FGF9 vu Kriibs-verbonne Här iwert mech selwer ass eng méiglech Vermëttler vun Invasioun an Anti-apoptosis vun gastric Kriibs Zellen

FGF9 vu Kriibs-verbonne Här iwert mech selwer ass eng méiglech Vermëttler vun Invasioun an Anti-apoptosis vun gastric Kriibs Zellen VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Cancer-verbonne Här iwert mech selwer (CAFs), wat ronn entholl Zellen wunnt, ugeholl ginn engem ze spillen Jarnéier Roll an entholl Werdegang. Hei standing mir microarray Gentherapie Ausdrock Profiler tëscht CAFs an Net-kriibserreegend gastric Här iwert mech selwer (NGFs) vun engem Patient mat gastric Kriibs ze vergläichen analyséiert a fonnt, datt fibroblast Wuesstem Faktor 9 VerfÜgung (FGF9 VerfÜgung) war e Faktor Roman Wuesstem overexpressed zu CAFs. Mir iwwerpréift dann déi biologesch Effekter vun FGF9 während Werdegang vun gastric Kriibs. VerfÜgung Method VerfÜgung Expression vun FGF9 zu CAFs an NGFs, an hir secreted Produiten, waren déi vun Westeuropa blotting iwwerpréift. D'Auswierkunge vun FGF9 op AGS an MKN28 gastric Kriibs Zellen zu wat Prolifératioun, Invasioun an Anti-apoptosis sech vun WST-1 assay, Invasioun Chambre assay an FACS évaluéieren, bzw.. Ausserdeem, d'intracellular sécher duerch déi FGF9 seng biologesch Rollen enormen war kënschtlech VerfÜgung iwwerpréift. VerfÜgung Resultater VerfÜgung war FGF9 staark an CAFs am Verglach mat NGFs ausgedréckt, kompatibel mat microarray Wiesen Donnéeën ugëtt datt FGF9 engem Roman Wuesstem war Faktor an CAFs overexpressed. Behandlung mat FGF9 gefördert Invasioun an Anti-apoptosis duerch Aktivatioun vun der Erk an Akt sécher Weeër an AGS an MKN28 Zellen, am Ufank dës Auswierkunge vun Behandlung mat Anti-FGF9 neutralizing antibody attenuated goufen. Zousätzlech, FGF9 Behandlung bedeitend dem Wëllen vun Matrixentgasung metalloproteinase 7 (MMP7) a béid Zell Linnen gestäerkt. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung FGF9 eng méiglech Vermëttler vun CAFs secreted ass, datt d'Anti-apoptosis an invasiv Méiglechen stoussen vun gastric Kriibs Zellen ënnerstëtzt. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung FGF Cancer-verbonne fibroblast Missiounen Anti-apoptosis Erk Akt Gastric Kriibs Background VerfÜgung D'Équipe vun kriibserreegend lesions ass intim mat hir eenzegaarteg microenvironment assoziéiert. Werdegang ass enk mat der Méiglechen stoussen vun Kriibs Zellen soll d'Ëmfeld stromal Zellen ze rekrutéieren an aktivéieren, an dono auszenotzen hinnen [1]. Cancer-Ëmfeld stromal Zellen, wéi Här iwert mech selwer, endothelial Zellen, an immun Zellen, kann tumorigenesis an Metastasen duerch Zell-ze-Zell Interaktioun an /oder Produktioun vun soluble Wuesstem Faktoren /cytokines /chemokines [1-3] orchestrate. An dësem Kontext, si Här iwert mech selwer am kriibserreegend lesions bekannt als Kriibs-verbonne Här iwert mech selwer (CAFs) an hun vill Opmierksamkeet mat wat fir hir Roll am entholl Werdegang [4,5] krut. Obwuel CAFs aus normal Här iwert mech selwer an Net-neoplastic Stoffer zu Conditioune vun hire Gene Profil schiddene anescht gin si bekannt, déi de Mechanismus déi CAFs entholl Werdegang Promotioun ass onkloer. Dofir, mir der Gentherapie Ausdrock Profiler vun CAFs Verglach, besonnesch op Wuesstem Faktoren /cytokines /chemokines, mat deene vun Net-kriibserreegend gastric Här iwert mech selwer (NGFs) microarray assay benotzt, an dono isoléiert fibroblast Wuesstem Faktor 9 VerfÜgung (FGF9
) als Roman Gentherapie, datt zu CAFs zu gastric Kriibs. VerfÜgung FGF9, engem secretory FAQ vun der FGF Famill overexpressed war, ass Berichter vun stromal Zellen dorënner Här iwert mech selwer [6-8] ausgedréckt. Am Allgemengen, FGF sécher via FGF kenne (FGFRs) normalerweise eng Villfalt vu Zell biologescher Verhalen ze regléieren, dorënner Prolifératioun, dat, Survival an motility [9], an Ausdrock vun FGF9, FGFR2c, FGFR3b an FGFR3c gouf zu gastric an Colon fonnt Cancers [10]. Sou, wéi aner FGF Famill Proteinen, FGF9 vläicht eng dréien Roll an der Interaktioun tëscht Kriibs Zellen an hirem Ëmfeld stromal Zellen Leeschtung, an et ass wichteg, datt FGF9 staark an CAFs zu gastric Kriibs ausgedréckt gëtt. Am Moment studéieren, opgefouert mir fir Differenzen an der Gentherapie Ausdrock tëscht CAFs an NGFs vun engem Patient mat gastric Kriibs. Mir iwwerpréift den Effet vun FGF9 op Prolifératioun, Invasioun an Anti-apoptosis vun gastric Kriibs Zellen, a stoungen esouguer d'intracellular sécher duerch déi FGF9 seng biologesch Effekter op gastric Kriibs Zellen enormen. VerfÜgung Method VerfÜgung Reagents an Zell Kultur
Mënscherechter recombinant FGF9 an Anti-Mënsch antibody FGF9 neutralizing sech aus R &kaaft. Anti-extracellular Signal-reegelen FAQ kinase (Erk), anti-phospho-spezifesch Erk (p-Erk), anti-Akt, anti-phospho-spezifesch Akt (p-Akt; Ser473), an anti-β-actin antibodies sech kaaft vun Zell sécher Technology (Beverly, MA, USA) an Ham d'F-12 mëttelfristeg (Fläch, Aurora, Ohio, USA) mat 10% an et Bovine serum (FBS D'gastric Kriibs Zell Linnen AGS war cultured VerfÜgung;. Biowest, Nuaillé, Frankräich) an enger humidified incubator bei 37 ° C mat engem Atmosphär vu 5% CO 2. Den Zerfall, war MKN28 cultured zu RPMI 1640 mëttelfristeg mat 10% An et Bovine serum, an anere fënnef gastric Kriibs Zell Linnen MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY, an KATOIII haten sech wéi virdrun beschriwwen [11]. VerfÜgung Isolatioun a Kultur vun Mënsch gastric Här iwert mech selwer VerfÜgung Mënscherechter gastric Kriibs (Pro-ënnerscheet adenocarcinoma) uplanzen vun engem Patient kritt huet, déi an 2012. Cancer-verbonne Här iwert mech selwer (CAFs) gastrectomy um Hyogo College vun Medezin Hospital mécht sech aus der kriibserreegend Deel vun de Mo. virbereet. Non-kriibserreegend gastric Här iwert mech selwer (NGFs) sech vum Nët-kriibserreegend Deel mat atrophic gastritis mannst 50 mm wäit aus entholl am Mo. virbereet. D'Otemschwieregkeeten uplanzen sech vu Fett an necrotic Otemschwieregkeeten Trierweiler, mat Gefaangen Schwéngs- an am PBS mat Antibiotike-antimycotic reagent (Anti-Anti®, GIBCO) gewäsch. D'Otemschwieregkeeten Stécker goufen zu engem microplate 12-gutt transferéiert (IWAKI, Tokyo, Japan) an ee ofgesprengt /gutt. D'Zellen sech cultured zu DMEM mëttelfristeg (GIBCO, Grand Island, NY, USA) mat 10% Hëtzt-inactivated FBS bei 37 ° C an eng Atmosphär vu 5% CO2. Den Här iwert mech selwer, datt am Ufank zu engem monolayer gewuess waren, fir aner Plat a benotzt fir Experimenter am 10. Trip transferéiert gesammelt. Dës Studien huet mat dem Accord vun der Kritik Verwaltungsrot vun Hyogo College vun Medezin gemaach, an Awëllegung war aus dem Patient kritt. VerfÜgung Microarray Analyse VerfÜgung Ausschöpfung Trizol reagent (Invitrogen, Karlsbad CA, USA), total RNS war Quecksëlwer aus dräi baut vun CAFs an NGFs cultured. cDNA Etikette, hybridizations, Scannen an Daten Analyse sech duerch Hokkaido System Science Co., Ltd (Sapporo, Japan) gesuergt. Kuerz, cyanine-3 (Cy3) -labeled Crna aus total RNS (0,05 μg) bereet war mat den Hiersteller d'Instruktioune engem Low check Quick Etikette Kit (Agilent) am Aklang mat, gefollegt vun RNAeasy Kolonn Offäll (QIAGEN, Valencia, CA) . Dye Aktivitéiten an Crna nozeginn sech mat engem NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer iwwerpréift. Cy3-Label Crna (0.60 μg) war fir 30 min an enger Reaktioun Volume vun 25 μl wouvun 1x Agilent véiermol gefiermt an 2x Agilent erauszesichen bannendran am Aklang mat den Hiersteller d'Instruktioune bei 60 ° C fragmentaresch. Op Réalisatioun vun der véiermol Reaktioun, 25 μl vun hybridization gefiermt 2x Agilent war bei 65 ° C an eng rotativ Agilent hybridization Uewen fir 17 h op der véiermol Mëschung an hybridized zu Agilent SurePrint G3 Mënscherechter Gene Expression Microarray (8x60K ver.2.0) ugebaut. No hybridization, goufen d'microarrays fir 1 min bei Raumtemperatur mat GE Wash Respektiv 1 (Agilent) an fir 1 min bei 37 ° C mat GE Wash gefiermt 2 (Agilent) zou, da gedréchent direkt vum kuurzen centrifugation. Drënner waren direkt nom wäschen op eng Agilent DNA Microarray Scanner (G2565CA) gescannt benotzt een Faarf Scanner Kader fir 8x60K vill drënner (Scan Area 61 × 21,6 mm, Scan Resolutioun 3μm, Dye Kanal fir Green PMT zu 100% Set). D'gescannt Biller waren analyséiert a normalized mat Spillfilmer Extraktioun Software 10.7.3.1 (Agilent). VerfÜgung Extraktioun RNS an ëmgedréint Transkriptiouns-polymerase Kette Reaktioun (RT-Hinnen alleguer) VerfÜgung Total RNS war vun gastric Kriibs Zell Linnen mat Trizol reagent ofgebaut (Invitrogen). Véier microgram vun insgesamt RNS war ëmgedréint-ausserdeem vun oligo DT benotzt (Obwuel Biosystems, Branchburg, NJ, USA) an 200 U vun Superscript ™ II ëmgedréint transcriptase (Invitrogen) an engem total Volume vun 20μl. Fir déi folgend Hinnen alleguer, Puer oligonucleotide primers fir Mënscherechter FGFRs VerfÜgung wéi virdru beschriwwen bereet sech [12]. Mënsch FGFR2c VerfÜgung: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 "(Stiermer) an 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3" (Réckproduktioun); Mënsch FGFR3b VerfÜgung: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 "(Stiermer) an 5" -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 "(Réckproduktioun); Mënsch FGFR3c VerfÜgung: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 "(Stiermer) an 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3" (Réckproduktioun); Mënsch GAPDH VerfÜgung: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 "(Stiermer) an 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3" (Réckproduktioun). One microliter vun RT Produit (cDNA) war an engem 50-μl Reaktioun Volumen 20 wouvun vun Hinnen alleguer Implikatioune pmol vun den uewe baut vun primers, 1,25 U vun Ampli-Taq DNA polymerase (Obwuel Biosystems, Foster City, ersetze kéint., USA), an der Finale Hinnen alleguer gefiermt: 20 mm Tris-HCl (pH 8.4), 50 mm KCl, 2,5 mm MgCl2, 10 mm dithiothreitol, an 1 mm dNTP. D'Hinnen alleguer amplification gesuergt huet folgendermoossen: fir FGFRs VerfÜgung, bei 95 ° C fir 5 min eemol; 40 Zykle bei 95 ° C fir 30 Spiller, bei 57 ° C fir 30 ass, a bei 72 ° C fir 1 min; da bei 72 ° C fir 7 min; fir GAPDH VerfÜgung, bei 95 ° C fir 7 min eemol; 40 Zykle bei 95 ° C fir 30 Spiller, bei 55 ° C fir 1 min, a bei 72 ° C fir 30 sec; bei 72 ° C dann fir 7 min. VerfÜgung Real-Zäit RT-Hinnen alleguer VerfÜgung Real-Zäit RT-Hinnen alleguer war mat 7900H Fast Real-Time Hinnen alleguer System (Obwuel Biosystem) standing wéi virdru beschriwwen [13]. Déi folgend baut vun primers fir Mënscherechter Matrixentgasung metalloproteinase 2 VerfÜgung (MMP2 VerfÜgung), MMP3 VerfÜgung, MMP7 VerfÜgung, MMP9 VerfÜgung, an GAPDH VerfÜgung bereet waren (Zousätzleche Fichier 1: Table S1) . Real-Zäit RT-Hinnen alleguer assays sech mat 200 NG RNS gleichgestallt cDNA, SYBR Green Master Mix (Obwuel Biosystems), an 500 nmol /l Gentherapie spezifesch primers duerchgefouert. D'Hinnen alleguer Vëlo ware 50 ° C fir 15 ass, an 60 ° C fir 60 ass. D'Intensitéit vun der unisse Hoerfaarw war alles, an all vun mRNA Ausdrock Niveauen war normalized zu GAPDH VerfÜgung mRNA Ausdrock Niveauen. VerfÜgung Zell Prolifératioun assay VerfÜgung AGS (4 × 10 3) an MKN28 Zellen (1 × 10 4) waren zu 96-gutt an komplett mëttelfristeg rakommen microplates. Déi mëttel- war dann mat eent mat recombinant FGF9 (0-10 Dummeldéng /ml) ersat. WST-1 Léisung war no 72 h incubation dobäi, an d'Placke waren op 37 ° C fir 1 h incubated. D'Placke waren mat enger Elisa zappen Lieser bei 450 nm mat der Referenz Wellelängt bei 600 nm. VerfÜgung Zell Invasioun assay VerfÜgung Zell Invasioun assay benotzt BioCoat Matrigel Invasioun Leeschtung war Formatioun analyséiert CHAMBERS (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) no de Protokoll d'Hiersteller. AGS Zellen kuerz, (1 × 10 5) oder MKN28 Zellen (3 × 10 5) huet sech an der Neiegkeet vun der Matrigel-Beschichtete Invasioun ëmkomm (24 Wells, 8-μm pore Gréisst) géint mat serum gefëllt -free mëttelfristeg mat verschiddene Konzentratioune vun FGF9 (0-10 Dummeldéng /ml). Dunn, goufen d'Zellen incubated mat mëttelfristeg wouvun 10% FBS am ënneschten ëmkomm bei 37 ° C an 5% CO2. Fir d'Auswierkunge vun FGF9, anti-FGF9 antibody (1 μg /ml) inhibit war och zu der ieweschter Chambre notéiert. No incubation fir 27 h, Net-hypothetesch Zellen sech mat engem Koteng Swab ofgegruewen an d'Zellen, datt an der ënneschter Uewerfläch vun der Membran sech fix mat Ethanol eruewert haten. D'hypothetesch Zellen sech dann mat hematoxylin Kierchefënster an gezielt engem microscope zu fënnef aner visuell Felder (Vergréisserung, x200) benotzt. VerfÜgung Apoptosis assay VerfÜgung AGS (2 × 10 5) an MKN28 (2,5 × 10 5) Zellen sech fir 24 h zu sechs-och Telleren an Iddi mëttelfristeg rakommen. D'Zellen sech dann vun serum entzu gin a mat oder ouni recombinant FGF9 (1-10 Dummeldéng /ml) fir 48h behandelt. Fir d'Auswierkunge vun FGF9, anti-FGF9 antibody (1 μg /ml) inhibit war och fir d'Kultur mëttelfristeg agefouert. No Behandlung, sech souwuel Wénkel gekäppt an verbonnen Zellen gesammelt, mat PBS gewäsch a mat AnnexinV-FITC an propidium Kaliumiodid (PI) mat engem MEBCYTO Apoptosis Kit (MBL, Nagoya, Japan) geschriwwen. Kierchefënster Zellen sech op enger FACScalibur analyséiert Flux cytometer (Becton Dickinson, Franklin sin, NJ, USA), an der kritt Daten benotzt CELLQUEST Software analyséiert (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). VerfÜgung Western blot Analyse
Western blot analyséiert goufen virdrun [14] ëmschriwwen gesuergt. Kuerz, an der Behandlung mat oder ouni reagent, lysed sech Zellen zu FAQ Extraktioun Prellbock, an FAQ Extrait (30 μg) war vun Natrium dodecyl sulfate polyacrylamide gelies electrophoresis an transferéiert zu engem nitrocellulose blotting Membran fractioned. D'Membran war mat enger Primärschoul antibody incubated an dann mat engem peroxidase-conjugated Secondaire antibody. Proteinen huet mat enger verstäerkter chemiluminescence System (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) fonnt. VerfÜgung Immunohistochemistry VerfÜgung A Ganzen 20 Stoffer gastric Cancers aus ugedait kritt huet surgically um Hyogo College vun Medezin resected. D'Otemschwieregkeeten specimen sech zu 10% formalin Léisung fix an paraffin Ënnerbewosstsinn. Dës Etude gouf vun der Kritik Verwaltungsrot vun Hyogo College vun Medezin virausgesat, an Awëllegung war vun all Patienten kritt. Table S2 VerfÜgung Immunohistochemical staining fir FGF9 war mat enger LSAB + Kit standing mat anti-FGF9 antibody (1:40; R & D Systemer, är ganz Famill, Punktzuel, USA): De Charakter vun gastric Kriibs Patienten goufen an Weider Fichier 2 weisen. wéi virdru beschriwwen [15]. Endlech, huet de Rubriken fir 3 min an 3,3'-diaminobenzide tetrahydrochloride mat 0,05% H2O2 incubated, an dann counterstained mat Mayer d'haematoxylin. Fir d'immunoreactivity vun FGF9, op d'mannst fënnef aner visuell Felder deeër sech um invasiv virun gastric Kriibs lesions observéiert. A specimen war positiv geduecht wann FGF9-positiv fibroblastic Näschter goufen iwwerpréift am visuelle Felder observéiert. VerfÜgung Statistics Analyse VerfÜgung All Wäerter wéi déi heeschen ± Fils ausgedréckt huet. D'Daten benotzt unpaired zwee-tailed t analyséiert VerfÜgung Azeton. P VerfÜgung Wäerter vu manner wéi 0,05 considéréiert goufen statistesch Bedeitung unzeginn. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Microarray Analysë vun CAFs zu gastric Kriibs Stoffer VerfÜgung Mir CAFs isoléiert an NGFs (Dorënner 1A) an am Verglach der Gentherapie Ausdrock Profil vun CAFs mat deem vun NGFs microarray assay benotzt. Zéng Vertrieder Genen datt zu CAFs upregulated waren an Table 1. Dorënner Genen opgezielt sinn, mir geziilte FGF9 wéi déi héich ausgedréckt Gentherapie d'Roll vun dëser kéinten-produzéiert Wuesstem Faktor op gastric Kriibs Zellen ze iwwerpréifen, an tatsächlech virun kënschtlech Start VerfÜgung Studie confirméiert mir dat mir kéinten Zellen vill méi grouss Quantitéit vun FGF9 FAQ produzéiert wéi NGF Zellen (Dorënner 1B). Desweideren, confirméiert mir dat FGF9 staark am Här iwert mech selwer am stroma vun der gastric Kriibs lesion aus wat kéinten isoléiert sech ausgedréckt gëtt (Dorënner 1c). Figur 1 Expression vun FGF9 a seng kenne zu CAFs an gastric Kriibs Zellen. (A) grousse Ganzen vun gastric CAFs an NGFs. (B) Produktioun vun FGF9 zu gastric CAFs, NGFs an hir bedingt mëttelfristeg (CM). (C) Expression vun FGF9 zu CAFs vun der gastric Kriibs lesion. Feiler besot CAFs. (D) Expression vun FGF kenne VerfÜgung responsabel fir FGF9 zu gastric Kriibs Zell Linnen. VerfÜgung Table 1 Vertriederin Genen differentially ausgedréckt an CAFs aus NGFs VerfÜgung Zougank Nr
Symbol VerfÜgung
Gene Numm
änneren falen
Up-reegelen VerfÜgung NM_014333 VerfÜgung CADM1 VerfÜgung Zell Haftung Protein 1, ët Variant 1 VerfÜgung 273,6 VerfÜgung CB178477 VerfÜgung XLOC_l2_007424 VerfÜgung GB

• D'diagnostic Géigespiller vun deser entholl Schwëllungen microangiopathy wéi enger Presentatioun fir metastatic gastric Kriibs: e Fall Rapport an Revisioun vun der literature
• Xpert souwisou /RIF assay kann op archivéiert gastric aspirate benotzt gin an sputum Echantillon fir sensibel Diagnos vun Cabinet tuberculosis