Nepgen-grouss Gentherapie Kopie Zuel an Ausdrock Analyse vun der Primärschoul gastric erhéijen an gastric Kriibs Zell Linnen

Nepgen-grouss Gentherapie Kopie Zuel an Ausdrock Analyse vun der Primärschoul gastric erhéijen an gastric Kriibs Zell Linnen VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs ass eent vun de meescht genannten malignancies weltwäit an der zweeter stäerkste gemeinsam Ursaach vum Kriibs Zesummenhang Doud. Gene Kopie Zuel hire Restaurant spillen eng wichteg Roll an der Entwécklung vun gastric Kriibs an e Changement vun der Gentherapie Kopie Zuel ass eent vun den Haapt Mechanismen fir e Kriibs Zell den Ausdrock vun Potential oncogenes an entholl suppressor Genen ze kontrolléieren. VerfÜgung Method VerfÜgung fir Genen vun Potential biologesch a Krankheete Relevanz vun gastric Kriibs Highlight, duerchgefouert mer eng systematesch lackeleg-baséiert aus Ëmfro vun der Gentherapie Ausdrock a kopéieren Zuel Niveauen am primäre gastric erhéijen an gastric Kriibs Zell Linnen a validéiert d'Resultater eng Affinitéit knipsen baséiert ët Analyse benotzt ( TRAC assay) an real-Zäit qRT-Hinnen alleguer. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Integréiert microarray Analyse réischt ofzeschafen 256 Genen datt an onbekannt Regioune vum Dumouriez oder Verloschter etabléiert waren an déi op d'mannst eng 2-fantastesch Kopie number- verbonne änneren an hirer Gene Ausdrock. Den Ausdrock Niveaue vu 13 vun deenen Genen, ALPK2 VerfÜgung, ASAP1, CEACAM5 VerfÜgung, CYP3A4, ENAH VerfÜgung, ERBB2 VerfÜgung, HHIPL2 VerfÜgung, LTB4R VerfÜgung, MMP9 VerfÜgung, PERLD1 , PNMT VerfÜgung, PTPRA VerfÜgung, an OSMR VerfÜgung, goufen am Ganzen 118 gastric Echantillon validéiert. an der Associatioun tëscht Kopie Zuel an der Gentherapie Ausdrock Ännerungen war validéiert fir néng (69.2%) vun dëse Genen (p &Si besteet; 0,05); All vun dësen 13 Genen huet tëscht kriibserreegend Echantillonen an nonmalignant Stoffer (0,05 p &Si besteet) differentially ausgedréckt.
Conclusioun an Conclusioun VerfÜgung, Analyse integréiert Gentherapie Ausdrock a kopéieren Zuel microarray Optakt Genen datt fir gastric carcinogenesis kritesch wichteg kënnen. TRAC an qRT-Hinnen alleguer analyséiert d'microarray Resultater validéiert an also d'Roll vun dësen Genen als potentiell biomarkers fir gastric Kriibs. VerfÜgung Background VerfÜgung Duerch d'Feele vun fréi Symptomer gastric adenocarcinoma vun spéiden Etapp Diagnos a versprach Optiounen charakteriséiert ass fir curative Behandlung [1, 2]. Trotz dem Réckgang an hir Heefegkeet vun de leschte Jorzingte, bleift gastric Kriibs d'zweet Équipe gemeinsam Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doudesfäll weltwäit [3]. Ongeféier 90% vun all gastric Cancers sinn adenocarcinomas aus der epithelium [4] opkommen. Laut sinn Lauren d'Klassifikatioun gastric Cancers agedeelt zwee Haaptgrënn histological bestemmt, intestinal an diffusen [5]. Gastric adenocarcinomas VerfÜgung, wéi vill aner staark erhéijen vun epithelial Urspronk, sinn dacks komplex a Saache vun chromosomal Integritéit [6, 7]. Malignant gastric erhéijen si bekannt fir Multiple geometrescher Figur vun hire Nepgen a sou chromosomal hire Restaurant droen si wichteg fir d'Aktivatioun an inactivation vu Kriibs-Zesummenhang Genen [8-17]. Gene Kopie Nummer änneren ass eent vun den Haapt Mechanismen fir e Kriibs Zell den Ausdrock vun Genen dréien zu Zell Iwwerliewe a Kriibs Werdegang [17-22] ze kontrolléieren. Dës Copie Zuel hire Restaurant Debate oft e grousse Grupp vu Genen Liez een aneren an der selwechter chromosome. Zum Beispill; zu gastric Cancers enthält den oft Implikatioune 17q12-Q21 Regioun Genen wéi ERBB2 VerfÜgung, GRB7 VerfÜgung, Jup VerfÜgung, PERLD1, PNMT VerfÜgung, PPP1R1B VerfÜgung, STARD3 VerfÜgung, an TOP2A
[14, 17, 23]. Mä nëmmen eng Minoritéit vun dësen Genen sinn wahrscheinlech richteg Kriibs Chauffer Genen ze tumorigenesis Contributioun ze ginn, während déi aner einfach Implikatioune kann wéinst hirer chromosomal Noperschaft mat der amplification Zil- Genen [24, 25]. Eng Approche esou Chauffer Genen vun de Passagéierverkéier Projet'en fir z'ënnerscheeden ass Nepgen-grouss Kopie Zuel an Ausdrock Donnéeën ze intégréieren, wéi d'Identifikatioun vun Genen hir transcriptional Aktivéierung oder Repressioun erlaabt ass, verbonne mat enger Kopie Zuel Ännerung vun engem Kriibs Zell. Sou, vun Informatiounen aus der Héichopléisende Gentherapie Kopie Zuel an Ausdrock microarrays kombinéiert, ass et méiglech, net nëmmen breakpoints vun Kopie Zuel Ännerungen am groussen Detail ze definéieren, mä och déi funktionell Bedeitung vun dësen Ännerungen ze evaluéieren an dofir méiglecherweis Genen identifizéieren dass Kriibs fueren agesat a Werdegang. VerfÜgung fir Genen Potential wéi biomarkers oder Krankheete Ziler an gastric Kriibs Highlight, duerchgefouert mer eng systematesch héich-Resolutioun komplett Gamme-baséiert Ëmfro vun Kopie Zuel an der Gentherapie Ausdrock Niveauen am gastric Kriibs Stoffer an Zell Linnen eraus. Eis virdrun lackeleg-Analys zougedréckt datt Kopie Zuel Dumouriez a Verloschter vun honnerte vu Genen mat engem gläichzäiteg Erhéijung oder erofgoen an Gentherapie Ausdrock verbonne sinn [17]. Am Moment studéieren, hunn mir d'Resolutioun vun der Kopie Zuel Analyse iwwer 20-fantastesch fräi méi ze wourop d'breakpoints vun der Kopie Zuel hire Restaurant visualiséieren. Doriwwer eraus, hunn mir e transcriptional Analyse vun Genen vun verännert chromosomal Regiounen wellkomm zu Genen z'identifizéieren hir Dereguléierung ass mat der malignant phenotype verbonne duerchgefouert. VerfÜgung Method VerfÜgung Gastric Kriibs Stoffer an Zell Linnen VerfÜgung Dëst Fuerschungsprojet iwwerschafft gouf a vun der ethneschen Comité vun de Pompjeeën vun Medical Genetik an befënnt an autoriséiert vun der Séminairen Kritik Verwaltungsrot vun Helsinki University Central Hospital guttgeheescht. Gastric Otemschwieregkeeten Echantillon waren elo aus Patienten gesammelt déi gastric Agrëff oder gastroscopy an der Helsinki University Central Hospital tëscht 1999 an 2007 Awëllegung mécht sech aus all zousätzlechen Patient kritt. Dräizéng frësch gefruer Primärschoul gastric Kriibs Stoffer a siwen gastric Kriibs Zell goufe fir microarray Analyse (Table 1) an dëse Match gaangen. D'Otemschwieregkeeten Material aus zwee verschiddene histological bestemmt, intestinal (n = 9) an diffusen (n = 4) an der erhéijen sech op zwee verschiddene Siten vun de Mo, den lénken (n = 8) an der antrum (n = 5 Sëtz ). Insgesamt 111 gastric Stoffer a 7 gastric Kriibs Zell Linnen waren an der qRT-Hinnen alleguer an d'Affinitéit knipsen baséiert ët assay (TRAC) Analysë (: Séminairen Parameteren Weider Fichier 1) abegraff. D'Otemschwieregkeeten Echantillon bestoung vun 43 nonmalignant an 68 kriibserreegend gastric Stoffer a béid histological bestemmt vun gastric Kriibs huet (intestinal, n = 42; diffusen, n = 25; eent vun onbekannt Histologie) vertrueden. Gastric Otemschwieregkeeten Echantillon waren op -80 ° C gespäichert. Fir d'entholl Prozentsaz an Histologie vun der Echantillonen, gefruer Echantillon waren Ënnerbewosstsinn Ray-Tek Okt Massa (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) a 5 μm gefruer Äis-Rubriken z'iwwerpréiwen sech bereet an Kierchefënster benotzt Trypan Blue. Histologie vun gastric Kriibs uplanzen war duerch en erfuerene pathologist (M.-L. K.-L.) bewäert. Ray-Tek war vun Stoffer geläscht virewech Seier extractions.Table 1 Séminairen Parameteren fir d'Echantillonen op vill Komparativ Frankräich hybridization (aCGH) an Ausdrock microarrays analyséiert zu definitiv. VerfÜgung primär gastric tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Gastric Kriibs Zell Linnen VerfÜgung Alter /Sex VerfÜgung Histologie VerfÜgung Origin VerfÜgung AGS VerfÜgung 54 /F VerfÜgung Adeno-carcinoma VerfÜgung primär entholl VerfÜgung KATOIII VerfÜgung 55 /M
Firwat VerfÜgung Pleural effusion VerfÜgung MKN-1 VerfÜgung 72 /M VerfÜgung Adeno-squamous carcinoma VerfÜgung Lymph Node Metastasen VerfÜgung MKN-7 VerfÜgung 39 /M VerfÜgung Intestinal
Lymph Node Metastasen VerfÜgung MKN-28 zu 70 /F VerfÜgung Intestinal VerfÜgung Lymph Node Metastasen VerfÜgung MKN-45 zu 62 /F VerfÜgung Liewer Metastasen VerfÜgung Firwat
TMK-1 VerfÜgung 21 /M VerfÜgung Lymph Node Metastasen VerfÜgung AGS an KATOIII Zell Linnen kritt huet aus American Type Kultur Collection (Rockville, MD, USA) an MKN-1, MKN-7 VerfÜgung Firwat , MKN-28, MKN-45, an TMK-1 Zell Strecken eng Zort Cadeau vum Hiroshi Yokozaki, Kobe University CSL School vun Medezin, Kobe, Japan [26]. AGS Zellen sech am Kaighn d'F12 mëttelfristeg (2 mm glutamine, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-streptomycin) ugebaut, KATOIII Zellen zu IMDM mëttelfristeg (2 mm glutamine, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-streptomycin) an all aner Zell Linnen an RPMI-1640 mëttelfristeg (10% FCS, 2 mm glutamine, 100 U /ml penicillin-streptomycin). All Zellen sech op 37 ° C an 5% CO ugebaut 2. VerfÜgung RNS an DNA Extraktioun VerfÜgung Virum RNS an DNA extractions, war d'gefruer Otemschwieregkeeten Beweegung an RNAlater-ICE reagent (Ambion, Austin, Suerge USA,) an bei -80 ° C gespäichert fir 16 Stonnen den RNS ze stabiliséieren. Halschent vun der Otemschwieregkeeten Prouf (~ 25 mg) war vun RLT-β-mercaptoethanol lysis Prellbock (RNeasy Mini Kit, QIAGEN Galaxy Hilden, Däitschland) an déi aner Halschent vun ATL-Prellbock (DNeasy Blood an Ray Kit, QIAGEN) homogenized mat der Ultra-Turrax homogenizer (IKA Bauten, Mëtt, NC, USA). RNS war d'RNeasy Mini Kit ofgebaut benotzt, dorënner de optional DNase Behandlung, an DNA mat der DNeasy Blood an Ray Kit. Fir gastric Kriibs Zell Linnen, 1 × 10 7 Zellen sech mat enger Sprëtz an den Effekt lysed zu entweder RLT-β-mercaptoethanol lysis gefiermt oder ATL-gefiermt virun RNS an DNA extractions, bzw.. RNS an DNA Konzentratioune benotzt NanoDrop1000 (Thermo Fisher Wëssenschaftlech, Waltham, MA, USA) an RNS Qualitéit war mat senger Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, gekësst Alto, CA, USA) bewäert gemooss. Nëmmen RNAs z'ënnerscheedde 18S an 28s ribosomal Moundalpen der Bioanalyzer Analyse an 260/280 nennen virun 2.0 weist sech fir weider Analyse akzeptéiert. VerfÜgung Singular CGH an der Gentherapie Ausdrock microarray Analysë VerfÜgung Dräizéng gastric erhéijen a siwen gastric Linnen Kriibs Zell goufen analyséiert op der 244K Mënscherechter Genom CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Dräi vun der erhéijen an all vun der siwen Zell Linnen waren och d'44K Lait Mënscherechter Genom Gentherapie Ausdrock oligoarrays analyséiert benotzt (G4112F, Agilent Technologies) (Dorënner 1). Déi heeschen 260/280 nennen fir dësen Echantillon waren 2.1 fir RNS an 1,8 fir DNA, an all de RNS Echantillon haten kloer 18S an 28s ribosomal Moundalpen am Bioanalyzer Analyse besot gutt Qualitéit (Donnéeën net gewisen). Lackeleg CGH Experiment mat Mënscherechter Genom CGH Microarray 244A Kit (Agilent Technologies) gesuergt. Etikette an hybridization sech no der Agilent d'Protokoll gesuergt (v5.0, Juni 2007). Kuerz gefrot, 1,5 μg vun Prouf DNA an 1,5 μg vun Sex-stemmt Referenzmaterial DNA (Human Frankräich DNA, Promega, Madison, allem, USA) sech double-verdaut mat AluI VerfÜgung an RsaI VerfÜgung Restriktioun Enzymen (Promega). D'verdaut DNA huet mat der Agilent Frankräich DNA Etikette Kit Plus ausgezeechent. Sample DNA huet mat Cy5-dUTP an Referenzmaterial DNA mat Cy3-dUTP, bzw. gekennzeechent. Fortgeschratten DNA war sidd mat Microcon YM-30 Filter (Millipore, Billerica, MA, USA). No den Offäll, Echantillonen an Referenzmaterial DNAs goufen zu der Partie mat 50 μg vun Mënscherechter fäerten-1 DNA (Invitrogen, Karlsbad CA, USA) op 65 ° C, 20 Ziichter fir 40 h hinzeginn an hybridized. Hybridization war mat Agilent Oligo aCGH Hybridization Kit gesuergt. Virum Scannen, waren der drënner laut dem Protokoll gewäsch. Nieft der Prouf DNA hybridizations uewe beschriwwen, Referenzmaterial männlech DNA (Cy3) war hybridized géint Referenzmaterial weiblech DNA (Cy5) laut der selwechter Protokoll als Referenz lackeleg an der aCGH analyteschen benotzt ginn. Figur 1 Flowchart beschreiwen verschidde Schrëtt vun der Etude. VerfÜgung Experimenter Gene Ausdrock sech mat de Lait Mënscherechter Genom Oligo Microarray Kit gesuergt (Agilent Technologies), an Etikette an hybridization no der Agilent Protokoll (v5.7, Mäerz 2008). An dowéinst, 2 μg vun insgesamt Prouf RNS an Referenzmaterial RNS (engem Pool vu 10 Kriibs Zell Linnen, Net-gastric, ATCC, Manassas, MA, USA) sech mat der Agilent Quick Etikette Kit gekennzeechent. Sample RNS war mat Cy5-dCTP an Referenzmaterial DNA mat Cy3-dCTP, bzw. gekennzeechent. Fortgeschratten RNS war dann sidd RNeasy Mini spin Sailen benotzt (QIAGEN). Hybridization war mat Agilent Gene Expression Hybridization Kit standing an Echantillon bei 65 ° C hybridized waren, 10 Ziichter fir 17 h an Katakombe no de Protokoll virun Scannen. Béid aCGH an der Gentherapie Ausdrock microarray drënner waren mat der DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies) an analyséiert mat Spillfilmer Extraktioun Software gescannt (v9.5.1.1.). VerfÜgung High-Resolutioun Kopie Zuel profiling VerfÜgung All Kopie Zuel Donnéeën ass sinn op http:. //www cangem org (Bäitrëtt Nummer: CG-Ausgang-49). [27]. Agilent d'CGH Analytics Software (v3.5.14) applizéiert d'Kopie Zuel Ännerungen ze identifizéieren. Microarray Donnéeën war Qualitéit Filter aus der Spillfilmer Extraktioun Analyse kritt der sou vill Senn maan Informatiounen benotzen. Ämter flagged als outliers sech vu weideren Analyse geläscht. Ausserdeem huet den folgenden aberration Filter- applizéiert: minimal Zuel vun Ämter an Regioun = 3, minimum absolute Logbuch 2 Verhältnis fir Regioun = 0,27, an maximal Unzuel vun aberrant Regiounen = 1000. D'Logbuch 2 Verhältnis vun 0,27 entsprécht enger 1,2-fantastesch Changement an der Kopie Zuel. An CGH Analytics, war all aCGH Verhältnis éischt un e Log ëmgerechent 2 Verhältnis vun enger Z-normalization gefollegt. Déi männlech vs. weiblech Referenzmaterial Partie war als Eechung lackeleg an der analyteschen benotzt. Well vun der Geschlecht Differenzen tëscht der flamenden Ofgrond datt de Westen an d'Analyse verursaache kéint, chromosomes X an Y sech aus der Eechung ausgeschloss. ADM-2 Algorithmus mat engem loung Niveau vun 12,0 gouf benotzt fir Gentherapie Kopie Zuel hire Restaurant an eenzelne Echantillonen an Zell Linnen z'identifizéieren. Minimal gemeinsam Regioune vun hire Restaurant an der 20. Echantillon waren berechent, dorënner d'Gréisst an chromosomal Positioun vun de Verfall vun huel opzefëllen. An aberration war wéi onbekannt definéiert, wann et an op d'mannst 25% vun der Echantillon (Table 2) .Table 2 minimal gemeinsam Regioune vun onbekannt (≥25%) Kopie Zuel hire Restaurant präsent war. VerfÜgung Verfall
Stoffer (n = 13)
Zell Linnen (n = 7)
Heefegkeet VerfÜgung VerfÜgung Gréisst (Mo)
Positioun (Mo)
Méiglech Zil- Genen
+ 1q41-q43.1 VerfÜgung 2 VerfÜgung 3 VerfÜgung 25 % VerfÜgung 17.30 VerfÜgung 216.31-233.61 VerfÜgung ENAH, Agt, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1 VerfÜgung 1 VerfÜgung 4 zu 25% VerfÜgung 19,41 VerfÜgung 30.18-49.60 VerfÜgung OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1 VerfÜgung 4 VerfÜgung 3 zu 35% VerfÜgung 4,60 VerfÜgung 97.33-101.93 VerfÜgung CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3 VerfÜgung 3 VerfÜgung 2 VerfÜgung 25% VerfÜgung 19,8 VerfÜgung 126.45-146.25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3 VerfÜgung 6 VerfÜgung 3 zu 45% VerfÜgung 2,23 VerfÜgung 143.59-145.82 VerfÜgung GML, LYPD, AK3 VerfÜgung VerfÜgung + 14q11.2 VerfÜgung 0 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 25% VerfÜgung 1.05 VerfÜgung 22.89-23.94 VerfÜgung LTB4R
+ 17q12-q21.1 VerfÜgung 3 VerfÜgung 3 zu 30% VerfÜgung 0,28 VerfÜgung 35.02-35.30 VerfÜgung ERBB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2 VerfÜgung 2 VerfÜgung 3
25% VerfÜgung 13,65 VerfÜgung 50.45-64.10 VerfÜgung AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter VerfÜgung 4 VerfÜgung 3 zu 35% VerfÜgung 29,36 VerfÜgung 33.89-63.25 VerfÜgung CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 3 zu 40% VerfÜgung 57,94 VerfÜgung 0.04-57.98 VerfÜgung PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-p21 VerfÜgung .1 3 VerfÜgung 4 VerfÜgung 35% VerfÜgung 27,81 VerfÜgung 1.05-28.86 VerfÜgung MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2 VerfÜgung 3 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 40% VerfÜgung 26,11 VerfÜgung 39.48-65.59 VerfÜgung SMAD7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter VerfÜgung 2 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 35% VerfÜgung 3,69 VerfÜgung 70.95-74.65 VerfÜgung TSHZ1
-21q11.2-q21.1 VerfÜgung 3 VerfÜgung VerfÜgung 3 zu 30% 4,07 VerfÜgung 14.37-19.44 VerfÜgung HSPA13
-Xq28 VerfÜgung 4 VerfÜgung 1 zu 25% VerfÜgung 1,21 VerfÜgung 152.24- 153,45 VerfÜgung -
Zuel vu Fäll, Gréisst vun der minimal gemeinsam Regiounen (Mo), an der chromosomal Positioun vun de Verfall (Mo) sinn esou gutt wéi méiglech Zil- Genen uginn. CNV Regioune sinn net an der Dësch gewisen. . Copy Zuel gewannen (+), Kopie Zuel Verloscht (-) VerfÜgung Gene Ausdrock microarray Analyse VerfÜgung All Gentherapie Ausdrock Donnéeën ass op http sinn: //www cangem org (Bäitrëtt Nummer: CG-Ausgang.. -49) [27]. Microarray Resultater goufen Qualitéit Filter outliers Hëllef vun der Spillfilmer Extraktioun Software definéiert an normalized no der Loess Method, déi an der Software Pauschal abegraff huet. Der Gentherapie Ausdrock Analyse gouf zu Genen limitéiert am chromosomal Regiounen läit mat onbekannt geometrescher Figur (Table 2). D'Zil vun dëser Approche war bis Gentherapie Ausdrock Ännerungen Highlight datt mat Ännerungen an der Gentherapie Kopie Zuel verbonne waren, an dofir potentiell oncogenes oder entholl suppressor Genen mat engem funktionell Roll an Kriibs duerstellen. Éischten, eng Steiren log10 Ausdrock Verhältnis war fir all d'Ämter berechent d'selwecht Gentherapie gezielt. Dunn, an zwou getrennte Analysë fir Dumouriez a Verloschter, d'Steiren Ausdrock Niveau vun all Gentherapie war tëscht den demolege mat Kopie Zuel Gewënn /Verloscht a Echantillon mat normal Kopie Zuel Verglach den Effet vun Kopie Zuel hire Restaurant op der Gentherapie Ausdrock ze diskutéieren. Gene Ausdrock fantastesch Ännerungen (FC) waren berechent entweder vun de Steiren Ausdrock vun der kriibserreegend Echantillon vun de Steiren Ausdrock vun der nonmalignant Echantillon Partitur oder vun de Steiren Ausdrock vu Kriibs Echantillon mat Kopie Zuel hire Restaurant (G1) vun de Steiren Ausdrock vu Kriibs Echantillon Partitur mat normal Kopie Zuel (G0). Op d'mannst eng 2-fantastesch Kopie Zuel verbonne Ännerung vun der Gentherapie Ausdrock war bedeitendst considéréiert. Baséierend op dës Donnéeën, 13 Genen ALPK2 VerfÜgung, ASAP1 VerfÜgung, CEACAM5 VerfÜgung, CYP3A4 VerfÜgung, ENAH VerfÜgung, ERBB2, HHIPL2, LTB4R VerfÜgung, MMP9, OSMR VerfÜgung, PERLD1
, PNMT VerfÜgung, an PTPRA VerfÜgung, sech an dëse Match gaangen weider mat qRT-Hinnen alleguer Analyse an TRAC (ët Analyse mat Hëllef vun Affinitéit knipsen) assay validéiert ginn. D'Resultater vun der integréiert microarray Analyse huet mat dräi virdrun publizéiert Etuden Verglach dass systematesch Nepgen-grouss Kopie Zuel an der Gentherapie Ausdrock Donnéeën [15-17]. VerfÜgung Real-Zäit qRT-Hinnen alleguer Analyse VerfÜgung Real-Zäit intégréieren qRT- Hinnen alleguer war fir 2 Genen gesuergt, ALPK2 VerfÜgung (18q21.31-q21.32) an HHIPL2 VerfÜgung (1q41). Den Ausdrock Niveau sech zu 82 gastric Stoffer (46 kriibserreegend a 36 nonmalignant Stoffer) an zu 7 gastric Kriibs Zell Linnen (: Séminairen Parameteren Weider Fichier 1) gemooss. 1 μg vun insgesamt RNS war bis cDNA benotzt Moloney-murine ëmgerechent Leukämie Virus ëmgedréint transcriptase (Promega, Madison, allem, USA) an zoufälleg primers (Invitrogen) an engem Volume vun 50 μl fir 1 h bei 37 ° C. D'Reaktioun war Hëtzt-inactivated (95 ° C, 3 min) an zu enger definitiver Volume vun 200 μl mat molekulare Schouljoer Waasser gefëllt. D'gët sech mat der Assays-op-DemandTM Gentherapie Ausdrock Produkter (Hs01085414_m1 fir ALPK2 VerfÜgung an Hs00226924_m1 fir HHIPL2 VerfÜgung) quantitated laut den Hiersteller d'Protokoll (Obwuel Biosystems, Foster City, CA, USA). All primers sech op Exon-Exon Grenze läit. Kuerz, war 2 μl vun cDNA Skelett mat 1,25 μl vun spezifesch primers an Ämter mat FAM-reporter Hoerfaarw Fortgeschratten gemëscht. 12,5 μl vun TaqMan ® Universal Hinnen alleguer Mastermix an RNase-gratis Waasser sech zu engem Ganzen Volume vun 25 μl notéiert. Mënsch 18S rRNA als eng endogenous Kontroll den Ausdrock Niveauen an der nächster grouss Analyse ze normaliséieren. D'18S Studiebäihëllefe war mat VIC-reporter Hoerfaarw Fortgeschratten zu multiplex Hinnen alleguer mat der Zil- Genen erlaben. D'Hinnen alleguer ware wéi follegt: 50 ° C fir 2 min, 95 ° C fir 10 min, gefollegt vun 40 Zykle vun 95 ° C fir 15 s an 60 ° C fir 1 min. All Prouf war zu triplicate gemooss an d'Date goufen duerch den Delta-Delta Method analyséiert fir famill Ausdrock Resultater vergläichen (2 - [CT Prouf-CT Kontroll]) VerfÜgung TRAC assay VerfÜgung ët Analyse mat Hëllef vun. Affinitéit knipsen (TRAC) assay [28] war zu 88 gastric Stoffer fir 11 verschiddene Genen gesuergt (53 kriibserreegend a 35 nonmalignant Stoffer) a 7 gastric Kriibs Zell Linnen (Zousätzleche Fichier 1: Séminairen Parameteren). D'Genen vun der Analyse abegraff waren ENAH VerfÜgung (1q42.12), OSMR VerfÜgung (5p13.1), CYP3A4 VerfÜgung (7q21.1) ASAP1 VerfÜgung (8q24.1-q24.2), LTB4R VerfÜgung (14q11.2-Q12), PERLD1 VerfÜgung (17q12), ERBB2 VerfÜgung (17q21.1), PNMT VerfÜgung (17q21-Q22), CEACAM5 VerfÜgung (19q13.1-Q13 .2), PTPRA VerfÜgung (20p13), an MMP9 VerfÜgung (20q11.2-Q13.1). De Virdeel vun der TRAC assay ass dass den Ausdrock Niveau vun Multiple Genen kënnen also gläichzäiteg vun enger eenzeger Prouf gemooss ginn d'Quantitéit vun Prouf RNS noléisst fir d'Analyse néideg. Dëst ass besonnesch wichteg fir d'Analyse vun oft knapp Medeziner Otemschwieregkeeten Echantillon. VerfÜgung TRAC Analyse um PlexPress (Helsinki, Finnland) gesuergt huet. Benotzerdefinéiert TRACPackTM reagents fir mRNA (PlexPress) waren an der Analyse benotzt. Kuerz, war 90 μl vun Hybridization Mix (wouvun Fortgeschratten Gentherapie-spezifesch erkennen Ämter an biotinylated oligo-DT Ämter) pro gutt ze zappen 96-gutt Hinnen alleguer Verlobung. Zwee micrograms vun RNS Prouf war fir all gutt am Ganzen 100 μl Reaktioun Volumen applizéiert. Eng gläichberechtegt Zomm (30 Amol /Reaktioun) vun eenheetlechen gekëmmert 62-mer syntheteschen oligonucleotide hybridization Kontroll, dorënner e puer dovun-A Schwäif, war fir all Prouf virun hybridization notéiert. Hybridization war bei 60 ° C gesuergt, 650 Ziichter fir 120 Minutten (Thermomixer Confort, Eppendorf, Hamburg, Däitschland). No hybridization Affinitéit Fondplaz, Offäll, an elution sech mat der Kingfisher FlexLanguage (Thermo Fisher Wëssenschaftlech, Ex-, Finnland) Magnéitfeld ëm Prozessor gemaach. Streptavidin-kräftegen Magnéitfeld TRACPACK ™ Glaspärelen (50 μg, PlexPress) sech un d'hybridization Mëschung notéiert an der biotinylated mRNA-Studiebäihëllefe-oligo (DT) fir 30 Minutten -hybrids zu kruet erlaabt, no deem de Glaspärelen 5 mol zou sech wäschen benotzt gefiermt all unbound Material ze läschen. Fortgeschratten RNS-spezifesch Ämter goufen mat elution gefiermt eluted a vun capillary electrophoresis fonnt, mat dem ABI3100 sequencer (Obwuel Biosystems Cheshire, UK). D'Daten war mat der TRACParser Software (PlexPress) analyséiert. VerfÜgung statistique Analyse vun der qRT-Hinnen alleguer Donnéeën VerfÜgung A nonparametric Mann-Whitney Test fir zwee onofhängeg Echantillon applizéiert statistesch Bedeitung vun Ënnerscheeder an der famill mRNA Ausdrock ze bestëmmen Niveau vun ALPK2 VerfÜgung an HHIPL2 VerfÜgung zu nonmalignant an kriibserreegend souwéi an gastric Kriibs Echantillon vun verschidden histological bestemmt oder TNM-Etappen gastric Echantillon. A p-Wäert &Si besteet; 0,05 war statistesch relevant (SPSS 17.0) considéréiert. Ausserdeem goufen zwou getrennte Analysë fir Dumouriez a Verloschter, den Ausdrock Besatzungszäit Kriibs Echantillon mat Kopie Zuel hëlt oder Verloschter (G1) am Verglach zu Kriibs Echantillon mat normal Kopie Zuel (G0) d'Associatioun tëscht Kopie Zuel an der Gentherapie Ausdrock ze bewäerten. Copy Zuel Date goufen sinn fir 37 vun der gastric Echantillon abegraff an der qRT-Hinnen alleguer Analyse (Zousätzleche Fichier 1: Séminairen Parameteren). Gene Ausdrock fantastesch Ännerungen décidéiert vun Partitur der heeschen Ausdrock vun engem Grupp (zB Kriibs Echantillon) vun der heeschen Ausdrock vun den anere Grupp (zB nonmalignant Echantillon) berechent. VerfÜgung statistique Analyse vun der TRAC assay Donnéeën VerfÜgung A syntheteschen hybridization Kontroll all net-biologescher Variant an d'Daten ze läschen war an der Donnéeën normalization benotzt. Fir all Zill, Signal intensities relativ zu dësem intern hybridization Kontroll huet berechent. Fir d'néng Otemschwieregkeeten Echantillon vun hinne analyséiert mengen Signal Intensitéit benotzt gouf. A nonparametric Mann-Whitney Test fir zwee onofhängeg Echantillon gouf d'Statistik Bedeitung vun Ënnerscheeder an der famill mRNA Ausdrock Niveau vun ASAP1 VerfÜgung, CEACAM5 VerfÜgung, CYP3A4 VerfÜgung, ENAH VerfÜgung, ERBB2, LTB4R ze bestëmmen applizéiert
, MMP9, OSMR VerfÜgung, PERLD1 VerfÜgung, PNMT VerfÜgung, an PTPRA VerfÜgung zu nonmalignant an kriibserreegend gastric Echantillon souwéi an gastric Kriibs Echantillon vun verschidden histological bestemmt oder TNM-Etappen. A p-Wäert &Si besteet; 0,05 war statistesch relevant (SPSS 17.0) considéréiert. De Verglach vun der Gentherapie Ausdrock Niveauen am Echantillon mat an ouni Kopie Zuel hire Restaurant Leeschtung war wéi virun de qRT-Hinnen alleguer Analyse beschriwwen huet. . Copy Zuel Daten fir 43 gastric Kriibs demolege sech och an der TRAC assay Analyse VerfÜgung Resultater VerfÜgung Gene Kopie Zuel geometrescher Figur VerfÜgung All Gentherapie Kopie Rei Ännerungen an eenzelne Echantillon sinn an der Weider Fichier dës 2: Copy Zuel Ännerungen vun aCGH Analyse fonnt. Minimal gemeinsam Regioune vun onbekannt (≥25%) hire Restaurant souwéi hir Gréisst, Frequenz, méiglech Zil- Genen, an chromosomal Positioun an huel Puer sinn an Table 2. D'onbekannt gewise krut Regiounen am 1q41-q43.1 (25% etabléiert sech ), 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), an 20p13-qter (40%). D'onbekannt geläscht Regioune waren um 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 Sëtz %), an Xq28 (25%). All onbekannt Kopie Zuel Ännerungen décidéiert Magnéitfeld souwuel an der Primärschoul gastric Cancers an gastric Kriibs Zell Linnen, ausser fir d'14q11.2, wat nëmmen zu fënnef Zell Linnen verännert gouf. Copy Zuel verbonne Gentherapie Ausdrock VerfÜgung Ännerungen VerfÜgung insgesamt 256 eenzel Genen (10% vun all Genen vun der onbekannt chromosomal Regioune mat Kopie Zuel hire Restaurant läit) op d'mannst awer eng 2-fantastesch Kopie Zuel verbonne änneren an hir Ausdrock (Rei 2.0 - 34,6, Steiren 3,8) (Zousätzleche Fichier 3: Copy Zuel verbonne Gentherapie Ausdrock Ännerungen). 226 vun dësen Genen huet an onbekannt Géigende vun Kopie Zuel hëlt overexpressed an etabléiert, wobäi 30 Genen huet underexpressed an onbekannt Géigende vun Kopie Zuel Verloschter wellkomm. Fantastesch Ännerung vun der Gentherapie Ausdrock war, andeems der Ausdrock Niveau vun Echantillon mat Kopie Zuel hire Restaurant zu Echantillon mat normal Kopie Zuel vun enger bestëmmter Gentherapie berechent. Dofir, bezitt engem positive fantastesch änneren zu enger Kopie Zuel gewannen Zesummenhang Erhéijung vun der Gentherapie Ausdrock hierkommen eng negativ fantastesch änneren zu enger Kopie Zuel Verloscht Zesummenhang Ofsenkung vun der Gentherapie Ausdrock bezitt. VerfÜgung HHIPL2 VerfÜgung (HHIP-wëll 2) Gentherapie, deenen hire an der Regioun 1q41-q43.1, awer laut der héchster Kopie Zuel gewannen verbonne overexpression zu gastric Kriibs un der integréiert microarray Analyse (FC = 26.9). Generell, der héchster Gentherapie Ausdrock fantastesch Ännerungen tëschent Kriibs Echantillon mat an ouni Kopie Zuel hëlt sech um 19q Regioun zënter aus der iwwerdriwwener 40 Genen fonnt > 5-fantastesch Kopie Zuel verbonne Ännerungen an hiren Ausdrock, 19 (47.5%) waren wellkomm an der 19q Regioun (Zousätzleche Fichier 3: Copy Zuel Gentherapie Ausdrock Ännerungen verbonne). De stäerkste underexpressed Gentherapie am onbekannt Géigende vun Kopie Zuel Verloschter war ALPK2 VerfÜgung (alpha-kinase 2) (FC = -34.6) op 18q12.3-q22.2 wellkomm. VerfÜgung Virdrun, dräi Studie vun eis an anere goufen publizéiert déi wéinst enger Kopie Zuel Verfall vun gastric Kriibs [15-17] geännert Genen Nepgen-grouss Kopie Zuel an der Gentherapie Ausdrock Donnéeën systematesch intégréieren z'identifizéieren deem Ausdrock huet. De Verglach vun de phpNuke Genen tëscht dës Studien an der aktueller Etude réischt 20 Genen TOMM20 VerfÜgung (1q42.3), GGPS1 VerfÜgung (1q43), CYP3A4 VerfÜgung (7q21.1), MTAP VerfÜgung (9q21 .3), ASAP1 VerfÜgung (8q24.1-q24.2), PPP1R1B VerfÜgung (17q12), ERBB2 VerfÜgung (17q12-Q21), SERPINB3 VerfÜgung (18q21.3), SERPINB8 VerfÜgung (18q21.3), WDR7 VerfÜgung (18q21.2-Q22), HIF3A VerfÜgung (19q13.32), ZNF480 VerfÜgung (19q13.33), IL4I1 VerfÜgung (19q13.3-q13.4 ), CST3 VerfÜgung (20p11.21), PTPRA VerfÜgung (20p13), SLC13A3 VerfÜgung (20q12-Q13.1), DDX27 VerfÜgung (20q13.13), PARD6B VerfÜgung (20q13.13 ), SGK2 VerfÜgung (20q13.2), an TUBB1 VerfÜgung (20q13.32) datt entweder Asätz waren an overexpressed oder geläscht an eiser Etude an op d'mannst een vun den virdrun publizéiert Etuden underexpressed. Virdrun Daten zesummen publizéiert mat de aktuell Resultater weider Beweiser vun der biologescher Roll vun dësen Genen vun gastric Kriibs gëtt. VerfÜgung Validatioun vun Potential gastric Kriibs Zil- Genen VerfÜgung Real-Zäit qRT-Hinnen alleguer Analyse gewisen, datt den Ausdrock vun HHIPL2
war 7,4-fantastesch héich zu gastric Kriibs Echantillon am Verglach mat der nonmalignant gastric Stoffer (p &Si besteet; 0,05). Ausserdeem war de overexpression vun HHILP2 VerfÜgung vill mat Kopie Zuel gewannen (p &Si besteet; 0,05) assoziéiert als Ausdrock vun HHIPL2 VerfÜgung war 17.4-fantastesch héich zu Kriibs Echantillon mat Kopie Zuel Gewënn vun HHIPL2 VerfÜgung (G1 ) wéi zu Kriibs Echantillon mat normal Kopie Zuel vun dëser Gentherapie (G0) (Bedeitung 3 a 4). Laut der qRT-Hinnen alleguer Analyse et war eng 2,9-fantastesch underexpression vun ALPK2 VerfÜgung zu gastric Cancers mat Kopie Zuel Verloschter (G1) am Verglach mat gastric Cancers mat normal Kopie Zuel vun ALPK2 VerfÜgung (G0) (p &Si besteet; 0,05 ). Verwonnerlech, allerdéngs war den Ausdrock vun ALPK2 VerfÜgung zu gastric Cancers am allgemengen 1,9-fantastesch héich (p &Si besteet; 0,05) wéi an der nonmalignant gastric Stoffer (Bedeitung 3 a 4). Histological subtype oder TNM-Etapp hat net eng statistesch groussen Effet op d'Expressioun vun HHIPL2 VerfÜgung oder ALPK2 VerfÜgung (Table 3) .Table 3 Bilan vun der nonparametric Mann-Whitney Test fir d'qRT-Hinnen alleguer an TRAC Analyse Donnéeën (SPSS17.0). VerfÜgung Gene
Chromosome
Cancer vs. Net-malignant
intestinal vs. diffusen
G1 vs. G0
M0 vs. M1
T1-2 vs. T3-4 VerfÜgung VerfÜgung N0 vs. N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32 VerfÜgung p &Si besteet; 0,05 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,104 VerfÜgung p VerfÜgung &Si besteet; 0,05 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,451 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,072 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,378 VerfÜgung ASAP1
8q24.1-q24.2 VerfÜgung p &Si besteet; 0,001 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,319 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,396 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,208 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,232 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,289 VerfÜgung CEACAM5
19q13.1-Q13.2 VerfÜgung p &Si besteet; 0,001 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,061 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,254 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,543 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,197 VerfÜgung p VerfÜgung = 0,253 VerfÜgung CYP3A4
7q21.1 VerfÜgung p &Si besteet;

• Prognostic Bedeitung vun Verhältnis neutrophil lymphocyte an platelet lymphocyte Verhältnis zu fortgeschratt gastric Kriibs Patienten mat FOLFOX behandelt chemotherapy
• E Roman Method, digital Nepgen Scannen bieden KRAS Gentherapie amplification zu gastric Cancers: Abannung vun overexpressed Wildwest-Typ KRAS zu afgerappt sécher a Kriibs Zell growth