Pangénomique nombre de copies du gène et l'analyse d'expression des tumeurs gastriques primaires et lines

de cellules de cancer de l'estomac du génome entier du nombre de copies des gènes et l'analyse d'expression des tumeurs gastriques primaires et des lignées cellulaires de cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
cancer gastrique est l'une des tumeurs malignes les plus courantes dans le monde et la deuxième cause la plus fréquente de cancer lié la mort. nombre de copies de gènes modifications jouent un rôle important dans le développement du cancer gastrique et un changement dans le nombre de copies est l'un des principaux mécanismes pour une cellule cancéreuse pour contrôler l'expression des oncogènes potentiels et les gènes suppresseurs de tumeurs.
Méthodes
Pour mettre en évidence les gènes présentant un intérêt biologique et clinique potentielle dans le cancer gastrique, nous avons réalisé une enquête sur la base du tableau systématique de l'expression génique et la copie des niveaux numériques dans les tumeurs gastriques primaires et des lignées cellulaires de cancer gastrique et validé les résultats en utilisant une analyse de la transcription en fonction capture par affinité ( Résultats de TRAC assay) et en temps réel qRT-PCR.
analyse des microréseaux intégrée a révélé au total 256 gènes qui ont été situés dans des régions récurrentes des gains ou des pertes et ont eu au moins un changement associé 2 fois copie number- dans leur l'expression du gène. Les niveaux de 13 de ces gènes, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, ERBB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1 , PNMT
, PTPRA
et OSMR
, ont été validés dans un total de 118 échantillons gastriques en utilisant soit le qRT-PCR ou de dosage de TRAC. Tous ces 13 gènes ont été exprimés différemment entre les échantillons cancéreux et les tissus non malignes (p < 0,05) et l'association entre le nombre et l'expression des gènes copie des modifications a été validé pour neuf (69,2%) de ces gènes (p < 0,05).
conclusion
En conclusion, l'expression du gène intégré et l'analyse des microréseaux du nombre de copies ont mis en évidence les gènes qui peuvent être d'une importance cruciale pour la carcinogenèse gastrique. TRAC et qRT-PCR analyses ont validé les résultats de puces à ADN et donc le rôle de ces gènes comme biomarqueurs potentiels pour le cancer gastrique.
Contexte
En raison de l'absence de symptômes précoces adénocarcinome gastrique est caractérisée par le diagnostic à un stade avancé et les options insatisfaisantes pour traitement curatif [1, 2]. Malgré la baisse de son incidence au cours des dernières décennies, le cancer gastrique reste la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde [3]. Environ 90% de tous les cancers gastriques sont des adénocarcinomes de l'épithélium [4]. Selon les cancers gastriques de classification de LAUREN sont divisés en deux principaux sous-types histologiques, intestinaux et diffus [5].
Adénocarcinomes gastriques, comme beaucoup d'autres tumeurs solides d'origine épithéliale, sont souvent complexes en termes d'intégrité chromosomique [6, 7]. tumeurs gastriques malignes sont connus pour transporter plusieurs aberrations dans leur génome et ces altérations chromosomiques sont cruciales pour l'activation et l'inactivation des gènes liés au cancer [8-17]. Gène changement du nombre de copies est l'un des principaux mécanismes pour une cellule cancéreuse pour contrôler l'expression des gènes de pivotement à la survie cellulaire et la progression du cancer [17-22]. Ces altérations du nombre de copies comportent souvent un grand groupe de gènes situés à proximité les uns des autres dans le même chromosome. Par exemple; dans les cancers gastriques de la région 17q12-q21 de fréquemment amplifié contient des gènes tels que ERBB2
, GRB7
, JUP
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
et TOP2A
[14, 17, 23]. Cependant, seule une minorité de ces gènes sont susceptibles d'être les gènes du cancer du conducteur contribuant à la tumorigenèse vrais, alors que d'autres peuvent être amplifiés simplement en raison de leur proximité chromosomique des gènes cibles d'amplification [24, 25]. Une approche pour distinguer ces gènes du pilote à partir des mutations particulières consiste à intégrer le génome entier du nombre de copies et des données d'expression, qui permet l'identification de gènes dont la transcription d'activation ou de répression est associée à un changement du nombre de copies dans une cellule cancéreuse. Ainsi, en combinant les informations de la haute résolution des copies du gène numéro et expression microarrays, il est possible non seulement de définir des points d'arrêt de nombre de copies des changements dans le détail, mais aussi d'évaluer la signification fonctionnelle de ces changements, et donc peut-être identifier les gènes qui conduisent le cancer apparition et la progression.
Pour mettre en évidence les gènes potentiels comme biomarqueurs ou cibles cliniques dans le cancer gastrique, nous avons mené une enquête systématique sur la base-array à haute résolution du nombre de copies et l'expression des gènes dans les tissus des niveaux de cancer gastrique et des lignées cellulaires. Notre analyse à base de tableau précédente a montré que la copie des gains et des pertes nombre de centaines de gènes sont associés à une augmentation simultanée ou une diminution de l'expression des gènes [17]. Dans la présente étude, nous avons augmenté la résolution de l'analyse du nombre de copies de plus de 20 fois pour visualiser plus précisément les points d'arrêt des modifications du nombre de copies. En outre, nous avons effectué une analyse de la transcription des gènes situés dans des régions chromosomiques modifiées pour identifier les gènes dont la dérégulation est associée au phénotype malin.
Méthodes
tissus de cancer gastrique et des lignées cellulaires
Ce projet de recherche a été examiné et approuvé par le Comité d'éthique du département de génétique médicale et de chirurgie et autorisé par le Conseil d'examen clinique de l'Hôpital central de l'Université d'Helsinki. des échantillons de tissus gastriques ont été prospectivement prélevés chez des patients ayant subi une chirurgie gastrique ou gastroscopie à l'hôpital central universitaire d'Helsinki entre 1999 et 2007. Le consentement éclairé a été obtenu à partir de chaque patient participant. Treize tissus frais congelés primaires de cancer gastrique et sept lignées cellulaires de cancer gastrique ont été choisis pour l'analyse de puces à ADN (tableau 1). Le matériau de tissu est composée de deux sous-types histologiques différents intestinaux (n = 9), et diffuse (n = 4) et les tumeurs ont été localisés au niveau de deux sites différents de l'estomac, le corps (n = 8) et le sinus maxillaire (n = 5 ). Au total, 111 tissus gastriques et 7 lignées cellulaires de cancer gastrique ont été inclus dans le qRT-PCR et le test de capture par affinité à base de transcription (TRAC) analyse (fichiers supplémentaires 1: Les paramètres cliniques). Les échantillons de tissu se composait de 43 et 68 non maligne des tissus cancéreux de l'estomac, et les deux sous-types histologiques de cancer de l'estomac ont été représentés (intestinaux, n = 42; diffus, n = 25, une histologie inconnue). des échantillons de tissus gastriques ont été stockés à -80 ° C. Pour vérifier le pourcentage de la tumeur et l'histologie des échantillons, des échantillons congelés ont été intégrés dans Tissue-Tek octobre Composé (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) et 5 um glace des coupes congelées ont été préparées et colorées en utilisant Trypan Bleu. Examen histologique des échantillons de cancer gastrique a été évaluée par un pathologiste expérimenté (M.-L. K.-L.). Tissue-Tek a été retiré des tissus avant d'acide nucléique extractions.Table 1 paramètres cliniques pour les échantillons analysés sur hybridation génomique comparative (aCGH) et microarrays d'expression.
Primaire gastrique tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
des lignées cellulaires de cancer gastrique
les AGS de Age /histologie
Origine
sexe
54 /F adéno-carcinome
tumeur primitive
KATOIII
55 /M
diffuse
épanchement pleural
MKN-1
72 /M
carcinome adéno-spinocellulaire
métastases ganglionnaires
MKN-7
39 /M
Intestinal
métastase ganglionnaire
MKN-28
70 /Intestinal
métastases ganglionnaires
F
MKN-45
62 /F
diffus
métastases hépatiques
TMK-1
21 /M
diffuse
métastases ganglionnaires
lignées de cellules AGS et KATOIII ont été obtenus à partir de American type Culture Collection (Rockville, MD, USA) et MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, et TMK-1 lignées cellulaires étaient une sorte de cadeau Hiroshi Yokozaki, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, au Japon [26]. les cellules AGS ont été cultivées dans du milieu F12 de Kaighn (2 mM de glutamine, 10% de FBS, 100 U /ml de pénicilline-streptomycine), des cellules KATOIII dans du milieu IMDM (2 mM de glutamine, 10% de FBS, 100 U /ml de pénicilline-streptomycine) et toutes d'autres lignées cellulaires dans un milieu RPMI-1640 (10% de FCS, 2 mM de glutamine, 100 U /ml de pénicilline-streptomycine). Toutes les cellules ont été cultivées à 37 ° C et 5% de CO 2.
L'ARN et l'extraction de l'ADN
Avant d'ARN et d'ADN extractions, le tissu congelé a été immergé dans un réactif RNAlater-ICE (Ambion, Austin, TX , Etats-Unis) et stockés à -80 ° C pendant 16 heures afin de stabiliser l'ARN. La moitié de l'échantillon de tissu (~ 25 mg) a été homogénéisé dans un tampon RLT-β-mercaptoéthanol lyse (RNeasy mini kit, Qiagen Inc., Hilden, Allemagne) et l'autre moitié dans l'ATL-tampon (DNeasy sang et le kit tissulaire Qiagen) en utilisant l'homogénéisateur Ultra-Turrax (IKA Works, Wilmington, NC, USA). L'ARN a été extrait en utilisant le kit RNeasy, y compris le traitement à la DNase facultative, et l'ADN en utilisant le kit DNeasy du sang et des tissus. Pour les lignées cellulaires de cancer gastrique, 1 × 10 7 cellules ont été lysées à l'aide d'une seringue et d'une aiguille dans les deux RLT-β-mercaptoéthanol tampon de lyse ou de l'ATL-tampon avant d'ARN et d'ADN extractions, respectivement. Les concentrations d'ARN et d'ADN ont été mesurées en utilisant NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et la qualité de l'ARN a été évaluée en utilisant Bioanalyseur 2100 d'Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Seuls les ARN montrant distinctes 18S et 28S ribosomal pics dans l'analyse Bioanalyseur et 260/280 ratios supérieurs à 2,0 ont été acceptées pour une analyse plus approfondie. Analyses
CGH array et l'expression du gène microarray
Treize tumeurs gastriques et sept lignées cellulaires de cancer gastrique ont été analysés sur les oligoréseaux 244K Human Genome CGH (G4411B, Agilent Technologies). Trois des tumeurs et toutes les lignées cellulaires sept ont également été analysées en utilisant le 44K génome humain expression génique oligoréseaux (G4112F, Agilent Technologies) (Figure 1). Les moyennes 260/280 ratios pour ces échantillons étaient 2.1 pour l'ARN et 1,8 pour l'ADN, et tous les échantillons d'ARN ont clairement pics 18S et 28S ribosomique dans l'analyse Bioanalyseur indiquant une bonne qualité (données non présentées). Tableaux expériences CGH ont été effectuées en utilisant le kit Human Genome CGH microarray 244A (Agilent Technologies). Étiquetage et l'hybridation ont été réalisées selon le protocole du Agilent (v5.0, Juin 2007). En bref, 1,5 pg d'ADN de l'échantillon et 1,5 pg d'ADN de référence sexe appariés (ADN génomique humain, Promega, Madison, WI, USA) ont une double digestion avec AluI
et les enzymes de restriction de Rsal (Promega). L'ADN digéré a été marqué en utilisant l'ADN génomique Agilent Labeling Kit Plus. Échantillon d'ADN a été marqué avec Cy5-dUTP et l'ADN de référence avec Cy3-dUTP, respectivement. On a purifié l'ADN Marquées avec Microcon YM-30 filtres (Millipore, Billerica, MA, USA). Après la purification, l'échantillon et référence ADN ont été rassemblées et hybridées à la matrice avec 50 pg de Human Cot-1 DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) à 65 ° C, 20 rpm pendant 40 h. L'hybridation a été réalisée avec le kit Agilent Oligo aCGH Hybridation. Avant le balayage, les lames ont été lavées selon le protocole. Outre les hybridations d'ADN de l'échantillon décrit ci-dessus, la référence mâle ADN (Cy3) a été hybridé avec l'ADN femelle de référence (Cy5), selon le même protocole qui doit être utilisé comme matrice de référence dans l'analyse des données aCGH. Figure 1 Organigramme décrivant les différentes étapes de l'étude. Expériences d'expression
de gènes ont été effectuées en utilisant le kit génome humain Oligo Microarray entier (Agilent Technologies), et à l'étiquetage et à l'hybridation selon le protocole Agilent (de v5.7, Mars 2008). En bref, 2 pg d'ARN total de l'échantillon et de l'ARN de référence (un pool de lignées cellulaires 10 cancéreuses, non-gastrique, ATCC, Manassas, MA, USA) ont été marqués en utilisant l'Amp Labeling Kit Agilent rapide. ARN échantillon a été marqué avec Cy5-dCTP et l'ADN de référence avec Cy3-dCTP, respectivement. L'ARN marqué a été ensuite purifié en utilisant une mini-colonne RNeasy de spin (Qiagen). L'hybridation a été réalisée avec Agilent Gene Expression Kit d'hybridation et des échantillons ont été hybrides à 65 ° C, 10 tours par minute pendant 17 heures et on le lave selon le protocole avant la numérisation. Les deux lames de microréseaux aCGH et l'expression des gènes ont été analysés à l'aide du Microarray Scanner ADN (Agilent Technologies) et analysées avec le logiciel d'extraction d'entité (v9.5.1.1.).
Haute résolution numéro de copie profilage
Toutes les données du nombre de copies est disponible à l'adresse http: //www. cangem org (numéro d'accession: CG-EXP-49). [27]. CGH Analytics logiciel d'Agilent (de v3.5.14) a été appliqué pour identifier les modifications du nombre de copies. les données de biopuces a été filtrée de qualité en utilisant les informations obtenues à partir des valeurs aberrantes l'analyse Feature Extraction. Les sondes marquées comme valeurs aberrantes ont été éliminées de l'analyse. En outre, les filtres d'aberration suivants ont été appliqués: nombre minimum de sondes dans la région = 3, log minimum absolu 2 rapport pour la région = 0,27, et le nombre maximum de régions aberrantes = 1000. Le journal 2 rapport de 0,27 correspond à un changement de 1,2 fois le nombre de copies. Dans CGH Analytics, chaque rapport aCGH a été converti en un journal 2 rapport suivi d'un Z-normalisation. Le mâle par rapport à matrice de référence femelle a été utilisé comme matrice d'étalonnage à l'analyse des données. En raison des différences entre les sexes entre les tableaux qui pourraient causer des biais dans l'analyse, les chromosomes X et Y ont été exclus de l'étalonnage. algorithme ADM-2 avec un niveau de 12,0 seuil a été utilisé pour identifier des gènes du nombre de copies des modifications dans les échantillons individuels et des lignées cellulaires. des régions communes minimales d'altérations dans les 20 échantillons ont été calculés, y compris la taille et la position chromosomique de l'altération de paires de bases. Une aberration a été définie comme étant récurrente, si elle était présente dans au moins 25% des échantillons (tableau 2) .Table 2 régions communes minimales de récidive (≥25%) du nombre de copies des modifications.
Altération
Tissues (n = 13)
cellulaires lignes (n = 7)
Fréquence

Taille (Mb)
Position (Mb)
gènes cibles possibles
+ 1q41-q43.1
2 3
25 %
17.30
216,31 à 233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-Q11.1 1
4
25%
19,41
30,18 à 49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-Q22.1
4 3
35%
4,60
97,33 à 101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3 3
2
25%
19,8
126,45 à 146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3
6 3
45%
2.23
143,59 à 145,82
GML, LYPD,
AK3
+ 14q11.2
0
5
25%
1,05
22,89 à 23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1
3 3
30%
0,28
35,02 à 35,30
ERBB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-Q24.2 2
3
25%
13,65
50,45 à 64,10
Axin2, RNF43
+ 19q12-qter
4 3
35%
29,36
33,89 à 63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57,94

PTPRA 0,04 à 57,98, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, eya2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-p21 .1 3
4
35%
27,81
1,05 à 28,86
PAIM, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2 3
5
40%
26.11
39,48 à 65,59
SMAD7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter 2
5
35%
3,69
70,95 à 74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1 3
3
30%
4,07
14,37 à 19,44
HSPA13
-Xq28
4 1
25%
1.21
152.24- 153.45
-
Nombre de cas, la taille des régions minimales communes (Mb), et la position chromosomique de l'altération (Mb) sont indiqués, ainsi que les gènes cibles possibles. régions CNV ne sont pas indiqués dans le tableau. . Gain de numéro de copie (+), la perte de nombre de copies (-)
Gene analyse expression des microréseaux
Toutes les données d'expression génique est disponible à l'adresse http: //www cangem org (numéro d'accession: CG-EXP.. -49) [27]. les résultats de biopuces ont été filtrés en utilisant la qualité des valeurs aberrantes définies par le logiciel Feature Extraction et normalisées selon la méthode Loess, qui a été inclus dans le package logiciel. L'analyse de l'expression génique a été limitée à des gènes situés dans des régions présentant des aberrations chromosomiques récurrentes (tableau 2). L'objectif de cette approche est de mettre en évidence les changements d'expression des gènes qui ont été associés à des changements dans le nombre de copies du gène, et pourrait donc représenter oncogènes potentiels ou des gènes suppresseurs de tumeur avec un rôle fonctionnel dans le cancer. Tout d'abord, un rapport médian log10 d'expression a été calculé pour toutes les sondes ciblant le même gène. Puis, dans deux analyses distinctes pour les gains et pertes, le niveau d'expression médiane de chaque gène a été comparée entre les échantillons avec nombre de copies de gain /perte et des échantillons avec le numéro de copie normale pour évaluer l'effet du nombre de copies des modifications sur l'expression génique. expression génique facteurs de variation (FC) ont été calculées, soit en divisant l'expression médiane des échantillons cancéreux par l'expression médiane des échantillons non malins ou en divisant l'expression médiane des échantillons de cancer avec des altérations du nombre de copies (G1) par l'expression médiane des échantillons de cancer avec le numéro de copie normale (G0). Au moins un changement de deux fois le nombre de copies associées à l'expression du gène a été considérée comme significative. Sur la base de ces données, 13 gènes ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
et PTPRA
, ont été choisis pour être encore validé avec analyse et TRAC qRT-PCR (analyse de la transcription avec l'aide de la capture par affinité) dosage. Les résultats de l'analyse des microréseaux intégrés ont été comparés à trois études publiées antérieurement qui intègrent systématiquement le nombre de copies et l'expression des gènes des données de l'ensemble du génome [15-17].
Temps réel analyse qRT-PCR en temps réel
qRT- PCR a été réalisée pour 2 gènes, (18q21.31-q21.32) de ALPK2 et HHIPL2
(1q41). Les niveaux d'expression ont été mesurés dans 82 les tissus gastriques (46 cancéreux et les tissus non malins 36), et 7 lignes gastriques de cellules cancéreuses (fichier additionnel 1: Paramètres cliniques). 1 ug d'ARN total a été converti en ADNc en utilisant le virus de Moloney de la leucémie murine de transcriptase inverse (Promega, Madison, WI, USA) et des amorces aléatoires (Invitrogen) dans un volume de 50 ul pendant 1 heure à 37 ° C. La réaction était inactivé par la chaleur (95 ° C, 3 min) et rempli jusqu'à un volume final de 200 ul avec de l'eau moléculaire du sol. Les transcriptions ont été quantifiées à l'aide des produits Assays-sur-DemandTM expression génique (Hs01085414_m1 pour ALPK2
et Hs00226924_m1 pour HHIPL2
) selon le protocole du fabricant (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Toutes les amorces étaient situés sur les limites exon-exon. En bref, 2 pl de matrice d'ADNc a été mélangé avec 1,25 ul d'amorces et de sondes spécifiques marquées avec FAM-colorant rapporteur. 12,5 pi de TaqMan ® Mastermix PCR Universal et de l'eau sans RNase ont été ajoutés à un volume total de 25 ul. ARNr 18S humain a servi de témoin endogène pour normaliser les niveaux d'expression dans l'analyse quantitative subséquente. La sonde a été marquée avec 18S-CIV colorant rapporteur pour permettre la PCR multiplex avec les gènes cibles. Les conditions de PCR étaient les suivantes: 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 1 min. Chaque échantillon a été mesurée en triple et les données ont été analysées par la méthode delta-delta pour comparer les résultats relatifs d'expression (2 - [commande Ct échantillon-Ct])
test TRAC
analyse de transcription avec l'aide de. capture par affinité (TRAC) dosage [28] a été réalisée pour 11 gènes différents dans 88 tissus gastriques (53 cancéreux et 35 tissus nonmalignant) et 7 lignes gastriques de cellules cancéreuses (fichier additionnel 1: paramètres cliniques). Les gènes inclus dans l'analyse étaient ENAH
(1q42.12), (5p13.1), CYP3A4
(7q21.1) ASAP1
(8q24.1-Q24.2) de OSMR, LTB4R
(14q11.2-q12), (17q12), ERBB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-q13
PERLD1 .2), PTPRA
(20p13), et MMP9
(20q11.2-Q13.1). L'avantage de l'analyse de TRAC est que les niveaux de plusieurs gènes d'expression peuvent être mesurés simultanément à partir d'un seul échantillon abaissant ainsi la quantité d'ARN de l'échantillon requis pour l'analyse. Ceci est particulièrement important pour l'analyse des échantillons cliniques souvent rares de tissus.
Analyse de TRAC a été réalisée à PlexPress (Helsinki, Finlande). réactifs personnalisés TRACPackTM pour l'ARNm (PlexPress) ont été utilisés dans l'analyse. (Sondes contenant marqués spécifiques de gènes de détection et des sondes oligo-dT biotinylé) En bref, 90 ul de Mélange d'Hybridation par puits a distribué à une plaque de 96 puits PCR. Deux microgrammes d'échantillon d'ARN ont été appliqués à chaque puits dans un volume réactionnel total de 100 ul. Un montant égal (30 amol /réaction) de simple synthétique contrôle hybridation d'oligonucléotides 62-mer brin, comprenant une queue poly-A, a été ajouté à chaque échantillon avant l'hybridation. L'hybridation a été réalisée à 60 ° C, 650 tours par minute pendant 120 minutes (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hambourg, Allemagne). Après l'hybridation de capture d'affinité, la purification et l'élution ont été effectuées en utilisant le KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlande) processeur de particules magnétiques. magnétiques perles TRACPACK MC streptavidine couplée (50 pg, PlexPress) ont été ajoutés au mélange d'hybridation et on les laisse se lier à l'biotinylé-ARNm de sonde oligo (dT) -hybrids pendant 30 minutes, après quoi les perles ont été lavées 5 fois à l'aide de lavage tampon pour éliminer toute matière non liée. des sondes spécifiques d'ARN marquées ont été éluées avec un tampon d'élution et détectés par électrophorèse capillaire, en utilisant le séquenceur ABI3100 (Applied Biosystems, Cheshire, UK). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel TRACParser (PlexPress).
L'analyse statistique des données qRT-PCR
Un test non paramétrique de Mann-Whitney pour deux échantillons indépendants a été appliquée pour déterminer la signification statistique des différences dans l'expression relative de l'ARNm niveaux de ALPK2
et HHIPL2
dans des échantillons gastriques bénignes et cancéreuses, ainsi que dans des échantillons de cancer gastrique de différents sous-types histologiques ou TNM-étapes. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative (SPSS 17.0). En outre, dans deux analyses distinctes pour les gains et les pertes, les niveaux d'expression dans les échantillons de cancer avec copie gains numériques ou pertes (g1) ont été comparés à des échantillons de cancer avec le numéro de copie normale (G0) pour évaluer l'association entre le nombre de copies et l'expression génique. données de numéros de copie étaient disponibles pour 37 des échantillons gastriques inclus dans l'analyse qRT-PCR (fichier supplémentaire 1: Les paramètres cliniques). expression génique plier changements ont été calculés en divisant l'expression moyenne d'un groupe (par exemple, des échantillons de cancer) par l'expression moyenne de l'autre groupe (par exemple, des échantillons non malignes).
L'analyse statistique des données d'analyse de TRAC
Un contrôle d'hybridation synthétique a été utilisé dans la normalisation de données pour supprimer toute variation non biologique dans les données. Pour chaque cible, signaler les intensités relatives à ce contrôle d'hybridation interne ont été calculés. Pour les échantillons de tissus neuf analysés dans répliquée signifie l'intensité du signal a été utilisé. Un test non paramétrique de Mann-Whitney pour deux échantillons indépendants a été appliquée pour déterminer la signification statistique des différences dans les niveaux relatifs d'expression d'ARNm de ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
et PTPRA
dans des échantillons gastriques bénignes et cancéreuses, ainsi que dans des échantillons de cancer gastrique de différents sous-types histologiques ou TNM-étapes. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative (SPSS 17.0). La comparaison des niveaux d'expression génique dans des échantillons avec et sans les modifications du nombre de copies a été effectuée comme cela a été décrit précédemment pour l'analyse de la qRT-PCR. . Résultats
copie Gene nombre des aberrations de données de numéros de copie étaient disponibles pour 43 échantillons de cancer gastrique inclus dans l'analyse de l'essai de TRAC
Tout nombre de copies du gène change dans des échantillons individuels sont indiqués dans le fichier complémentaire 2: nombre de copie changements détectée par analyse aCGH. régions minimales communes de récidive (≥25%) des modifications, ainsi que leur taille, la fréquence, les gènes cibles possibles, et la position chromosomique de paires de base sont présentés dans le tableau 2. La récurrente a gagné les régions sont situées à 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-Q11.1 (25%), 7q21.3-Q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-Q24.2 (25%), 19q12-qter (35%) et 20p13-qter (40%). Les régions supprimées récurrentes sont situées à 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %) et Xq28 (25%). Toutes les modifications du nombre de copies récurrentes sont détectables à la fois dans les cancers gastriques primaires et dans les lignées cellulaires de cancer gastrique, à l'exception du 14q11.2, qui a été modifié que dans cinq lignées cellulaires. Le plus Nombre de copies du gène associé à l'expression change
total 256 individuels gènes (10% de tous les gènes situés dans les régions chromosomiques récurrentes avec le nombre de copies des modifications) ont montré au moins un changement associé nombre de copies 2 fois dans leur expression (plage de 2,0 à 34,6, médiane 3,8) (fichier supplémentaire 3: Copier numéro associé gène changements d'expression). 226 de ces gènes ont été surexprimé et situés dans des régions récurrentes de nombre de copies gains, alors que 30 gènes ont été sous-exprimés et situés dans des régions récurrentes de pertes de nombre de copies. facteur de variation de l'expression génique a été calculé en comparant les niveaux des échantillons avec des altérations du nombre de copies d'expression à des échantillons avec un nombre de copies normal dans un gène donné. Par conséquent, un changement de pli positif correspond à une augmentation de gain de numéro de copie liés à l'expression du gène alors qu'un facteur de variation négative se réfère à une diminution de la perte de nombre de copies liées à l'expression du gène.
HHIPL2
(2 HHIP-like), le gène amplifié dans la région 1q41-q43.1, a montré une surexpression de gain du nombre de copies le plus élevé associé au cancer de l'estomac, selon l'analyse de puces à ADN intégré (FC = 26,9). En général, l'expression du gène le plus plier les changements entre les échantillons de cancer avec et sans nombre de copies gains ont été détectés dans la région 19q depuis des 40 gènes montrant > nombre de copies 5 fois associé des changements dans leur expression, 19 (47,5%) ont été localisés dans les 19q région (fichier supplémentaire 3: modifications Copie d'expression numéro associé du gène). Le gène le plus sous-exprimés dans les régions récurrentes de copie des pertes de nombre était (alpha-kinase 2) de ALPK2 (FC = -34.6) situé à 18q12.3-q22.2.
Auparavant, trois études menées par nous et d'autres ont été publiés qui intègrent systématiquement le nombre de copies et l'expression des gènes des données de l'ensemble du génome pour identifier les gènes dont l'expression a changé en raison d'un nombre de copies de modification dans le cancer gastrique [15-17]. La comparaison des gènes qui se chevauchent entre ces études et l'étude actuelle a révélé 20 gènes (1q42.3), GGPS1 de
de TOMM20 (1q43), CYP3A4
(7q21.1), PAIM
(9q21 .3), ASAP1
(8q24.1-Q24.2), PPP1R1B
(17q12), ERBB2
(17q12-q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), (19q13.3-Q13.4
IL4I1 ), CST3
(20p11.21), (20p13), SLC13A3
PTPRA (20q12-Q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2), et TUBB1
(20q13.32) qui ont été soit acquise et surexprimé ou supprimé et sous-exprimée dans notre étude et dans au moins une des études publiées antérieurement. Validation des données publiées antérieurement ainsi que les résultats actuels fournissent une preuve supplémentaire du rôle biologique de ces gènes dans le cancer gastrique. De gènes cibles de cancer gastrique potentiels
temps réel analyse qRT-PCR a montré que l'expression de HHIPL2
était 7,4 fois plus élevée dans les échantillons de cancer gastrique par rapport aux tissus gastriques bénignes (p < 0,05). En outre, la surexpression de HHILP2
était significativement associée à un gain du nombre de copies (p < 0,05) comme l'expression de HHIPL2
était 17,4 fois plus élevée dans les échantillons de cancer avec un gain de nombre de copies (le g1 de HHIPL2 ) que dans les échantillons de cancer avec le numéro de copie normale de ce gène (G0) (tableaux 3 et 4). Selon l'analyse qRT-PCR il y avait un underexpression 2,9 fois de ALPK2
dans les cancers gastriques avec des pertes de nombre de copies (g1) par rapport aux cancers gastriques avec le numéro de copie normale (la g0) de ALPK2 (p < 0,05 ). Curieusement, cependant, l'expression de ALPK2
dans les cancers gastriques en général était de 1,9 fois plus élevé (p < 0,05) que dans les tissus gastriques nonmalignant (tableaux 3 et 4). sous-type histologique ou TNM stade n'ont pas eu un effet statistiquement significatif sur l'expression de HHIPL2
ou ALPK2
(tableau 3) .Table 3 Résultats du test non paramétrique de Mann-Whitney pour la qRT-PCR et les données d'analyse de TRAC (SPSS17.0).
Gene
chromosome
Cancer vs.
non maligne
intestinale vs diffuse
g1 vs g0
M0 vs M1
T1-2 vs T3-4

N0 vs N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0,05
p
= 0,104
p
< 0,05
p
= 0,451
p = 0,072

p
= 0,378
ASAP1
8q24.1-Q24.2
p < 0,001
p
= 0,319
p = 0,396

p
= 0,208
p = 0,232

p
= 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0,001
p
= 0,061
p = 0,254

p
= 0,543
p = 0,197

p
= 0,253
CYP3A4

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