FGF9 a partir de fibroblastos asociados al cáncer es un posible mediador de la invasión y anti-apoptosis de las gástrica FGF9 cells

cáncer a partir de fibroblastos asociados al cáncer es un posible mediador de la invasión y anti-apoptosis de las células de cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

fibroblastos asociados al cáncer (CAF), que se encuentran alrededor de las células tumorales, se sugieren para desempeñar un papel fundamental en la progresión tumoral. A continuación se realizó un análisis de microarrays para comparar los perfiles de expresión génica entre los CAF y fibroblastos gástricas no cancerosas (NGF) de un paciente con cáncer gástrico y se encontró que el factor de crecimiento de fibroblastos 9 gratis (FGF9
) fue un nuevo factor de crecimiento sobreexpresa en CAF. A continuación, examinó los efectos biológicos de FGF9 durante la progresión del cáncer gástrico.
Métodos
Expresión de FGF9 en CAF y los NGF, y sus productos secretados, se examinaron mediante transferencia Western. Los efectos de FGF9 en AGS y células de cáncer gástrico MKN28 en términos de proliferación, invasión y anti-apoptosis fueron evaluados por WST-1 ensayo, ensayo de cámara de invasión y FACS, respectivamente. Por otra parte, la señalización intracelular por el cual FGF9 ejerce sus funciones biológicas se examinó in vitro
.
Resultados
FGF9 se expresa fuertemente en los CAF en comparación con los NGF, siendo compatible con los datos de microarrays que indica que FGF9 era una novela de crecimiento factor de sobreexpresa en los CAF. El tratamiento con FGF9 promueve la invasión y anti-apoptosis mediante la activación de las vías de señalización de ERK y AKT en las células AGS y MKN28, mientras que estos efectos se atenúan por el tratamiento con anti-FGF9 anticuerpo neutralizante. Además, el tratamiento FGF9 aumentó significativamente la expresión de la metaloproteinasa de matriz 7 (MMP7) en ambas líneas celulares.
Conclusiones
FGF9 es un posible mediador secretada por CAF que promueve el anti-apoptosis y la capacidad invasiva de las células de cáncer gástrico. Palabras clave

fibroblastos asociada al cáncer de FGF invasión anti-apoptosis Antecedentes El cáncer gástrico ERK Akt
La formación de lesiones cancerosas se asocia íntimamente con su microentorno único. La progresión está estrechamente correlacionada con la capacidad de las células cancerosas para reclutar y activar las células estromales circundantes, y posteriormente los explotan [1]. las células del estroma que rodea el cáncer, tales como fibroblastos, células endoteliales y células del sistema inmune, pueden orquestar la tumorigénesis y metástasis mediante la interacción célula-célula y /o la producción de factores de crecimiento /citoquinas /quimioquinas solubles [1-3]. En este contexto, los fibroblastos en lesiones cancerosas son conocidos como los fibroblastos asociados con el cáncer (CAF) y han recibido mucha atención en relación con su papel en la progresión tumoral [4,5]. Aunque CAF son conocidos por ser en gran parte diferente de fibroblastos normales en los tejidos no neoplásicos en términos de su perfil de genes, el mecanismo por el cual los CAF promueven la progresión del tumor no está claro. Por lo tanto, se compararon los perfiles de expresión génica de los CAF, centrándose sobre todo en factores de crecimiento /citoquinas /quimioquinas, con las de los fibroblastos gástricas no cancerosas (NGF), utilizando microarrays de ensayo, y posteriormente aislado del factor de crecimiento de fibroblastos 9 gratis (FGF9
) como un nuevo gen que se sobreexpresa en los CAF en el cáncer gástrico.
FGF9, una proteína secretora de la familia de FGF, se informa, se expresa en las células del estroma incluyendo fibroblastos [6-8]. En general, la señalización de FGF se produce a través de FGF receptores (FGFR) para regular una variedad de comportamiento biológico celular, incluyendo la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y la motilidad [9], y la expresión de FGF9, FGFR2c, FGFR3b y FGFR3c se ha detectado en gástrico y de colon tipos de cáncer [10]. Por lo tanto, al igual que otras proteínas de la familia FGF, FGF9 puede jugar un papel fundamental en la interacción entre las células de cáncer y sus células estromales circundantes, y es de notar que FGF9 se expresa fuertemente en los CAF en el cáncer gástrico. En el presente estudio, se hacen pruebas de diferencias en la expresión de genes entre CAF y los NGF a partir de un paciente con cáncer gástrico. Se examinó el efecto de FGF9 sobre la proliferación, invasión y anti-apoptosis de las células de cáncer gástrico, y por otra parte aclaramos señalización intracelular por el cual FGF9 ejerce sus efectos biológicos sobre las células de cáncer gástrico.
Métodos
Reactivos y cultivo celular
FGF9 recombinante humana y el anticuerpo neutralizante anti-FGF9 humano se adquirieron de I + & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-extracelular regulada por señal de la proteína quinasa (ERK), anti-fosfo-específicos de ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-fosfo-específico Akt (p-Akt; Ser473) anticuerpos, y anti-β-actina fueron adquirido de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.) México la gástricos líneas celulares de cáncer de AGS se cultivó en medio F-12 de Ham (Sigma, Aurora, Ohio, EE.UU.) con 10% de suero bovino fetal (FBS;. BioWest, Nuaillé, Francia) en un incubador humidificado a 37 ° C con una atmósfera de 5% de CO 2. Del mismo modo, MKN28 se cultivó en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal, y otras cinco líneas celulares de cáncer gástrico MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY, y KATOIII se mantuvieron como se describe anteriormente [11].
Aislamiento y cultivo de fibroblastos humanos gástricos
cáncer gástrico (adenocarcinoma pobremente diferenciado) muestras de seres humanos se obtuvieron de un paciente que se sometió a una gastrectomía en Hyogo Colegio de Medicina del hospital en 2012. los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) se preparan a partir de la parte cancerosa en el estómago. fibroblastos gástricas no cancerosas (NGF) se prepararon a partir porción no canceroso con gastritis atrófica al menos 50 mm lejos de tumor en el estómago. Las muestras de tejido fueron recortados de tejido graso y necrótico, picada con escalpelos y se lavaron en PBS que contiene el reactivo antibiótico-antimicótico (Anti-Anti®, GIBCO). Las piezas de tejido se transfirieron a una microplaca de 12 pocillos (IWAKI, Tokio, Japón) en un fragmento /pocillo. Las células se cultivaron en medio DMEM (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) con FBS inactivado por calor al 10% a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO2. Se recogieron los fibroblastos que inicialmente crecieron en una monocapa, se transfirió a otro plato y se utiliza para experimentos en el 10º pasaje. Estos estudios se realizaron con la aprobación del Consejo de Hyogo la Facultad de Medicina de la opinión, y se obtuvo el consentimiento del paciente. Análisis de microarrays
utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), el ARN total fue extraído de tres conjuntos de CAF y los NGF cultivadas. etiquetado de cDNA, hibridaciones, la exploración y el análisis de los datos se realizaron por Hokkaido System Science Co., Ltd (Sapporo, Japón). Brevemente, cianina-3 (Cy3) marcado con cRNA se preparó a partir de ARN total (0,05 g) usando una entrada baja Amp rápida Labeling Kit (Agilent) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, seguido por purificación en columna RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA) . Tinte incorporación y cRNA rendimiento se comprobaron con un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro. Cy3 marcado cRNA (0,60 g) se fragmentó en 60 ° C durante 30 min en un volumen de reacción de 25 l que contenía tampón de fragmentación 1x Agilent y 2x Agilent agente de bloqueo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al término de la reacción de fragmentación, se añadieron 25 l de tampón de hibridación 2x ​​Agilent a la mezcla de fragmentación y se hibridaron a la Expresión Agilent SurePrint G3 Human Gene Microarray (8x60K ver.2.0) durante 17 h a 65 ° C en un horno de hibridación Agilent giratorio. Después de la hibridación, los microarrays se lavaron durante 1 min a temperatura ambiente con GE tampón de lavado 1 (Agilent) y durante 1 min a 37 ° C con tampón de lavado 2 GE (Agilent), después se secó de inmediato por breve centrifugación. Las láminas fueron escaneados inmediatamente después del lavado en un Agilent DNA microarrays escáner (G2565CA) usando una exploración ajuste de color para las diapositivas de matriz 8x60K (área de escaneado 61 × 21,6 mm, resolución de escaneado 3μm, canal de tinte para el Green PMT ajustado al 100%). Las imágenes escaneadas se analizaron y se normalizó con el software de extracción de características 10.7.3.1 (Agilent). La extracción de RNA
y la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
ARN total fue extraído inversa a partir de líneas celulares de cáncer gástrico utilizando reactivo Trizol (Invitrogen). Cuatro microgramos de ARN total fue transcrito de forma inversa utilizando oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, EE.UU.) y 200 U de superíndice ™ II transcriptasa inversa (Invitrogen) en un volumen total de 20μl. Para la PCR siguiente, los pares de cebadores de oligonucleótidos para FGFRs humanos
se prepararon como se describe anteriormente [12]. FGFR2c humana
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(adelante) y 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (marcha atrás); FGFR3b humana
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(adelante) y 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(marcha atrás); FGFR3c humana
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(adelante) y 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (marcha atrás); GAPDH humano
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(adelante) y 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (marcha atrás). Un microlitro de producto de RT (cDNA) se amplificó por PCR en un volumen de reacción de 50 l que contiene 20 pmol de los conjuntos anteriores de cebadores, 1,25 U de ADN Ampli-Taq polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, Calif., EE.UU.), y la final de tampón de PCR: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, ditiotreitol 10 mM, y 1 mM dNTP. La amplificación por PCR se realizó como sigue: para FGFRs
, a 95 ° C durante 5 min una vez; 40 ciclos a 95 ° C durante 30 s, a 57 ° C durante 30 s, y a 72 ° C durante 1 minuto; luego a 72 ° C durante 7 min; para GAPDH
, a 95 ° C durante 7 minutos una vez; 40 ciclos a 95 ° C durante 30 s, a 55 ° C durante 1 min, y a 72 ° C durante 30 s; a continuación, a 72 ° C durante 7 minutos.
en tiempo real RT-PCR
Real-time RT-PCR se realizó utilizando 7900H Sistema Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems) como se ha descrito anteriormente [13]. Los siguientes conjuntos de cebadores para metaloproteinasas de matriz humana 2 gratis (MMP2
), MMP 3
, MMP7
, MMP9
, y GAPDH
se prepararon (archivo adicional 1: Tabla S1) . En tiempo real ensayos de RT-PCR se llevaron a cabo con 200 ng de ADNc de ARN equivalente, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), y 500 nmol /l cebadores específicos de gen. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron 50 ° C durante 15 s, y 60 ° C durante 60 s. Se determinó la intensidad del colorante fluorescente, y cada uno de los niveles de expresión de ARNm se normalizó a GAPDH
niveles de expresión de mRNA. Ensayo de proliferación celular
AGS (4 × 10 3) y las células MKN28 (1 x 10 4) se sembraron en medio completo en microplacas de 96 pocillos. El medio se sustituye por otro con FGF9 recombinante (0-10 ng /ml). Se añadió solución de WST-1 después de 72 h de incubación, y las placas se incubaron a 37 ° C durante 1 h. Las placas se analizaron utilizando un lector de placas de ELISA a 450 nm con la longitud de onda de referencia fijado en 600 nm. Ensayo de invasión de la célula
ensayo de invasión de la célula se realizó utilizando cámaras de invasión BioCoat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células AGS (1 × 10 5) o células MKN28 (3 × 10 5) se sembraron en el inserto de la cámara de invasión recubierta con Matrigel (24 pozos, 8-micras de tamaño de poro) lleno de suero medio exento de que contiene diferentes concentraciones de FGF9 (0-10 ng /ml). A continuación, las células se incubaron con medio que contenía 10% de FBS en la cámara inferior a 37 ° C en 5% de CO2. Para inhibir los efectos de FGF9, anticuerpo anti-FGF9 (1 ​​mg /ml) se añadió también a la cámara superior. Después de incubación durante 27 h, las células no invasoras se eliminaron utilizando un hisopo de algodón y las células que habían invadido en la superficie inferior de la membrana se fijaron con etanol. Las células invasoras fueron teñidas con hematoxilina y se contaron usando un microscopio en cinco campos visuales diferentes (magnificación, x200).
Ensayo de apoptosis
AGS (2 × 10 5) y MKN28 (2,5 × 10 5) células se sembraron en placas de seis pocillos en medio de rutina para 24 h. Después las células se privaron de suero y se trataron con o sin FGF9 recombinante (1-10 ng /ml) durante 48 h. Para inhibir los efectos de FGF9, anticuerpo anti-FGF9 (1 ​​mg /ml) también se añadió al medio de cultivo. Después del tratamiento, se recogieron tanto las células flotantes y unidas, se lavaron con PBS y se tiñeron con AnnexinV-FITC y yoduro de propidio (PI) usando un Kit MEBCYTO Apoptosis (MBL, Nagoya, Japón). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.), y los datos obtenidos se analizaron mediante el programa informático CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EE.UU.).
Western blot
Western blot análisis se realizaron como se describe anteriormente [14]. En pocas palabras, después de tratamiento con o sin reactivo, las células se lisaron en tampón de extracción de proteínas, y el extracto de proteínas (30 g) se fraccionó por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa blotting. La membrana se incubó con un anticuerpo primario y luego con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. Las proteínas se detectaron utilizando un sistema de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido).
Inmunohistoquímica
Un total de 20 cánceres gástricos tejidos fueron obtenidos de muestras resecadas quirúrgicamente en Hyogo College of Medicine. El espécimen de tejido se fijaron en solución de formalina al 10% y embebidos en parafina. Este estudio fue aprobado por el Consejo de Hyogo la Facultad de Medicina de la opinión, y el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Las características de los pacientes con cáncer gástrico se mostraron en el archivo adicional 2: Tabla S2
tinción inmunohistoquímica para FGF9 se realizó con un kit de LSAB + utilizando anticuerpos anti-FGF9 (01:40; R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). como se describe anteriormente [15]. Por último, las secciones se incubaron en tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobenzide con 0,05% de H2O2 durante 3 min, y después por contraste con hematoxilina de Mayer. Para evaluar la inmunorreactividad de FGF9, se observaron al menos cinco campos visuales diferentes en la parte delantera invasivo de lesiones de cáncer gástrico. Una muestra se consideró positiva cuando se observaron nidos fibroblásticas FGF9-positivas en los campos visuales examinados.
Análisis de estadísticas
Todos los valores se expresan como la media ± desviación estándar. Los datos fueron analizados utilizando no pareada de dos colas t-test
. Los valores P Red de menos de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
análisis de microarrays de CAF en los tejidos de cáncer gástrico
aislamos los CAF y los NGF (Figura 1A) y se comparó el perfil de expresión génica de CAF con la de los NGF utilizando microarrays de ensayo. Diez genes representativos que se upregulated en CAF se enumeran en la Tabla 1. Entre estos genes, nos centramos en FGF9 como el gen más altamente expresado para examinar el papel de este factor de crecimiento producido-CAF en células de cáncer gástrico, y de hecho antes de iniciar in vitro
estudios se confirmó que las células CAF producen mucho mayor cantidad de proteína FGF9 que las células de NGF (Figura 1B). Además, confirmamos que FGF9 se expresa fuertemente en los fibroblastos en el estroma de la lesión de cáncer gástrico a partir del cual se aisló CAF (Figura 1C). Figura 1 La expresión de FGF9 y sus receptores en los CAF y células de cáncer gástrico. (A) Morfología de los CAF gástricos y los NGF. (B) Producción de FGF9 en los CAF gástricos, los NGF y su medio condicionado (CM). (C) Expresión de FGF9 en CAF de la lesión cáncer gástrico. Las flechas indican los CAF. (D) La expresión de receptores de FGF
responsable de FGF9 en líneas celulares de cáncer gástrico.
Tabla 1 representante genes expresados ​​diferencialmente en los CAF de los NGF
Nº de Acceso
Símbolo

Gen
doble cambio
hasta reguladas
NM_014333
CADM1
célula molécula 1 de adhesión, transcripción variante 1 | 273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb | is39c09.y1 HR85 islote ADNc Homo sapiens clon IMAGEN: 6554705 ', secuencia de ARNm 5
254,8
NM_001113207
TSTD1
tiosulfato sulfurtransferase (rodanesa) -como dominio que contiene 1, transcripción variante 1 | 237,5
NM_000867
HTR2B página 5-hidroxitriptamina (serotonina) del receptor 2B
171,5
NM_001008539
SLC7A2
familia 7 de portador de soluto (transportador de aminoácidos catiónicos, y sistema +), miembro 2, transcripción variante 2
142,5
NM_002010
FGF9
del factor de crecimiento de fibroblastos 9 (factor de activación de la glía-)
141,1
NM_005559
LAMA1
La laminina, alfa 1 | 119,0
NM_001040058
SPP1
secretada fosfoproteína 1, variante de transcripción 1
116.1
A_24_P247454
A_24_P247454
Unknown
112.6
NM_014398
LAMP3
Lysosomal-associated proteína de la membrana 3
111,3
abajo reguladas
NM_001141919
XG
grupo sanguíneo Xg (XG), transcripción variante 2, España 0,0035
NM_175569
XG
XG grupo sanguíneo (XG), transcripción variante 1 | 0,0044
NM_000609
CXCL12
quimiocina (motivo CXC) ligando 12 (CXCL12), transcripción variante 2
0,0071
NM_014817
TRIL
TLR4 interactor con repeticiones ricas en leucina
0,0099
NM_002839
PTPRD
proteína tirosina fosfatasa, receptor de tipo D, transcripción variante 1 | 0,0138
NR_021485
EGFEM1P
dominio de tipo EGF y EMI que contiene 1, pseudogen, el ARN no codificador
dominio 0,0141
NM_198285
WDR86
WD repita 86
0,0145
NM_001164000
MECOM
MDS1 y EVI1 locus complejo (MECOM), transcripción variante 6
antígeno de las células del estroma de la médula 0,0166
NM_004335
BST2
Bone 2
0,0168
ENST00000484765
XLOC_002912
hipotético LOC100507661 (LOC100507661), miscRNA
0,0172
veces cambiar los valores fueron evaluados como una relación de CAF normalizadas /NGF normalizados.
Expresión de FGFR2c Opiniones y FGFR3b /c Hoteles en líneas celulares de cáncer gástrico
FGF9 ha informado para mostrar una alta afinidad para la isoforma FGFR2c y isoformas FGFR3b /c [12]. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de estos FGFR
en varias líneas de cáncer gástrico mediante RT-PCR. Como se muestra en la Figura 1D, se detectó expresión de FGFR2c
en las siete líneas celulares de cáncer gástrico, mientras que la expresión de FGFR3b /c
se detectó en seis de los siete, con la excepción de MKN74. Estos hallazgos sugieren que las células de cáncer gástrico tienen la capacidad de responder a la estimulación FGF9.
FGF9 activa las ERK y Akt vías de señalización en las células de cáncer gástrico
se investigó el efecto de la estimulación FGF9 sobre las posibles vías incluyendo ERK y Akt en gástrica líneas celulares de cáncer [16]. La expresión de ambos p-Akt y p-ERK fue dependiente de la dosis mejorada por la estimulación FGF9 en células AGS y MKN28 (Figura 2A). La mejora fue evidente a partir de 15 min después de FGF9 tratamiento (10 ng /ml) en ambas líneas celulares (Figura 2B). Por otra parte, se examinó el efecto de anticuerpos neutralizantes anti-FGF9 en células de cáncer gástrico y encontramos que el aumento de la expresión de p-Akt y p-ERK provocada por la estimulación FGF9 fue atenuada por la administración concomitante de anticuerpos neutralizantes anti-FGF9 (Figura 2C). Figura 2 Efecto del tratamiento FGF9 en la señalización intracelular en las células de cáncer gástrico. (A) La fosforilación de Akt y ERK en células de cáncer gástrico tratados con FGF9. AGS (4 × 105) y MKN28 (4 × 105) se cultivaron en placas de seis pocillos y se trataron con varias concentraciones de FGF9 de 30 min. proteína extraída se analizó mediante transferencia Western, como se describe en Materiales y Métodos. (B) Tiempo de cambio de rumbo en la Akt y ERK fosforilación en células de cáncer gástrico tratados con FGF9. células AGS y MKN28 fueron tratados de manera similar con FGF9 (10 ng /ml) durante los tiempos indicados. (C) Efecto de anti-FGF9 anticuerpos neutralizantes sobre la fosforilación de Akt y ERK inducida por FGF9 en células de cáncer gástrico. células AGS y MKN28 se pretrataron con anticuerpo anti-FGF9 (Ab; 1 mg /ml) durante 45 min y después se estimularon con FGF9 (10 ng /ml) durante 30 min
Efecto de FGF9 sobre la proliferación celular, la invasión y anti. -apoptosis en células de cáncer gástrico
Desde FGF9 se sabe que tiene un efecto mitogénico en algunos tipos de células [17], primero a prueba el efecto de FGF9 en la cinética de crecimiento de células de cáncer gástrico. Sin embargo, no se encontraron efectos de FGF9 sobre la proliferación celular en el AGS y líneas celulares MKN28 (Figura 3A). Figura 3 Efecto de FGF9 en el crecimiento y anti-apoptosis de células de cáncer gástrico. (A) Efecto de FGF9 en el crecimiento de células de cáncer gástrico. (B-D) Efecto de FGF9 en capacidad anti-apoptosis de las células de cáncer gástrico. (B) gráficas representativas de análisis FACS utilizando tinción con anexina V-FITC. células AGS se trataron con FGF9 (10 ng /ml) y se evaluaron como se describe en Materiales y Métodos. (C) Los cambios en el número de células apoptóticas y AGS MKN28 tratados con FGF9. (D) Efecto de anti-FGF9 anticuerpo neutralizante (Neu Ab; 1 mg /ml) en FGF9 (10 ng /ml) inducida por anti-apoptosis en las células AGS y MKN28. Todos los resultados se expresan como la media ± SD de cuatro muestras. Significativamente más bajo que el control: * P
< 0,05, ** P
< 0,01. Significativamente mayor que el grupo tratado con FGF9-: # P Hotel < 0,05, P ## Hotel < 0,01
Para identificar aún más el posible papel de FGF9 en la progresión tumoral, se examinó si FGF9 exógeno confiere una. efecto anti-apoptótico en células de cáncer gástrico. Los análisis FACS reveló que el número de células AGS V-positivo de anexina fue significativamente menor en el grupo FGF9-tratado que en el grupo control, y se obtuvieron resultados similares en células MKN28 (Figura 3B y C). Además, este efecto de FGF9 fue abolida por la administración concomitante de anti-FGF9 anticuerpo neutralizante en ambas líneas celulares (Figura 3D).
Además, examinó el efecto de FGF9 de la capacidad invasiva de las células de cáncer gástrico. Cuando las células AGS se estimularon con FGF9 (1-10 ng /ml), el número de células invasoras se incrementó significativamente (Figura 4A). Del mismo modo, la capacidad invasiva de las células MKN28 fue significativamente dependiente de la dosis por la estimulación FGF9 (Figuras 4A). A continuación, examinó si este efecto pro-invasivo de FGF9 podría ser abolida mediante la adición de un anticuerpo neutralizante. En ambas líneas celulares, después de la administración concomitante de anticuerpo neutralizante FGF9 (1 ​​mg /ml), el número de células invasoras se redujo significativamente en comparación con las células tratadas con FGF9 sola (10 ng /ml) (Figura 4B). Además, se examinó si FGF9 induce la expresión de las MMP, que desempeñan un papel fundamental en la invasión de varios tipos de cáncer. Como se muestra en la Figura 4C, la estimulación mejorada FGF9 comúnmente la expresión de MMP7
en ambos AGS y células MKN28. Figura 4 Efecto de FGF9 en la invasión y MMPs expresión de células de cáncer gástrico. (A) Efecto de FGF9 en la invasión de células de cáncer gástrico. Cambio en el número de células invasoras y AGS MKN28 tratados con FGF9 fueron examinados. Fotografías que muestran imágenes representativas de células de cáncer gástrico invasoras en el FGF9 grupos tratados y de control. (B) Efecto de anti-FGF9 anticuerpo neutralizante (Neu Ab; 1 mg /ml) en FGF9 (10 ng /ml) inducida por la invasión de células AGS y MKN28. (C) Efecto de FGF9 en la expresión de las MMP Hoteles en células de cáncer gástrico. Todos los resultados se expresan como la media ± SD de cuatro muestras. Significancia mayor que en control: * P
< 0,05, ** P
< 0,01. Significativamente más bajo que el grupo tratado con FGF9-: # P Hotel < 0,05, P ## Hotel < 0,01
significado clínico-patológica de expresión FGF9 en los fibroblastos asociados con el cáncer gástrico Red de la cáncer gástrico 20. muestras de tejidos examinados, dieciséis (80%) fueron positivos para la expresión FGF9. En cuanto a las características clínico-patológicas, ninguno de los parámetros ─ edad, sexo, localización del tumor, el tipo histológico, el tumor o la etapa ─ tenía una relación significativa con la expresión FGF9 (archivo adicional 2: Tabla S2) se cree
Discusión Se
. que el desarrollo y progresión del tumor depende de la diafonía entre las células de cáncer y sus células del estroma circundante. Como una población importante del estroma, "activado" fibroblastos, referidos como CAF, se han sugerido para promover la tumorigénesis utilizando diversas señales moleculares, y en el presente estudio se aislaron FGF9
como nuevo gen que se sobreexpresa en los CAF en el cáncer gástrico . La acumulación de pruebas, incluyendo nuestros datos actuales, han demostrado que los CAF se diferencian de los NGF en términos de no sólo la morfología, sino también a los perfiles de expresión génica [18,19], aunque los mecanismos subyacentes responsables de estas diferencias aún no están claros. Sobre la base de la evidencia reciente, es tentador proponer que las células tumorales inician un cambio de NGF a los CAF a través de algún tipo de señalización [20] o que CAF se originan en las células del cáncer a través de la transición epitelio-mesenquimal [21,22]. Curiosamente, es ampliamente aceptado que la familia de FGF es crucial para la transición epitelio-mesenquimal, no sólo durante el desarrollo, sino también en la carcinogénesis [9,23]. En el presente estudio, mostramos que la CAF son una posible fuente de FGF9, y que las células de cáncer gástrico, además, tienen receptores que responden a FGF9, lo que sugiere que FGF9 puede ser un mediador potencial entre CAF y células de cáncer gástrico.
Lo que es el posible papel de FGF9 en la patogénesis del cáncer gástrico? Desde FGF9 sirve como mitógeno para próstata o el cáncer de ovario [17,24], lo primero que investigó la proliferación de células de cáncer gástrico en presencia de FGF9 in vitro
. Posteriormente, FGF9 no para promover la proliferación tanto de AGS y MKN28 líneas celulares de cáncer gástrico; Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que FGF9 puede servir como mitógeno para otros tipos de células de cáncer gástrico porque FGF9 promueve la proliferación de otras células de cáncer gástrico, tales como AZ521 o SGC-7901 [25,26]. Por otra parte, hemos aclarado en el presente estudio que FGF9 tiene un efecto anti-apoptótica en células de cáncer gástrico, de acuerdo con los resultados de varios estudios anteriores [26,27]. En apoyo de esta conclusión, Akt y ERK vía de señalización, crucial para la lucha contra la apoptosis, se activó comúnmente en ambas líneas celulares de cáncer gástrico. Por otra parte, Akt y /o fosforilación de ERK y la célula resultante invasión inducida por FGF9 fue abolida por el bloqueo de la estimulación FGF9, lo que sugiere que al menos FGF9 actúa como un factor anti-apoptótica.
También examinamos si FGF9 promueve la capacidad invasiva de las gástrica Células cancerígenas. En vitro
estudios demostró que el tratamiento FGF9 aumentó el número de células invasoras de cáncer gástrico, mientras que este aumento de la capacidad invasiva fue suprimida por la adición de anticuerpo neutralizante FGF9. Aunque no está claro cómo FGF9 promueve la invasión de células de cáncer gástrico, la degradación de la matriz extracelular es una parte importante de este proceso [28]. En este contexto, se acepta que las MMP desempeñan un papel central en este tipo de comportamiento celular y promueven la capacidad invasiva de diversos tumores malignos [29]. Por lo tanto, hacen pruebas de las MMP que están vinculadas a la estimulación FGF9 y encontró que se MMP7 potencialmente implicados. Curiosamente, los estudios recientes han puesto de relieve la importancia de MMP7 en la progresión del cáncer gástrico, ya que tiene el potencial de MMP7 no sólo degradan la matriz extracelular sino también confieren un efecto anti-apoptótica en células de cáncer [30-32]. De acuerdo con ello, en un estudio futuro, tenemos la intención de centrarse en el eje FGF /MMP7 en el contexto de la invasión de células de cáncer gástrico.
Conclusión
En resumen, hemos demostrado que los CAF gástricos difieren de sus correspondientes NGF en términos de sus perfiles de expresión de genes, y proponen que FGF9 es una molécula potencial que media la diafonía entre los CAF y células de cáncer gástrico. Por otra parte, hemos aclarado que FGF promueve el anti-apoptosis y la capacidad invasiva de las células de cáncer gástrico. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que FGF9 es un posible mediador secretada por los fibroblastos asociados al cáncer que promueve la lucha contra la apoptosis y la capacidad invasiva de las células de cáncer gástrico.
Notas
Chao Sun y Hirokazu Fukui contribuyeron igualmente a este trabajo.
abreviaciones
FGF: factor de crecimiento de fibroblastos

MMP: metaloproteinasa de matriz

ERK :
extracelular de la proteína quinasa regulada por señales
CAF:
fibroblastos asociada con el cáncer
Declaraciones
Agradecimientos Este trabajo
fue apoyado en parte por subvenciones-en-ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón (23591949 a MS, 25460466 y 26460953 de SK HF). Este trabajo también fue apoyado en parte por la subvención-en-Ayudas a Investigadores, Hyogo College of Medicine y programa apoyado por la Fundación de Investigación Estratégica en la Universidad privada (MS).
Los autores agradecen a Noriko Kamiya (División de Gastroenterología, Departamento de Medicina interna) y Yuko Yasui (Departamento de Cirugía) por su asistencia técnica y también apreciar Nobuyuki Adachi y Ryota Shinozaki (HCM instalaciones Joint-uso de investigación) para contribuciones técnicas archivos adicionales

archivo adicional 1:. Tabla S1 . Los cebadores para el análisis en tiempo real de RT-PCR. la disposición 2: Tabla S2. Relación entre las características clínico-patológicos y la expresión del estroma FGF9 en pacientes con cáncer gástrico. Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
contribuciones de los autores
CS y HF diseñado y realizado todos los experimentos, analizados los datos, y escribió el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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