FGF9 från cancerassocierade fibroblaster är en möjlig förmedlare av invasion och anti-apoptos av magcancer cells

FGF9 från cancerassocierade fibroblaster en eventuell förmedlare av invasion och anti-apoptos av gastric cancerceller Bild Sammanfattning
Bakgrund
Cancer-associerade fibroblaster (CAFS), som bor runt tumörceller, föreslås att spela en central roll i tumörprogression. Här har vi utfört microarray analyser för att jämföra genuttrycksprofilerna mellan CAFS och godartade magsår fibroblaster (NGF) från en patient med magcancer och fann att fibroblasttillväxtfaktor 9
(FGF9
) var en ny tillväxtfaktor överuttryckt i CAFS. Vi undersökte sedan de biologiska effekterna av FGF9 under utvecklingen av magcancer.
Metoder
Expression av FGF9 i CAFS och NGF och deras utsöndrade produkter, undersöktes med Western blotting. Effekterna av FGF9 på AGS och MKN28 gastric cancerceller när det gäller spridning, invasion och anti-apoptos bedömdes av WST-1-analys, invasion kammare analysen och FACS, respektive. Dessutom var den intracellulära signaleringen genom vilken FGF9 utövar sina biologiska roller som undersöktes in vitro
.
Resultat
FGF9 var starkt uttryckt i CAFS i jämförelse med NGF, som är kompatibel med mikroarray data som anger att FGF9 var en ny tillväxt faktor överuttryckt i CAFS. Behandling med FGF9 främjas invasion och anti-apoptos genom aktivering av ERK och Akt signalvägar i AGS och MKN28-celler, medan dessa effekter dämpas genom behandling med anti-FGF9 neutraliserande antikropp. Dessutom FGF9 behandling förbättrade signifikant uttrycket av matrix metalloproteinas 7 (MMP7) i båda cellinjerna.
Slutsatser
FGF9 är en möjlig mediator utsöndras av CAFS som främjar antiapoptos och invasiv förmåga av gastriska cancerceller.
Nyckelord
FGF cancerassocierade fibroblastinvasion Anti-apoptos ERK Akt Magcancer bakgrund
bildandet av cancer skador är intimt förknippad med sin unika mikromiljö. Progression är nära korrelerad med förmågan hos cancerceller att rekrytera och aktivera de omgivande stromaceller, och därefter utnyttja dem [1]. Cancer-omgivande stromaceller, såsom fibroblaster, endotelceller och immunceller, kan iscensätta tumorigenes och metastas genom cell-till-cellinteraktion och /eller produktion av lösliga tillväxtfaktorer /cytokiner /kemokiner [1-3]. I detta sammanhang är fibroblaster i cancer lesioner kallas cancerassocierade fibroblaster (CAFS) och har fått mycket uppmärksamhet när det gäller deras roll i tumörprogression [4,5]. Även CAFS är kända för att vara olika stor del från normala fibroblaster i icke-neoplastiska vävnader i termer av deras gen-profil, är den mekanism genom vilken CAFS främja tumörprogression oklar. Därför jämförde vi genuttrycksprofilerna av CAFS, med särskilt fokus på tillväxtfaktorer /cytokiner /kemokiner, med de godartade magsår fibroblaster (NGF) med microarray analys, och isolerades därefter fibroblasttillväxtfaktör 9
(FGF9
) i form av en ny gen som överuttrycktes i CAFS i magcancer.
FGF9, en sekretoriskt protein av FGF-familjen, är enligt uppgift uttryckt i stromala celler inklusive fibroblaster [6-8]. I allmänhet sker FGF signalering via FGF-receptorer (FGFRs) för att reglera en mängd olika cellbiologiska beteende, inklusive proliferation, differentiering, överlevnad och rörlighet [9], och uttryck av FGF9, FGFR2c, FGFR3b och FGFR3c har detekterats i mag- och kolon cancer [10]. Således, i likhet med andra FGF familjen proteiner kan FGF9 spelar en central roll i samspelet mellan cancerceller och deras omgivande stromaceller, och det är anmärkningsvärt att FGF9 starkt uttryckt i CAFS i magcancer. I den aktuella studien, skärmad vi för skillnader i genuttryck mellan CAFS och NGF från en patient med magcancer. Vi undersökte effekten av FGF9 på proliferation, invasion och anti-apoptos av gastric cancerceller, och dessutom klar den intracellulära signaleringen genom vilken FGF9 utövar sina biologiska effekter på gastric cancerceller.
Metoder
Reagens och cellodling
human rekombinant FGF9 och anti-human FGF9 neutraliserande antikropp köptes från R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-extracellulär signal-reglerat proteinkinas (ERK), anti-fosfo-specifik ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-fosfo-specifik Akt (p-Akt, Ser473), och anti-β-aktin antikropparna var köpt från Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) Review magsäckscancer cellinjer AGS odlades i Hams F-12-medium (Sigma, Aurora, Ohio, USA) med 10% fetalt bovint serum (FBS;. Biowest, Nuaille, Frankrike) i en fuktad inkubator vid 37 ° C med en atmosfär av 5% CO 2. På liknande sätt, MKN28 odlades i RPMI 1640-medium med 10% fetalt bovint serum, och andra fem gastriska cancercellinjer MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY och KATOIII bibehölls såsom tidigare beskrivits [11].
Isolering och odling av mänskliga gastric fibroblaster
mänskliga magcancer (dåligt differentierade adenokarcinom) prover erhölls från en patient som genomgick gastrektomi på Hyogo College of Medicine Hospital 2012. cancerassocierade fibroblaster (CAFS) framställdes från cancer delen i magen. Godartade magsår fibroblaster (NGF) framställdes från godartade del med atrofisk gastrit minst 50 mm långt från tumör i magen. Vävnadsprover trimmas av fett och nekrotisk vävnad, hackades med skalpeller och tvättas i PBS innehållande antibiotika antimykotisk reagens (Anti-Anti®, GIBCO). Vävnaden bitar överfördes till en 12-brunnars mikroplatta (IWAKI, Tokyo, Japan) vid en fragmentet /brunn. Cellerna odlades i DMEM-medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) med 10% värmeinaktiverat FBS vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2. De fibroblaster som ursprungligen växte i ett monoskikt uppsamlades, överfördes till en annan skålen och användes för experiment inom 10. Passagen. Dessa studier gjordes med godkännande av Granskningsnämnden för Hyogo College of Medicine, och informerat samtycke erhölls från patienten.
Microarray analys
Använda Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), var totalt RNA utvinns ur tre uppsättningar av CAFS och NGF odlade. cDNA märkning, hybridiseringar, skanning och dataanalys utfördes av Hokkaido System Science Co, Ltd (Sapporo, Japan). Kortfattat, cyanin-3 (Cy3) -märkt cRNA framställdes från totalt RNA (0,05 mikrogram) med en låg ingång Quick Amp Labeling Kit (Agilent) i enlighet med tillverkarens instruktioner, följt av RNAeasy kolonnrening (QIAGEN, Valencia, CA) . Dye inkorporering och cRNA avkastning kontrollerades med en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer. Cy3-märkta cRNA (0,60 pg) fragmenterades vid 60 ° C under 30 min i en reaktionsvolym av 25 pl innehållande 1x Agilent fragmentering buffert och 2x Agilent blockerande medel i enlighet med tillverkarens instruktioner. Efter avslutad fragmentering reaktionen tillsattes 25 pl av 2x Agilent hybridiseringsbuffert tillsätts till fragmentering blandningen och hybridiserades till Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray (8x60K Ver.2.0) under 17 h vid 65 ° C i en roterande Agilent hybridiseringsugn. Efter hybridisering var de microarrays tvättades under 1 min vid rumstemperatur med GE Tvättbuffert 1 (Agilent) och under 1 min vid 37 ° C med GE Tvättbuffert 2 (Agilent), torkades sedan omedelbart genom kort centrifugering. Diabilder skannades omedelbart efter tvätt på en Agilent DNA microarray scanner (G2565CA) med hjälp av en färgskanning inställning för 8x60K array diabilder (Scan Area 61 × 21,6 mm, Scan upplösning 3 pm, Dye kanal för Green PMT satt till 100%). De skannade bilderna analyserades och normaliseras med Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent).
RNA-extraktion och omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) Review Totalt RNA extraherades från magcancer cellinjer med hjälp av Trizol-reagens (Invitrogen). Fyra mikrogram av totalt RNA transkriberades omvänt med användning av oligo-dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) och 200 U av Superscript ™ II omvänt transkriptas (Invitrogen) i en total volym av 20 pl. För följande PCR, par av oligonukleotidprimrar för mänskliga FGFRs
framställdes såsom tidigare beskrivits [12]. Human FGFR2c Blogg: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(framåt) och 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (omvänd); mänsklig FGFR3b Blogg: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(framåt) och 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(omvänd); mänsklig FGFR3c Blogg: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(framåt) och 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (omvänd); human GAPDH Blogg: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(framåt) och 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (omvänd). En mikroliter av RT produkten (cDNA) amplifierades med PCR i en 50-pl reaktionsvolym innehållande 20 pmol av de ovannämnda uppsättningarna av primersekvenser, 1,25 U av Ampli-Taq DNA-polymeras (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA), och den slutliga PCR-buffert: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol och 1 mM dNTP. PCR-amplifieringen utfördes enligt följande: för FGFRs
, vid 95 ° C under 5 min en gång; 40 cykler vid 95 ° C under 30 s, vid 57 ° C under 30 s och vid 72 ° C under 1 min; sedan vid 72 ° C under 7 min; för GAPDH
, vid 95 ° C under 7 min en gång; 40 cykler vid 95 ° C under 30 s, vid 55 ° C under 1 min och vid 72 ° C under 30 sek; sedan vid 72 ° C under 7 min.
realtids-RT-PCR
realtids-RT-PCR utfördes med användning 7900H Snabb realtids-PCR System (Applied Biosystem) såsom beskrivits tidigare [13]. Följande uppsättningar av primers för human matrix metalloproteinas 2 Review (MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
och GAPDH
framställdes (Ytterligare fil 1: Tabell S1) . Realtids-RT-PCR-analyser utfördes med 200 ng RNA motsvarande cDNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), och 500 nmol /l genspecifika primrar. PCR-cykelbetingelserna var 50 ° C under 15 sekunder, och 60 ° C under 60 s. Intensiteten av det fluorescerande färgämnet bestämdes, och var och en av mRNA-expressionsnivåer normaliserades till GAPDH
mRNA expressionsnivåer.
Cellproliferationsanalys
AGS (4 x 10 3) och MKN28-celler (en × 10 4) såddes i komplett medium i 96-brunnars mikroplattor. Mediet ersattes därefter med en innehållande rekombinant FGF9 (0-10 ng /ml). WST-1-lösningen tillsattes efter 72 h inkubation, och plattorna inkuberades vid 37 ° C under 1 h. Plattorna analyserades med användning av en ELISA-plattläsare vid 450 nm med referensvåglängden satt till 600 nm.
Cell invasionsanalys
Cell invasionsanalys utfördes med användning av BioCoat Matrigel invasion kamrar (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat, AGS-celler (1 x 10 5) eller MKN28-celler (3 x 10 5) såddes i insatsen enligt Matrigel-belagda invasion kammaren (24 brunnar, 8-um porstorlek) fylldes med serum -fri medium innehållande olika koncentrationer av FGF9 (0-10 ng /ml). Därefter inkuberades cellerna med medium innehållande 10% FBS i den nedre kammaren vid 37 ° C i 5% CO2. För att inhibera effekterna av FGF9, var anti-FGF9-antikropp (1 | ag /ml) också tillsätts till den övre kammaren. Efter inkubation under 27 h, var icke-invaderande celler avlägsnades med användning av en bomullstopp och cellerna som hade invaderat in i den nedre ytan av membranet fixerades med etanol. De invaderande cellerna färgades sedan med hematoxylin och räknades med användning av ett mikroskop i fem olika visuella fält (förstoring, x200).
Apoptos assay
AGS (2 x 10 5) och MKN28 (2,5 x 10 5) celler ympades i sex-brunnars plattor i rutin medium under 24 h. Cellerna därefter berövas serum och behandlades med eller utan rekombinant FGF9 (1-10 ng /ml) under 48 h. För att inhibera effekterna av FGF9, var anti-FGF9-antikropp (1 | ag /ml) också tillsätts till odlingsmediet. Efter behandling, båda flytande och fästa celler skördades, tvättades med PBS och färgades med AnnexinV-FITC och propidiumjodid (PI) med en MEBCYTO Apoptos Kit (MBL, Nagoya, Japan). Färgade celler analyserades på en FACScalibur flödescytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA), och de data som erhållits analyserades med Cellquest mjukvara (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
Western blot-analys
Western blot analyser utfördes såsom beskrivits tidigare [14]. I korthet, efter behandling med eller utan reagens, lyserades cellerna i protein extraktionsbuffert, och proteinextrakt (30 | ig) fraktionerades med natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores och överfördes till ett nitrocellulosablotting-membran. Membranet inkuberades med en primär antikropp och därefter med en peroxidas-konjugerad sekundär antikropp. Proteiner detekterades med användning av ett förstärkt kemiluminescens (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).
Immunohistokemi Review, en totalt 20 gastric cancer vävnader erhölls från prover utskurna kirurgiskt på Hyogo College of Medicine. Vävnadsprovet fixerades i 10% formalinlösning och bäddades in i paraffin. Studien godkändes av Granskningsnämnden för Hyogo College of Medicine, och informerat samtycke erhölls från alla patienter. Egenskaperna hos gastric cancerpatienter var visade i kompletterande fil 2: Tabell S2
Immunhistokemisk färgning för FGF9 genomfördes med en LSAB + satsen med anti-FGF9 antikropp (1:40; R &D Systems, Minneapolis, MN, USA). såsom beskrivits tidigare [15]. Slutligen inkuberades sektionerna i 3,3'-diaminobenzide tetrahydroklorid med 0,05% H2O2 under 3 min, och sedan motfärgades med Mayers hematoxylin. För att utvärdera immunreaktiviteten hos FGF9, var åtminstone fem olika synfält observerades vid den invasiva fronten av magcancer skador. Ett prov ansågs positivt när FGF9-positiv fibroblastceller bon observerades i synfält undersökta.
Statistik analys
Alla värden uttrycktes som medelvärde ± SD. Data analyserades med hjälp av oparade tvåsidiga t
-test. P
-värden på mindre än 0,05 ansågs indikera statistisk signifikans.
Resultat
Microarray-analyser av CAFS i gastriska cancervävnader
Vi isolerade CAFS och NGF (Figur 1A) och jämförde genuttryck profilen för CAFS med den av NGF med användning av microarray analys. Tio representativa gener som uppregleras i CAFS listas i tabell 1. Bland dessa gener, riktade vi FGF9 som den mest uttryckt gen för att undersöka betydelsen av denna CAF-producerade tillväxtfaktor på gastric cancerceller, och i själva verket innan in vitro
studier har vi bekräftat att CAF-celler produceras mycket större mängd FGF9 protein än NGF-celler (figur 1B). Dessutom bekräftade vi att FGF9 starkt uttryck i fibroblaster i stroma av magcancer lesion som CAF isolerades (Figur 1C). Figur 1 Expression av FGF9 och dess receptorer i CAFS och gastriska cancerceller. (A) Morfologi av gastric CAFS och NGF. (B) Framställning av FGF9 i gastric CAFS, NGF och deras konditionerat medium (CM). (C) Expression av FGF9 i CAFS av magcancer skada. Pilarna indikerar CAFS. (D) Expression av FGF-receptorer
ansvarig för FGF9 i gastric cancercellinjer.
Tabell 1 Representativa gener differentiellt uttryckta i CAFS från NGF
åtkomstnummer
Symbol

Gene namn
Vik förändring
uppregleras
NM_014333
CADM1
celladhesionsmolekyl 1, avskrift variant en
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb | is

• Den diagnostiska utmaning av lungtumör trombotisk mikroangiopati som en presentation för magsäckscancer: en fallrapport och översyn av litteraturen
• Xpert MTB /RIF analys kan användas på arkiverad gastric aspirera och inducerad sputumprov för känslig diagnos av pediatrisk tuberkulos