DNR koncentracija buvo matuojama naudojant NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV) ir RNR kokybė buvo vertinama naudojant Agilent 2100 Bioanalyzer (AGILENT TECHNOLOGIES, Palo Alto, CA, JAV). Tik RNR rodantys skirtingą 18S ir 28S ribosomos smailes Bioanalyzer analizė ir 260/280 santykis buvo didesnis 2,0 buvo priimtas tolesnei analizei.
Masyvas CGH ir genų ekspresijos Mikrogardelė analizuoja
buvo analizuojami Trylika skrandžio navikai ir septyni skrandžio vėžio ląstelių linijos nuo 244K žmogaus genomo CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Trys iš navikų ir visų septynių ląstelių linijų, taip pat buvo analizuojami naudojant 44k Visa žmogaus genomo genų ekspresijos oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (1 pav.) Vidutiniai 260/280 santykis šių mėginių buvo 2,1 RNR ir 1,8 DNR, ir visi RNR mėginių turėjo aiškius 18S ir 28S ribosomos pikų Bioanalyzer analizę nurodant geros kokybės (nerodomas duomenys). Array CGH eksperimentai buvo atlikti naudojant Žmogaus genomo CGH mikrogardeliq 244A rinkinį (Agilent Technologies). Ženklinimo ir hibridizacija buvo atliekami pagal Agilent protokolo (5.0, 2007 birželis). Trumpai tariant, 1,5 mikrogramų mėginio DNR ir 1,5 mikrogramų sekso atitikimo informacinės DNR (Žmogaus Genomo DNR, Promega Madison, WI, JAV) buvo dukart suardomas AluI parsisiųsti ir RsaI
restrikcijos fermentų (PROMEGA). Suvirškintas DNR buvo ženklinami naudojant "Agilent genomo DNR ženklinimo Kit Plus. Mėginio DNR buvo paženklinti Cy5-dUTP ir informacinių DNR su Cy3-dUTP, atitinkamai. Paženklinti DNR buvo išvalytas su Microcon YM-30 filtrų (MILLIPORE, BILLERICA, MA, JAV). Po į valymo, mėginys ir pagalbos DNR buvo sujungtos ir kryžminosi į masyvą su 50 mikrogramų Žmogaus Lopšys-1 DNR (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) 65 ° C, 20 min 40 h. Buvo atliekama hibridizacija su Agilent oligo aCGH hibridizacijos Kit. Prieš nuskaitymą, skaidres buvo plaunamos pagal protokolą. Be mėginio DNR hibridizacija aukščiau aprašytų, nuoroda Vyriška DNR (Cy3) buvo kryžminosi prieš ataskaitinį moterų DNR (Cy5) pagal tą patį protokolą, kuris bus naudojamas kaip atskaitos masyvas aCGH duomenų analizė. 1 pav struktūrinė schema apibūdinant įvairias veiksmus studijos.
Genų ekspresijos eksperimentai buvo atlikti naudojant visas žmogaus genomo oligo mikrogardeliq rinkinį (Agilent Technologies) ir ženklinimo ir hibridizacija pagal Agilent protokolą (v5.7, 2008 kovas). Trumpai tariant, 2 mikrogramų viso mėginio RNR ir atskaitos RNR (iš 10 vėžio ląstelių linijas, baseinas, ne skrandžio, ATCC, Manasasas, MA, JAV) buvo paženklinti naudojant "Agilent Greita Amp ženklinimo Kit. Pavyzdys RNR buvo paženklinti Cy5-dCTF ir informacinių DNR su Cy3-dCTF, atitinkamai. tada paženklinti RNR buvo išgrynintas naudojant RNeasy mini spin stulpelius (Qiagen). Buvo atliekama hibridizacija su Agilent genų ekspresijos, hibridizacijos Kit ir mėginiai buvo hibridizuoti 65 ° C temperatūroje, 10 apsisukimų per minutę už 17 h ir plaunami pagal protokolą prieš nuskaitymą. Abu aCGH ir genų ekspresijos mikrogardeliq skaidres buvo nuskaitomi naudojant DNR mikrogardeliq Skeneriai (Agilent Technologies) ir analizuojami su atvaizdo požymių išskyrimo Programinė įranga (v9.5.1.1.).
Aukštos raiškos kopijos numeris profiliavimo
Visi kopijų skaičiaus duomenys rasti adresu: http:. //www cangem org (prisijungimas numeris: CG-EXP-49). [27]. Agilent CGH Analytics "programinė įranga (v3.5.14) buvo taikoma siekiant nustatyti kopijų skaičių pokyčius. Mikrogardeliq duomenys kokybės filtruotas naudojant atmetus informaciją, gautą iš požymių išskyrimas analizė. Zondai pažymėtas kaip išskirčių buvo pašalintas iš tolesnei analizei. Be to, buvo taikomi šie aberacijos filtrai: mažiausias skaičius zondai Regione = 3, minimali absoliuti žurnalas 2 santykis regione = 0,27, o didžiausias skaičius neįprastos regionuose = 1000. žurnalas 2 santykis 0,27 ty 1,2 karto pokyčio kopijų skaičiaus. Be CGH Analytics kiekvienas aCGH santykis pirmą kartą buvo konvertuojami į žurnalą 2 santykiu po to Z-normalizuoti. Vyrų vs moterų atskaitos masyvo buvo naudojamas kaip kalibravimo masyvo duomenų analizę. Dėl lyčių skirtumų tarp masyvų, kurie galėtų sukelti šališkumo atliekant analizę, chromosomos X ir Y buvo pašalintas iš kalibravimą. ADM-2 algoritmą su ribinį dydį 12,0 buvo naudojami siekiant nustatyti genų kopijų skaičiaus pakitimus atskirų mėginių ir ląstelių linijų. Minimalūs bendri regionai pokyčių 20 mėginių buvo apskaičiuotos, įskaitant į bazinių porų keitimo dydžio ir chromosomų padėtį. Aberacijos buvo apibrėžtas kaip pasikartojantį, jei jis buvo pateikti ne mažiau kaip 25% mėginių (2 lentelė) .table 2 Minimalūs bendri regionai atsinaujinusia (≥25%) kopijos numeris pakeitimus.
keitimas
audiniai (n = 13)

Mobilaus ryšio linijos (n = 7)
Dažnio

dydis (MB)
pozicija (MB)
įmanomos naikintinos genai
+ 1q41-q43.1
2
3
25 %
17,30
216,31-233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1
1
4
25%
19.41
30,18-49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1
4
3
35%
4.60
97,33-101,93
CYP3A4, bet AZGP1, vgf
+ 8q24.13-q24.3
3%
2
25 19,8
126,45-146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3:%
2.23
143,59-145,82
GML, LYPD, AK3
6
3
45
+ 14q11.2
%
1,05
22,89-23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1
3 0
5
25
3
30%
0,28
35,02-35,30
erbb2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2
2
3
25%
13.65
50,45-64,10
AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter
4
3
35% pervežimas 29.36
33,89-63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57.94 pervežimas 0.04-57.98 pervežimas PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7 pervežimas pervežimas -9p24.3-P21 0,1
3
4
35%
27.81
1,05-28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2
26.11 pervežimas 39.48-65.59 pervežimas Smad7 3
5
40%, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter
2
5
35%
3.69
70,95-74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1
3
3
30%
4.07
14,37-19,44
HSPA13
-Xq28
4%
1
25 1.21
152.24- 153,45
- CR.LT atvejų skaičius, dydis iš minimalių bendrų regionų (MB), ir dėl tokių pakeitimų (MB) chromosominės padėtyje yra nurodyta taip pat galimus tikslinės genai. CNV regionai nėra parodyta lentelėje. . Kopijuoti skaičius pelnas (+),, kopijuoti skaičius nuostolis (-)
Genų ekspresiją Mikrogardelė analizė
Visi genų ekspresijos duomenų galima rasti adresu: http: //www cangem org (prisijungimas numeris: CG-TINKA.. -49) [27]. Mikrogardeliq rezultatai buvo kokybės filtruotas naudojant apibrėžtus pagal požymių išskyrimas Programinė įranga išsiskiriančiomis ir normalizuota pagal Lioso metodą, kuris buvo įtrauktas į programinės įrangos paketo dalis. Genų ekspresijos analizė buvo tik genų, esančių chromosomų regionai, kurių pasikartojančių aberacijos (2 lentelė). Šio metodo tikslas buvo pabrėžti genų ekspresijos pokyčius, kurie buvo susiję su pokyčiais geno kopijų skaičiaus, todėl gali atstovauti potencialius onkogenų ar navikas slopinančias genus su funkciniu vaidmeniu vėžio. Pirma, mediana log10 išraiška rodiklis buvo apskaičiuotas visų daviklių, skirtų tą patį geną. Tada, du atskiri analizes pelno ir nuostolių, vidutinė išraiška lygis kiekvieno geno buvo lyginami tarp mėginių Kopijuoti skaičius pelnas /nuostolis ir pavyzdžių su normalia kopijų skaičiaus įvertinti kopija skaičius pokyčių poveikį genų ekspresiją. Genų ekspresijos nuleidžiamas pokyčiai (FC), buvo apskaičiuotas dalijant mediana išraišką vėžinių mėginių vidurine išraišką nonmalignant pavyzdžių arba dalijant mediana išraišką vėžio mėginių kopija skaičius pokyčių (G1) vidurinė išraiška vėžio mėginiai su normaliu kopijų skaičiaus (G0). Bent 2 kartus kopija numeris, susietas pokytis genų ekspresijos buvo laikoma reikšminga. Remiantis šiais duomenimis, 13 genai ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
CYP3A4
, ENAH
, erbb2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
PNMT
ir PTPRA
, buvo pasirinkta būti toliau patikrintas su KRL-PGR analizės ir TRAC (stenograma analizės pagalba giminystės surinkimo) tyrimu. Rezultatai nuo integruotos mikrogardeliq analizę buvo lyginamas su trimis anksčiau paskelbtais tyrimais, kad sistemingai integruoti genomo kopijų skaičiaus ir genų ekspresijos duomenis [15-17].
Realaus laiko KRL-PGR analizė
realiu laiku qRT- PGR buvo atliekama 2 genų, ALPK2
(18q21.31-q21.32) ir HHIPL2
(1q41). Sąvoka lygiai buvo matuojami 82 skrandžio audinių (46 vėžinių ir 36 nonmalignant audinius) ir 7 skrandžio vėžio ląstelių linijų (Papildoma failų 1: Klinikiniai parametrus). 1 mikrogramų bendra RNR buvo konvertuojami į cDNR naudojant Moloney-pelių leukemijos viruso atvirkštinės transkriptazės (PROMEGA, Madison, WI, JAV) ir atsitiktinius pradmenis (Invitrogen), kuriame yra 50 pL 1 h tūrio 37 ° C temperatūroje. Po to reakcijos mišinys šilumos-inaktyvuojamas (95 ° C, 3 minutės) ir užpildyti iki galutinio tūrio 200 pL su molekulinės grynumo vandeniu. Suvestinės buvo kiekybiškai naudojant Bandymai-On-DemandTM genų ekspresijos produktai (Hs01085414_m1 už ALPK2
ir Hs00226924_m1 už HHIPL2
) pagal gamintojo protokolą (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV). Visi gruntai buvo įsikūręs Exon-Exon ribų. Trumpai, 2 mikrol, iš kDNR šabloną buvo sumaišyti su 1,25 įxL pradmenis ir zondai pažymėtas FAM-reporterio dažų. 12.5 įxL TaqMan ® Universal PGR pagrindinio mišinio ir RNazės-laisvojo vandens buvo įtraukta į bendras tūris 25 įxL. Žmogaus 18S rRNR tarnavo kaip endogeninio kontrolės normalizuoti raiškos lygį vėliau kiekybinė analizė. 18S zondas buvo paženklinti VIC-reporteris dažų leisti daugkartinis PGR su tikslinių genų. PGR sąlygos buvo taip: 50 ° C temperatūroje 2 min, 95 ° C temperatūroje 10 min, po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 15 s ir 60 ° C temperatūroje 1 min. Kiekvienas mėginys buvo matuojamas trimis egzemplioriais ir duomenys buvo analizuojami delta delta metodas lyginant santykinius raiškos rezultatus (2 - [ct pavyzdys-CT kontrolė])
TRAC tyrimas
stenograma analizės pagalba. giminingumas surinkimo (TRAC) Analizės [28] buvo atliekama 11 skirtingų genų, 88 skrandžio audinių (53 vėžinėmis ir 35 nonmalignant audinius) ir 7 skrandžio vėžio ląstelių linijų (Papildoma failų 1: Klinikiniai parametrus). Įtraukti į analizę genai buvo ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1) CYP3A4
(7q21.1) ASAP1
(8q24.1-q24.2) LTB4R
(14q11.2-Q12), PERLD1
(17q12), erbb2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-Q13 0,2), PTPRA
(20p13) ir MMP9
(20q11.2-q13.1). Priemonės, kuriomis TRAC tyrimo privalumas yra tai, kad ekspresijos lygis daugelio genų gali būti matuojamas tuo pačiu metu iš vieno pavyzdžio todėl sumažėja mėginio RNR kiekį, reikalingą analizei. Tai ypač svarbu dėl dažnai ribotų klinikinių audinių mėginių analizę.
TRAC analizė buvo atlikta PlexPress (Helsinkis, Suomija). Pasirinktinis TRACPackTM reagentai mRNR (PlexPress) buvo naudojami analizei. Trumpai tariant, 90 mikrol hibridizacijos Mix (kurių sudėtyje yra paženklinti genų būdingų aptikimo zondai ir Biotinilinta oligo-dT zondai) per gerai buvo atiduotos 96 gerai PGR plokštelės. Du mikrogramų RNR mėginio buvo taikomas į kiekvieną šulinėlį į 100 pL viso reakcijos tūrio. Vienodo dydžio (30 amol /reakcija) iš vienos dideles 62-Mer sintetinės oligonukleotidas hibridizacijos kontrolės, įskaitant poli-A uodegą, buvo įtraukta į kiekvieno mėginio prieš hibridizacijos. Buvo atliekama hibridizacija esant 60 ° C, 650 apsisukimų per minutę 120 minučių (Thermomixer komfortą, Eppendorfo, Hamburgas, Vokietija). Po hibridizacijos afiniteto surinkimo, valymo ir išskyrimui buvo padaryta naudojant Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Suomija) magnetinėmis dalelėmis procesoriaus. Avidino-kartu magnetiniai TRACPACK ™ karoliukai (50 mikrogramų, PlexPress) buvo pridėta prie hibridizacijos mišinio ir leidžiama įpareigoti biotinilinto iRNR-zondo-oligo (dT) -hybrids 30 minučių, po kurių karoliukai buvo plaunami 5 kartus per plovykla buferis pašalinti bet kokį nesusiję medžiagą. Paženklinti RNR konkrečių zondai buvo išplaunami su eliuavimo buferio ir nustatoma kapiliarinės elektroforezės, naudojant ABI3100 sekwencer (Taikomoji BIOSYSTEMS, Cheshire, Jungtinė Karalystė). Duomenys buvo analizuojami naudojant TRACParser programinę įrangą (PlexPress).
Statistinė analizė KRL-PGR duomenų
A neparametrinį Mann-Whitney testą dviejų nepriklausomų pavyzdžių buvo taikomi siekiant nustatyti, statistinį reikšmingumą skirtumų santykinio iRNR išraiškos lygiai ALPK2
ir HHIPL2
nonmalignant ir vėžinių skrandžio mėginius, taip pat skrandžio vėžio mėginiai iš skirtingų histologinių potipių ar TNM-etapuose. P-vertė < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas (SPSS 17.0). Be to, du atskiri analizes pelno ir nuostolių, ekspresijos lygis vėžiu mėginių kopijos numerį, pelnas ar nuostoliai (G1) buvo palyginti su vėžio mėginiai su normalia kopijų skaičiaus (G0) įvertinti tarp kopijų skaičiaus ir genų ekspresijos asociacija. Kopijuoti numeris duomenys buvo prieinami 37 skrandžio mėginius, įtrauktų į KRL-PGR analizė (Papildoma failų 1: Klinikiniai parametrus). Genų ekspresijos nuleidžiamas pokyčiai buvo apskaičiuojamas dalijant reiškia išraišką vienos grupės (pvz vėžio mėginiai) iki vidutinio išraiškos kitai grupei (pvz nonmalignant mėginiai).
Statistiniai analizė TRAC pagrindinius branduolinių medžiagų analizės duomenimis
sintetinis hibridizacrlos kontrolę buvo naudojamas duomenų normalizavimo pašalinti bet kokį ne-biologinį kitimą, duomenimis. Kiekvienai tikslinei, signalo intensyvumo santykinius šios vidaus hibridizacijos kontrolės buvo apskaičiuota. Devynių analizuojamų atkartoti audinių mėginiai buvo naudojamas signalo intensyvumas. Neparametrinis Mann-Whitney testas dviejų nepriklausomų pavyzdžių buvo taikomi siekiant nustatyti, statistinį reikšmingumą skirtumus santykinius iRNR ekspresijos lygio ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, erbb2, LTB4R
MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
ir PTPRA
nonmalignant ir vėžinių skrandžio mėginius, taip pat skrandžio vėžio mėginiai iš skirtingų histologinių potipių ar TNM-etapais. P-vertė < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas (SPSS 17.0). Genų ekspresijos lygio palyginimas mėginių su ir be kopijų skaičiaus pakitimai buvo atliktas buvo aprašyta anksčiau už KRL-PGR analizei. . Kopijuoti numeris duomenys buvo prieinami 43 skrandžio vėžiu mėginių įtraukti į TRAC bandymo analizę
rezultatai
Genų kopijų skaičiaus aberacijos
Visi genų kopijų skaičiaus pokyčius individualių mėginių parodyta papildomame faile 2: Copy skaičiaus kitimas aptikta aCGH analizė. Minimalūs bendri regionai atsinaujinusia (≥25%) pakitimų, taip pat į jų dydį, dažnumą, galimas tikslines genai ir chromosomos Pozicija bazinių porų yra parodyta 2 lentelėje periodinis įgijo regionai buvo įsikūręs 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), ir 20p13-qter (40%). Periodiniai ištrinta regionai buvo įsikūręs 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), ir Xq28 (25%). Visi pasikartojantys kopijų skaičiaus pokyčiai buvo aptikti tiek pirminių skrandžio vėžio ir skrandžio vėžio ląstelių linijų, išskyrus 14q11.2, kuris buvo pakeisti tik penkiais ląstelių linijų.
Kopijuoti numeris, susietas genų ekspresiją keičia
viso 256 asmuo genai (10% visų esančių pasikartojančių chromosomų regionai, kurių kopija skaičius pakitimų genuose) parodė, bent 2 kartus kopija numeris, susietas pokyčius jų raiškos (nuo 2,0-34,6, mediana 3,8) (Papildoma failą 3: kopija numeris, susietas genas ekspresijos pokyčiai). 226 iš šių genų buvo ekspresija ir įsikūręs pasikartojančių regionuose kopijų skaičiaus prieaugio, o 30 genai buvo underexpressed ir įsikūręs pasikartojančių regionuose kopija skaičius nuostolių. Kartų kaita genų ekspresijos buvo apskaičiuojamas lyginant raiškos lygius mėginių kopija skaičių pakeitimų pavyzdžius su normaliu kopijų skaičiaus tam tikroje geno. Todėl teigiamas kartų kaita reiškia kopijų skaičiaus padidėjimas susijęs didesnis genų ekspresijos kadangi neigiamas kartų kaita reiškia kopija skaičius nuostolių, susijusių sumažėjimo genų ekspresiją.
HHIPL2
(HHIP-kaip 2) genas, sustiprina į 1q41-q43.1 regione, parodė aukščiausią kopiją skaičius įgyti susijusią raiška skrandžio vėžio pagal integruotos mikrogardeliq analizė (FC = 26,9). Paprastai, didžiausia genų ekspresijos kartų pokyčius tarp vėžio mėginiai su ir be kopijų skaičiaus prieaugis buvo aptikta ne 19q regione nuo iš 40 genų, rodančių > buvo įsikūręs 5 kartus kopija numeris, susietas pokyčiai jų raiškos, 19 (47,5%) į 19q regionas (Papildoma failų 3: kopija numeris, susietas genų ekspresijos pokyčius). Patys underexpressed geno pasikartojančių regionuose kopijos numeris nuostolių buvo ALPK2
(Alpha-kinazės 2) (FC = -34,6), esančių 18q12.3-q22.2.
Anksčiau trys tyrimai JAV ir kitų buvo paskelbta, kad sistemingai integruoti genomo kopijų skaičiaus ir genų ekspresijos duomenis identifikuoti genus, kurių išraiška pasikeitė dėl kopijų skaičiumi pakeitimo skrandžio vėžio [15-17]. Iš sutampančių genų tarp šių tyrimų ir dabartinio tyrimo palyginimas atskleidė 20 genus TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), MTAP
(9q21 0,3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), erbb2
(17q12-q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2) ir TUBB1
(20q13.32), kurie buvo arba įgijo ir ekspresija arba ištrintas ir underexpressed mūsų tyrime ir bent vienas iš anksčiau paskelbtais tyrimais. Anksčiau paskelbė duomenis kartu su dabartine rezultatai pateiktų papildomų įrodymų, biologinio vaidmenį šių genų skrandžio vėžio.
Patvirtinimas potencialių skrandžio vėžys tikslinių genų
Realaus laiko KRL-PGR analizė parodė, kad HHIPL2 buvo 7,4 kartus didesnis skrandžio vėžio mėginių, palyginti su nonmalignant skrandžio audinių (p < 0,05). Be to, HHILP2
raiška buvo reikšmingai susijęs su kopijų skaičiaus padidėjimas (p < 0,05), kaip ir HHIPL2
išraiška buvo 17,4 karto didesnė vėžio mėginiai su kopijų skaičiaus pelnas HHIPL2
(G1 ) nei vėžio mėginiai su normalia kopijų skaičiaus šio geno (G0) (3 ir stalai 4). Pasak KRL-PGR analizei buvo 2,9 karto underexpression iš ALPK2
skrandžio vėžio Kopijuoti skaičius nuostolių (G1), palyginti su skrandžio vėžio su normalia kopija skaičių ALPK2
(G0) (p < 0,05 ). Keista, tačiau ALPK2
skrandžio vėžio apskritai išraiška buvo 1,9 karto didesnis (p < 0,05) nei nonmalignant skrandžio audinių (3 ir 4 lentelėse). Histologinis potipis arba TNM stadija neturėjo statistiškai reikšmingos įtakos HHIPL2
arba išraiškos ALPK2
(3 lentelė) .table 3 rezultatai neparametrinis Mann-Whitney testas su KRL-PGR ir TRAC analizės duomenys (SPSS17.0).
Genų
Chromosomų
Vėžys vs nepiktybinis
žarnyno vs difuzinis
G1 vs G0
M0 vs M1
T1-2 vs T3-4

N0 vs N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0,05
psl
= 0,104
psl
< 0,05
psl
= 0,451
psl
= 0,072
psl
= 0,378
ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0.001
psl
= 0,319
psl
= 0,396
psl
= 0,208
psl
= 0,232
psl
= 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0.001
psl
= 0,061
psl
= 0,254
psl
= 0,543
psl
= 0,197
psl
= 0,253
CYP3A4

• Prognostinė reikšmė neutrofilų limfocitų santykis ir trombocitų limfocitų santykis išplitusiu skrandžio vėžiu sergančių pacientų, gydytų FOLFOX chemoterapijos
• Naujų metodas, skaitmeninis genomo nuskaitymo aptinka KRAS geno amplifikacija skrandžio vėžio: dalyvavimą ekspresija laukinio tipo KRAS į vartotojų signalizacijos ir vėžio ląstelių augimą