Genom-dækkende genkopital og udtryk analyse af primære gastriske tumorer og mavekræft celle lines

Genome-wide genkopital og udtryk analyse af primære gastriske tumorer og gastrisk cancer cellelinjer
Abstrakt
Baggrund
mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme på verdensplan og den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald. Genkopiantallet ændringer spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​gastrisk cancer og en ændring i genkopiantal er en af ​​de vigtigste mekanismer for en cancercelle at kontrollere ekspressionen af ​​potentielle onkogener og tumorsuppressorgener.
Metoder
for at fremhæve gener af potentielle biologiske og kliniske relevans i mavekræft, vi foretaget en systematisk række-baseret undersøgelse af genekspression og kopiere nummer niveauer i primære gastriske tumorer og gastrisk cancer cellelinjer og valideret resultaterne ved hjælp en affinitet capture baseret udskrift analyse ( TRAC assay) og real-time QRT-PCR.
Resultater
Integreret microarray analyse viste i alt 256 gener, der var placeret i tilbagevendende regioner af gevinster eller tab og havde mindst en 2-fold kopi nummer-tilknyttet ændring i deres genekspression. Ekspressionsniveauerne af 13 af disse gener, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, ERBB2
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
, PNMT
, PTPRA
, og OSMR
blev valideret i alt 118 gastriske prøver ved hjælp af enten QRT-PCR eller TRAC assay. Alle disse 13 gener blev differentielt udtrykt mellem kræft prøver og ikke-maligne væv (p < 0,05) og sammenhængen mellem kopital og genekspression ændringer blev valideret til ni (69,2%) af disse gener (p < 0,05).
konklusion
Afslutningsvis integreret genekspression og kopi nummer microarray analyse fremhævede gener, der kan være af afgørende betydning for gastrisk carcinogenese. TRAC og QRT-PCR-analyser valideret microarray resultater og dermed den rolle af disse gener som potentielle biomarkører for mavekræft.
Baggrund
grund af mangel på tidlige symptomer gastrisk adenocarcinom er kendetegnet ved sent tidspunkt diagnose og utilfredsstillende muligheder for kurativ behandling [1, 2]. På trods af faldet i forekomsten i de seneste årtier, mavekræft er stadig den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [3]. Ca. 90% af alle gastriske cancere er adenocarcinomer følge af epitel [4]. Ifølge Laurens klassificering gastrisk kræft er opdelt i to overordnede histologiske undertyper, tarm og diffus [5].
Gastriske adenokarcinomer, ligesom mange andre solide tumorer af epitel oprindelse, er ofte komplekse med hensyn til kromosomal integritet [6, 7]. Malign gastrisk tumorer er kendt for at bære flere afvigelser i deres genom, og sådanne kromosomale ændringer er afgørende for aktivering og inaktivering af kræftrelaterede gener [8-17]. Genkopiantallet forandring er en af ​​de vigtigste mekanismer for en cancercelle at kontrollere ekspressionen af ​​gener centrale for celleoverlevelse og cancer progression [17-22]. Disse kopital ændringer indebærer ofte en stor gruppe af gener lokaliseret tæt på hinanden i det samme kromosom. For eksempel; i gastrisk kræft den ofte forstærket 17q12-Q21 region indeholder gener såsom ERBB2
, GRB7
, JUP
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
, og TOP2A
[14, 17, 23]. Men kun et fåtal af disse gener vil sandsynligvis være de sande kræft driver gener, der bidrager til tumorigenese, mens andre kan blive forstærket simpelthen på grund af deres kromosomale nærhed med forstærkning målgener [24, 25]. En metode til at skelne sådanne driver gener fra personbiler mutationer er at integrere hele genomet kopital og udtryk data, som muliggør identifikation af gener, hvis transkriptionel aktivering eller repression er forbundet med en kopiantal ændring i en cancercelle. Således ved at kombinere oplysninger fra de højopløselige genkopiantal og udtryk microarrays, er det muligt ikke blot at definere breakpoints af kopital ændringer i stor detalje, men også at vurdere den funktionelle betydning af disse ændringer, og derfor muligvis identificere gener, der drev kræft debut og progression.
at fremhæve gener potentielle som biomarkører eller kliniske mål i mavekræft, vi foretaget en systematisk høj opløsning matrix-baseret undersøgelse af kopi nummer og genekspressionsniveauer i mavekræft væv og cellelinier. Vores tidligere matrix-baseret analyse viste, at kopi nummer gevinster og tab på flere hundrede gener er forbundet med en samtidig stigning eller et fald i genekspression [17]. I den foreliggende undersøgelse, har vi øget opløsning af kopien nummer analyse over 20 gange til mere præcist visualisere breakpoints af kopi nummer ændringer. Desuden har vi gennemført en transkriptionel analyse af gener placeret i ændrede kromosomale regioner for at identificere gener, hvis deregulering er forbundet med den maligne fænotype.
Metoder
mavekræft væv og cellelinjer
Dette forskningsprojekt er blevet revideret og godkendt af Etisk Komité Institut for Medicinsk Genetik og Kirurgi og godkendt af Clinical Review Board of Helsinki University Central Hospital. Gastric vævsprøver blev prospektivt indsamlet fra patienter, som gennemgik gastrisk kirurgi eller gastroskopi i Helsinki University Central Hospital mellem 1999 og 2007. Informeret samtykke blev opnået fra hver deltagende patient. Tretten friske frosne primære mavekræft væv og syv gastriske cancercellelinier blev valgt til microarray analyse (tabel 1). Vævet materiale bestod af to forskellige histologiske undertyper, intestinal (n = 9) og diffus (n = 4) og tumorerne blev placeret på to forskellige steder i maven, corpus (n = 8) og antrum (n = 5 ). I alt 111 gastriske væv og 7 gastriske cancercellelinier indgik i QRT-PCR og affiniteten indfangning baseret transkript assay (TRAC) analyser (Yderligere fil 1: Kliniske parametre). Vævsprøverne bestod af 43 ikke-malign og 68 cancerøse gastriske væv og begge histologiske undertyper af gastrisk cancer var repræsenteret (intestinale, n = 42; diffus, n = 25; en af ​​ukendt histologi). Gastric vævsprøver blev lagret ved -80 ° C. For at verificere tumor procent og histologi af prøverne blev frosne prøver indlejret i Tissue-Tek OCT-forbindelse (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) og 5 um frosne is-sektioner blev fremstillet og farvet ved hjælp af trypanblåt. Histologi af mavekræft prøver blev vurderet af en erfaren patolog (M.-L. K.-L.). Tissue-Tek blev fjernet fra vævene inden nukleinsyrekonstruktioner extractions.Table 1 Kliniske parametre for de analyserede på arrayet komparativ genomisk hybridisering (aCGH) prøver og ekspressionssystemer microarrays.
Primære gastrisk tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Mavekræft cellelinjer
Alder /køn
Histologi
Origin
AGS
54 /F
Adeno-karcinom
Primær tumor
KATOIII
55 /M
Diffus
Pleuraeffusion
MKN-1
72 /M
Adeno-pladecarcinom
Lymfeknude metastaser
MKN-7
39 /M
Intestinal
lymfeknudemetastase
MKN-28
70 /F
Intestinal
lymfeknudemetastase
MKN-45
62 /F
Diffus
levermetastaser
TMK-1
21 /M
Diffus
lymfeknudemetastase
AGS og KATOIII cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) og MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, og TMK-1 cellelinjer var en slags gave fra Hiroshi Yokozaki, Kobe University Graduate School of Medicine, Kobe, Japan [26]. AGS celler blev dyrket i Kaighn F12-medium (2 mM glutamin, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-streptomycin), KATOIII celler i IMDM-medium (2 mM glutamin, 10% FBS, 100 U /ml penicillin-streptomycin) og alle andre cellelinier i RPMI-1640-medium (10% FCS, 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin-streptomycin). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO 2.
RNA og DNA-ekstraktion
Før RNA- og DNA-ekstraktioner, det frosne væv blev neddyppet i RNAlater-ICE reagens (Ambion, Austin, TX , USA) og opbevaret ved -80 ° C i 16 timer for at stabilisere RNA. Halvdelen af ​​vævsprøven (~ 25 mg) blev homogeniseret i RLT-β-mercaptoethanol lysepuffer (RNeasy mini kit, Qiagen Inc., Hilden, Tyskland) og den anden halvdel i ATL-puffer (DNeasy blod og væv Kit, Qiagen) ved hjælp af Ultra-Turrax homogenisator (IKA Works, Wilmington, NC, USA). RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy mini kit, herunder det valgfrie DNase-behandling, og DNA under anvendelse af DNeasy blod og væv Kit. For gastriske cancercellelinier, 1 x 10 7-celler blev lyseret ved anvendelse af en sprøjte og nål i enten RLT-β-mercaptoethanol lyseringsbuffer eller ATL-buffer før RNA- og DNA ekstraktioner hhv. RNA- og DNA-koncentrationer blev målt under anvendelse NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og RNA kvalitet blev vurderet ved anvendelse Agilents 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Kun RNA viser tydelige 18S og 28S ribosomale toppe i Bioanalyzer analyse og 260/280 forhold over 2,0 blev accepteret til yderligere analyse.
Array CGH og genekspression microarray-analyser
Tretten gastriske tumorer og syv mavekræft cellelinjer blev analyseret på 244K human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Tre af tumorer og alle de syv cellelinjer blev også analyseret ved hjælp af de 44K Whole Human Genome genekspression oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (Figur 1). De gennemsnitlige 260/280 nøgletal for disse prøver var 2,1 for RNA og 1,8 for DNA, og alle de RNA-prøver havde klare 18S og 28S ribosomale toppe i Bioanalyzer analyse indikerer god kvalitet (data ikke vist). Array CGH blev udført ved hjælp af Human Genome CGH Microarray 244a kit (Agilent Technologies). Mærkning og hybridisering blev udført i overensstemmelse med Agilent protokol (v5.0, juni 2007). Kort fortalt 1,5 ug prøve-DNA og 1,5 ug af køn-matchede henvisning DNA (humant genomisk DNA, Promega, Madison, WI, USA) var dobbelt-spaltet med Alu I
og RsaI
restriktionsenzymer (Promega). Det fordøjede DNA blev mærket ved anvendelse af Agilent Genomisk DNA Labeling Kit Plus. Prøve-DNA blev mærket med Cy5-dUTP og reference DNA med Cy3-dUTP hhv. Mærket DNA blev oprenset med Microcon YM-30 filtre (Millipore, Billerica, MA, USA). Efter rensning, prøve- og reference- DNA'er blev samlet og hybridiseret til arrayet med 50 ug af human Cot-1-DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 65 ° C, 20 rpm i 40 timer. Hybridisering blev udført med Agilent Oligo aCGH hybridisering Kit. Før scanning blev objektglassene vasket i henhold til protokollen. Foruden de prøve-DNA-hybridiseringer ovenfor beskrevne, blev henvisning mandlige DNA (Cy3) hybridiseret mod henvisning kvindelige DNA (Cy5) ifølge den samme protokol, der skal anvendes som reference array i Dataanalyse aCGH. Figur 1 Flowchart beskriver forskellige trin i undersøgelsen. Blev udført
genekspression eksperimenter ved hjælp af Whole Human Genome Oligo Microarray kit (Agilent Technologies), og mærkning og hybridisering i henhold til Agilent protokollen (v5.7 marts 2008). Kort fortalt 2 pg totalt prøve-RNA og reference-RNA (en pulje på 10 cancercellelinjer, ikke-gastrisk, ATCC, Manassas, MA, USA) blev mærket under anvendelse af Agilent Quick Amp Labeling Kit. Prøve RNA blev mærket med Cy5-dCTP og reference DNA med Cy3-dCTP hhv. Mærket RNA blev derefter oprenset under anvendelse af RNeasy mini spin-søjler (Qiagen). Hybridisering blev udført med Agilent Gene Expression hybridisering Kit og prøver blev hybridiseret ved 65 ° C, 10 rpm i 17 timer og vaskes i overensstemmelse med protokollen inden der scannes. Både aCGH og genekspression microarray dias blev scannet ved hjælp af DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies) og analyseret med Feature Extraction Software (v9.5.1.1.).
Høj opløsning kopi nummer profilering
Alle kopi nummer data findes på http:. //www cangem org (tiltrædelse nummer: CG-EXP-49). [27]. Agilents CGH Analytics software (v3.5.14) blev anvendt til at identificere de kopi nummer ændringer. Microarray data kvalitet filtreret ved hjælp af outlier oplysninger fra Feature Extraction analyse. Sonder markeret som outliers blev fjernet fra yderligere analyse. Desuden blev følgende aberration filtre anvendt: mindste antal sonder i region = 3, minimum absolut log 2 ratio for region = 0,27, og det maksimale antal afvigende regioner = 1000. Loggen 2-forhold på 0,27 svarer til en 1,2-gange ændring i kopiantallet. I CGH Analytics blev hver aCGH forholdet først konverteres til en log 2-forhold efterfulgt af en Z-normalisering. Den mandlige vs kvindelige henvisning matrix blev anvendt som en kalibrering array i dataanalysen. På grund af de kønsforskelle mellem arrays, der kan forårsage skævhed i analysen, blev kromosomer X og Y er udelukket fra kalibreringen. ADM-2 algoritme med et tærskelniveau på 12,0 blev anvendt til at identificere genkopiantallet ændringer i individuelle prøver og cellelinjer. Minimale fælles områder af ændringer i de 20 prøver blev beregnet, herunder størrelsen og kromosomale placering af ændring i basepar. En afvigelse blev defineret som tilbagevendende, hvis det var til stede i mindst 25% af prøverne (tabel 2) .table 2 Minimale fælles områder af tilbagevendende (≥25%) kopi nummer ændringer.
Ændring
Væv (n = 13)
Cellelinjer (n = 7)
Frekvens

Størrelse (Mb)
Position (Mb)
Mulige målgener
+ 1q41-q43.1
2
3
25 %
17.30
216,31-233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1
1
4
25%
19,41
30,18-49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1
4
3
35%
4,60
97,33 til 101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3
3
2
25%
19,8
126,45-146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3
6
3
45%
2.23
143,59-145,82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0
5
25%
1,05
22,89-23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1
3
3
30%
0,28
35,02-35,30
ERBB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2
2
3
25%
13,65
50,45-64,10
AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter
4
3
35%
29,36
33,89-63,25
CEACAM5, APOC1, ApoE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57,94
0,04-57,98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP9, BMP7
-9p24.3-p21 0,1
3
4
35%
27,81
1,05-28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2
3
5
40%
26,11
39,48-65,59
SMAD7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter
2
5
35%
3,69
70,95-74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1
3
3
30%
4,07
14,37-19,44
HSPA13
-Xq28
4
1
25%
1,21
152.24- 153,45 -

Antal tilfælde er størrelsen af ​​de minimale fælles områder (Mb), og den kromosomale placering af ændringen (Mb) angivet samt eventuelle målgener. CNV regioner er ikke vist i tabellen. . Kopier nummer gevinst (+), kopiere nummer tab (-)
Genekspression microarray analyse
All genekspression data er tilgængelige på http: //www cangem org (tiltrædelse nummer: CG-EXP.. -49) [27]. Microarray resultater blev kvalitet filtreret ved hjælp af outliers defineret af Feature Extraction Software og normaliseret efter den Løss metoden, som var indeholdt i softwarepakken. Genet ekspressionsanalyse var begrænset til gener lokaliseret i kromosomale regioner med tilbagevendende aberrationer (tabel 2). Målet med denne fremgangsmåde var at fremhæve genekspression ændringer, der var forbundet med ændringer i genkopiantal, og kunne derfor repræsentere potentielle onkogener eller tumorsuppressorgener med en funktionel rolle i cancer. Først blev en median log10 udtryk forholdet beregnet for alle proberne er rettet mod samme gen. Så i to separate analyser for gevinster og tab, blev den mediane udtryk for hver gen sammenlignet mellem prøverne med kopi nummer gevinst /tab og prøver med normal kopi nummer for at evaluere effekten af ​​kopi nummer ændringer på genekspression. Genekspression fold ændringer (FC) blev beregnet enten ved at dividere midterplan ekspression af de ondartede prøver ved medianen ekspression af de ikke-maligne prøver eller ved at dividere den gennemsnitlige ekspression af tumor prøver med kopital ændringer (G1) ved medianen ekspression af tumor prøver med normal kopiantal (G0). Mindst 2-fold kopital associeret ændring i genekspression blev betragtet som signifikant. Baseret på disse data, 13 gener ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
, og PTPRA
, blev valgt til at blive yderligere valideres med QRT-PCR-analyse og TRAC (udskrift analyse med hjælp af affinitet capture) assay. Resultaterne fra den integrerede microarray analyse blev sammenlignet med tre tidligere publicerede undersøgelser, der systematisk integrerer genom-dækkende kopi nummer og genekspression data [15-17].
Real-time QRT-PCR-analyse
realtid qRT- PCR blev udført i 2 gener, ALPK2
(18q21.31-q21.32) og HHIPL2
(1q41). Udtrykket blev målt i 82 gastriske væv (46 kræft og 36 ikke-maligne væv) og i 7 gastrisk cancer cellelinier (Yderligere fil 1: Kliniske parametre). 1 ug totalt RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse Moloney-murin leukæmivirus revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA) og vilkårlige primere (Invitrogen) i et volumen på 50 pi i 1 time ved 37 ° C. Reaktionen var varmeinaktiveret (95 ° C, 3 min) og fyldt til et endeligt volumen på 200 pi med vand af molekylærbiologisk kvalitet. Transkripterne blev kvantificeret under anvendelse af de assays on DemandTM genekspressionsprodukter (Hs01085414_m1 for ALPK2
og Hs00226924_m1 for HHIPL2
) ifølge fabrikantens protokol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle primere blev placeret på exon-exongrænser. Kort beskrevet blev 2 pi cDNA template blandet med 1,25 pi specifikke primere og prober mærket med FAM-reporter-farvestof. 12,5 pi TaqMan ® Universal PCR Mastermix og RNase-frit vand tilsat til et totalt volumen på 25 pi. Human 18S rRNA tjente som en endogen kontrol at normalisere ekspressionsniveauerne i den efterfølgende kvantitativ analyse. Den 18S probe blev mærket med VIC-reporterfarvestof at tillade multiplex PCR med målgenerne. PCR-betingelserne var som følger: 50 ° C i 2 min, 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Hver prøve blev målt i tre eksemplarer, og data blev analyseret af delta-delta metode til at sammenligne relative ekspression resultater (2 - [Ct prøve-Ct kontrol])
TRAC assay
Udskrift analyse med hjælp af. affinitet capture (TRAC) assay [28] blev udført i 11 forskellige gener i 88 gastriske væv (53 kræft og 35 ikke-maligne væv) og 7 mavekræft cellelinier (Yderligere fil 1: Kliniske parametre). Generne indgår i analysen var ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1), CYP3A4
(7q21.1) ASAP1 Hotel (8q24.1-q24.2), LTB4R
(14q11.2-Q12), PERLD1
(17q12), ERBB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-Q13 0,2), PTPRA
(20p13), og MMP9
(20q11.2-q13.1). Fordelen ved TRAC assayet er, at ekspressionsniveauerne af multiple gener kan måles samtidigt fra en enkelt prøve dermed sænke mængden af ​​prøven RNA nødvendige for analysen. Dette er især vigtigt for analysen af ​​ofte knappe prøver kliniske væv.
TRAC analyse blev udført på PlexPress (Helsinki, Finland). Tilpasset TRACPackTM reagenser til mRNA (PlexPress) blev anvendt i analysen. Kort fortalt, 90 pi hybridiseringsblanding (indeholdende mærkede genspecifikke detektionsprober og biotinyleret oligo-dT sonder) per brønd blev dispenseret til en 96-brønds PCR-plade. To mikrogram RNA-prøve blev påført på hver brønd i en 100 pi total reaktionsvolumen. Et tilsvarende beløb (30 Amol /reaktion) af enkeltstrenget 62-mert syntetisk oligonukleotid hybridisering kontrol, herunder en poly-A-hale blev tilsat til hver prøve forud for hybridisering. Hybridisering blev udført ved 60 ° C, 650 rpm i 120 minutter (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Efter hybridisering affinitet capture, oprensning, og eluering blev udført ved hjælp af KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) magnetisk partikel processor. Streptavidin-koblede magnetiske TRACPACK ™ perler (50 ug, PlexPress) blev tilsat til hybridiseringsblandingen og lodes binde til den biotinylerede mRNA-probe-oligo (dT) -hybrids i 30 min, hvorefter perlerne blev vasket 5 gange ved anvendelse af vask puffer for at fjerne eventuelt ubundet materiale. Mærkede RNA-prober blev elueret med elueringsbuffer og påvises ved kapillarelektroforese under anvendelse af ABI3100-sekventeringsapparat (Applied Biosystems, Cheshire, UK). Dataene blev analyseret ved anvendelse af TRACParser software (PlexPress).
Statistisk analyse af QRT-PCR data
En parametrisk Mann-Whitney-test for to uafhængige prøver blev anvendt til at bestemme den statistiske signifikans af forskelle i den relative mRNA-ekspression niveauer af ALPK2
og HHIPL2
i ikke-maligne og kræft gastrisk prøver samt i mavekræft prøver af forskellige histologiske undertyper eller TNM-etaper. En p-værdi < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant (SPSS 17.0). Hertil kommer, i to separate analyser for gevinster og tab, de ekspressionsniveauerne i prøver kræft med kopi nummer gevinster eller tab (G1) blev sammenlignet med prøver kræft med normal kopi nummer (G0) for at vurdere sammenhængen mellem antal kopier og genekspression. Kopiér nummer data var tilgængelige for 37 af de gastriske prøver indgår i QRT-PCR-analyse (Yderligere fil 1: Kliniske parametre). Genekspression fold ændringer blev beregnet ved at dividere den gennemsnitlige ekspression af en gruppe (som cancer prøver) ved betyde ekspression af den anden gruppe (f.eks maligne prøver).
Statistisk analyse af TRAC assaydata
En syntetisk hybridisering kontrol blev anvendt i data normalisering til fjernelse af eventuelt ikke-biologisk variation i dataene. For hvert mål, signalintensiteter i forhold til denne interne hybridisering kontrol blev beregnet. For de ni vævsprøver analyseret i gentagne betyde signal intensitet blev brugt. En parametrisk Mann-Whitney-test for to uafhængige prøver blev anvendt til at bestemme den statistiske signifikans af forskelle i de relative mRNA ekspressionsniveauer for ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, ERBB2, LTB4R
, MMP9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
, og PTPRA
i ikke-maligne og kræft gastrisk prøver samt i mavekræft prøver af forskellige histologiske undertyper eller TNM-etaper. En p-værdi < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant (SPSS 17.0). Sammenligning af genekspressionsniveauer i prøver med og uden kopital ændringer blev udført som beskrevet før for QRT-PCR-analyse. . Kopier nummer data var tilgængelige for 43 mavekræft prøver indgår i TRAC assay analyse
Resultater
genkopitallet afvigelser
Alle genkopitallet ændringer i de enkelte prøver er vist i Yderligere fil 2: Kopier nummerændringer påvist ved aCGH analyse. Minimale fælles regioner af tilbagevendende (≥25%) ændringer samt deres størrelse, frekvens, mulige målgener og kromosomale position i basepar er vist i tabel 2. Den periodiske opnået regioner blev placeret på 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), og 20p13-qter (40%). De tilbagevendende slettet regioner blev placeret på 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), og Xq28 (25%). Alle tilbagevendende kopiantal ændringer var detekterbare både i primære gastriske cancere og i gastriske cancercellelinier, bortset fra 14q11.2, der blev kun ændres i fem cellelinier.
Kopier antal forbundet genekspression skifter
alt 256 individuelle gener (10% af alle gener lokaliseret i de tilbagevendende kromosomale regioner med kopital ændringer) viste mindst et 2-fold kopital associeret ændring i deres ekspression (interval 2.0 - 34,6, median 3,8) (Supplerende fil 3: Kopier nummer associerede gen ekspressionssystemer ændringer). 226 af disse gener var overudtrykt og placeret i tilbagevendende regioner af kopital gevinster, mens 30 gener blev underexpressed og placeret i tilbagevendende regioner af kopi nummer tab. Gange ændring i genekspression blev beregnet ved at sammenligne ekspressionsniveauerne af prøver med kopital ændringer af prøver med normal kopital i et givet gen. Derfor er en positiv fold ændring refererer til en kopi nummer gevinst relateret stigning i genekspression mens en negativ fold ændring refererer til en kopi nummer tab relateret fald i genekspression.
HHIPL2 Hotel (HHIP-lignende 2) genet, forstærkes i 1q41-q43.1 region, viste den højeste kopiantals gevinst forbundet overekspression i mavekræft i henhold til den integrerede microarray analyse (FC = 26,9). Generelt er den højeste genekspression fold ændringer mellem prøver kræft med og uden kopi nummer gevinster blev opdaget ved 19q regionen siden ud af de 40 gener, viser > 5-fold kopi nummer tilknyttet ændringer i deres udtryk, 19 (47,5%) var placeret i 19q region (Yderligere fil 3: Kopier nummer tilknyttet genekspression ændringer). Den mest underexpressed gen i de tilbagevendende regioner kopital tab var ALPK2
(alfa-kinase 2) (FC = -34,6) placeret på 18q12.3-q22.2.
Tidligere tre undersøgelser af os og andre er blevet offentliggjort, at systematisk integrerer genom-dækkende kopi nummer og genekspression data til at identificere gener, hvis udtryk er ændret på grund af en kopi nummer ændring i gastrisk kræft [15-17]. Sammenligningen af ​​de overlappende gener mellem disse undersøgelser og den aktuelle undersøgelse viste 20 gener TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), MTAP
(9q21 0,3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), ERBB2
(17q12-Q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2), og TUBB1
(20q13.32), der var enten erfaringer og overudtrykt eller slettet og underexpressed i vores undersøgelse og i mindst én af de tidligere offentliggjorte undersøgelser. Tidligere offentliggjorte data sammen med de aktuelle resultater giver yderligere beviser på den biologiske rolle af disse gener i mavekræft.
Validering af potentielle gastrisk kræft målgener
Real-time QRT-PCR-analyse viste, at ekspressionen af ​​HHIPL2
var 7,4 gange højere i gastrisk cancer prøver sammenlignet med de ikke-maligne gastriske væv (p < 0,05). Desuden blev overekspression af HHILP2
signifikant associeret med kopiantal gevinst (p < 0,05) som udtryk for HHIPL2
var 17,4 gange højere i prøver cancerpatienter med kopiantal gevinst på HHIPL2
(g1 ) end i prøver cancerpatienter med normal kopital af dette gen (G0) (tabel 3 og 4). Ifølge QRT-PCR-analyse var der en 2,9-fold underekspression af ALPK2
i gastrisk kræft med kopi nummer tab (G1) sammenlignet med gastrisk kræft med normal kopi antal ALPK2
(G0) (p < 0,05 ). Imidlertid overraskende, ekspressionen af ​​ALPK2
i gastriske cancere generelt var 1,9 gange højere (p < 0,05) end i de ikke-maligne gastriske væv (tabel 3 og 4). Histologisk undertype eller TNM-stadie ikke havde en statistisk signifikant effekt på ekspressionen af ​​HHIPL2
eller ALPK2 Hotel (tabel 3) .table 3 Resultater af den ikke-parametriske Mann-Whitney test for QRT-PCR og TRAC dataanalyse (SPSS17.0).
Gene
kromosom
Cancer vs. non-malign
tarm vs diffus
g1 vs. g0
M0 vs. M1
T1-2 vs. T3-4

n0 vs. N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0.05
p
= 0,104
p
< 0.05
p
= 0,451
p
= 0,072
p
= 0,378
ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0,001
p
= 0,319
p
= 0,396
p
= 0,208
p
= 0,232
p
= 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0,001
p
= 0,061
p
= 0,254
p
= 0,543
p
= 0,197
p
= 0,253
CYP3A4

• Prognostisk betydning af neutrofil lymfocyt ratio og blodplader lymfocyt-forholdet i avancerede mavecancerpatienter behandlet med FOLFOX kemoterapi
• En ny metode, digital genom scanning registrerer KRAS genamplifikation i gastrisk kræft: inddragelse af overudtrykt vildtype-KRAS i nedstrøms signalering og kræft cellevækst