FGF9 a partir de fibroblastos associados ao câncer é um possível mediador de invasão e anti-apoptose de FGF9 cells

câncer gástrico a partir de fibroblastos associados ao câncer é um possível mediador de invasão e anti-apoptose das células cancerosas gástricas da arte abstracta
Fundo
fibroblastos associada a cancro (FAC), que residem em torno das células tumorais, são sugeridos para desempenhar um papel fundamental na progressão tumoral. Aqui realizamos microarray análises para comparar perfis de expressão gênica entre FAC e fibroblastos gástricas não cancerosas (NGFS) de um paciente com câncer de estômago e descobriu que o fator de crescimento de fibroblastos 9
(FGF9
) foi um romance factor de crescimento sobre-expressos em FAC. Em seguida, examinou os efeitos biológicos de FGF9 durante a progressão do cancro gástrico.
Métodos
Expressão de FGF9 em FAC e NGFs, e os seus produtos de secreção, foram examinados por transferência Western. Os efeitos de FGF9 em AGS e células de cancro gástrico MKN28 em termos de proliferação, invasão e anti-apoptose foi avaliada pelo ensaio de WST-1, ensaio de câmara de invasão e de FACS, respectivamente. Além disso, a sinalização intracelular pelo qual FGF9 exerce suas funções biológicas foi examinada in vitro
.
Resultados
FGF9 foi fortemente expresso em FAC em comparação com NGFs, sendo compatível com os dados microarray indicando que FGF9-se um crescimento novela fator de sobre-expressos em FAC. O tratamento com FGF9 promovido invasão e anti-apoptose através da activação das vias de sinalização de ERK e Akt em células MKN28 e AGS, enquanto que estes efeitos foram atenuadas por tratamento com anticorpo neutralizante anti-FGF9. Além disso, o tratamento FGF9 aumentou significativamente a expressão de metaloproteinase da matriz 7 (MMP7) em ambas as linhas celulares.
Conclusões
FGF9 é um mediador possível segregada por FAC que promove a apoptose e anti-capacidade invasiva de células de cancro gástrico.
Palavras-chave
fibroblastos FGF cancer associada Invasion Anti-apoptose ERK Akt gástrica fundo câncer
A formação de lesões cancerosas está intimamente associada com o seu microambiente único. Progressão está estreitamente correlacionada com a capacidade de células cancerígenas para recrutar e activar as células do estroma que rodeiam, e subsequentemente os explorar [1]. As células do estroma circundante-cancro, tais como fibroblastos, células endoteliais, e células imunitárias, podem orquestrar a tumorigénese e metástases através da interacção célula-a-célula e /ou a produção de factores de crescimento /citocinas /quimiocinas solúveis [1-3]. Neste contexto, os fibroblastos em lesões cancerosas são conhecidos como f ibroblastos associados a cancro (FAC) e têm recebido muita atenção no que diz respeito ao seu papel na progressão tumoral [4,5]. Embora FAC são conhecidos por serem em grande parte diferente a partir de fibroblastos normais em tecidos não-neoplásicas em termos do seu perfil de genes, o mecanismo pelo qual FAC promover a progressão do tumor não é clara. Portanto, foram comparados os perfis de expressão gênica de FAC, com foco principalmente nos fatores de crescimento /citocinas /quimiocinas, com os de fibroblastos gástricas não cancerosas (NGFS) usando ensaio de microarray e posteriormente isolado do fator de crescimento de fibroblastos 9
(FGF9
) na forma de um novo gene que foi sobre-expresso em cancro gástrico em FAC.
FGF9, uma proteína secretora da família dos FCF, é declaradamente expressa em células estromais incluindo fibroblastos [6-8]. Em geral, a sinalização do FGF ocorre através de FGF receptores (FGFR) para regular uma variedade de comportamento biológico da célula, incluindo a proliferação, diferenciação, sobrevivência e motilidade [9], e a expressão de FGF9, FGFR2c, FGFR3b e FGFR3c foi detectada em gástrico e do cólon cancros [10]. Assim, como outras proteínas da família FGF, FGF9 pode desempenhar um papel central na interação entre células cancerosas e suas células do estroma circundante, e é digno de nota que FGF9 é fortemente expresso no FAC em câncer gástrico. No presente estudo, nós analisamos as diferenças na expressão genética entre FAC e NGFs de um paciente com câncer gástrico. Foi examinado o efeito de FGF9 sobre a proliferação, invasão e anti-apoptose de células de cancro gástrico, e além do mais esclarecidas a sinalização intracelular, através da qual FGF9 exerce os seus efeitos biológicos sobre células de cancro gástrico.
Métodos
Reagentes e cultura de células
FGF9 recombinante humano e de anticorpo neutralizante anti-FGF9 humana foram adquiridos a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). proteína-quinase anti-extracelular regulada por sinal (ERK), anti-fosfo específica ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-fosfo-específico Akt (P-Akt; Ser473) anticorpos, e anti-β-actina foram adquirido a Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA)
Os gástricas linhas celulares de cancro da AGS foi cultivada em meio de Ham F-12 (Sigma, Aurora, Ohio, EUA) com 10% de soro fetal bovino (FBS;. Biowest, Nuaillé, França) numa incubadora humidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO 2. Da mesma forma, MKN28 foi cultivada em RPMI 1640 com soro 10% fetal de bovino, e outros cinco linhas celulares de cancro gástrico MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY, e KATOIII foram mantidos como previamente descrito [11].
Isolamento e cultura de fibroblastos gástricos humanos
(adenocarcinoma pouco diferenciado) amostras de cancro gástrico humano foram obtidas de um paciente submetido à gastrectomia em Hyogo College of Medicine Hospital em 2012. fibroblastos associados ao câncer (FAC) foram preparados a partir da porção cancerosa no estômago. fibroblastos gástricos não cancerosos (NGFS) foram preparadas a partir da porção não-cancerosas com gastrite atrófica, pelo menos, 50 mm, medida a partir de tumor no estômago. Os espécimes de tecido foram cortados do tecido adiposo e necrótica, picada com bisturis e lavou-se em PBS contendo reagente de antibiótico-antimicótico (Anti-Anti®, GIBCO). Os pedaços de tecido foram transferidas para uma microplaca de 12 poços (IWAKI, Tóquio, Japão) a um fragmento /poço. As células foram cultivadas em meio DMEM (GIBCO, Grand Island, NY, EUA) com FBS inactivado pelo calor 10%, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Os fibroblastos que, inicialmente, cresceram em uma monocamada foram recolhidos, transferidos para outro prato e usado para experimentos na 10ª passagem. Estes estudos foram feitos com a aprovação do Conselho de Hyogo College of Medicine Review, e foi obtido consentimento informado do paciente. Análise Microarray
Utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), o RNA total foi extraiu-se a partir de três conjuntos de FAC e NGFs cultivadas. rotulagem cDNA, hibridações, digitalização e análise de dados foram realizados por Hokkaido Sistema Science Co., Ltd (Sapporo, Japão). Resumidamente, cianina-3 (Cy3) marcado com ARNc foi preparado a partir de ARN total (0,05 g) usando uma baixa de entrada rápida Amp Labeling Kit (Agilent), em conformidade com as instruções do fabricante, seguido de purificação em coluna RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA) . Dye incorporação eo rendimento cRNA foram verificadas com um NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer. -Cy3 marcado ARNc (0,60 ug) foi fragmentado a 60 ° C durante 30 minutos num volume de reacção de 25 ul contendo tampão de fragmentação Agilent 1x e 2x Agilent agente bloqueador, de acordo com as instruções do fabricante. Após a conclusão da reacção de fragmentação, 25 ul de tampão de hibridação 2x Agilent foi adicionado à mistura de fragmentação e hibridado com Human Gene Agilent SurePrint G3 Expressão Microarray (8x60K Ver.2.0) durante 17 h a 65 ° C num forno de hibridação rotativo Agilent. Após a hibridação, as micromatrizes foram lavadas durante 1 min à temperatura ambiente com tampão de lavagem 1 GE (Agilent) e durante 1 min a 37 ° C com tampão de lavagem 2 GE (Agilent), depois secou-se imediatamente através de uma breve centrifugação. As lâminas foram digitalizada imediatamente após a lavagem em um Agilent DNA Microarray Scanner (G2565CA) usando uma varredura de cor configuração para corrediças da disposição 8x60K (Área de Digitalização 61 × 21,6 milímetros, resolução de 3 �m digitalização, canal de tintura para Green PMT definido como 100%). As imagens digitalizadas foram analisados ​​e normalizados com Extração de Características Software 10.7.3.1 (Agilent). Extração de RNA Comprar e transcrição reversa-polimerase reação em cadeia (RT-PCR)
RNA total foi extraído de linhas celulares de cancro gástrico utilizando o reagente Trizol (Invitrogen). Quatro microgramas de RNA total foi transcrito reverso utilizando oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, EUA) e 200 U de Superscript ™ II transcriptase reversa (Invitrogen) num volume total de 20 ul. Para PCR o seguinte, os pares de iniciadores oligonucleotídicos para FGFR
humanos foram preparados como anteriormente descrito [12]. FGFR2c humana
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(Avançar) e 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (reverso); FGFR3b humana
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Avançar) e 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(reverso); FGFR3c humana
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Avançar) e 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (reverso); GAPDH humana
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(Avançar) e 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (Reverse). Um microlitro do produto de RT (cDNA) foi amplificada por PCR num volume reaccional de 50 ul contendo 20 pmol dos conjuntos anteriores de iniciadores, 1,25 U de polimerase Ampli-Taq de ADN (Applied Biosystems, Foster City, Calif., EUA), e o tampão de PCR final: Tris-HCl 20 (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, ditiotreitol 10 mM, dNTP e 1 mM. A amplificação por PCR foi realizada como se segue: FGFR para
, a 95 ° C durante 5 minutos uma vez; 40 ciclos a 95 ° C durante 30 s, a 57 ° C durante 30 s, e a 72 ° C durante 1 min; em seguida, a 72 ° C durante 7 min; para GAPDH
, a 95 ° C durante 7 min uma vez; 40 ciclos a 95 ° C durante 30 s, a 55 ° C durante 1 min, e a 72 ° C durante 30 seg; em seguida, a 72 ° C durante 7 min.
em tempo real de RT-PCR em tempo real
RT-PCR foi realizada utilizando 7900H rápida Real-Time PCR System (Applied Biosystem), como previamente descrito [13]. Os seguintes conjuntos de primers para metaloproteinase de matriz 2 humano
(MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
e GAPDH
foram preparados (arquivo adicionais 1: Tabela S1) . Em tempo real Os ensaios de RT-PCR foram realizadas com 200 ng de ADNc de ARN equivalente, SYBR Verde Master Mix (Applied Biosystems), e 500 nmol /L de genes iniciadores específicos. As condições dos ciclos de PCR foram 50 ° C durante 15 s, e 60 ° C durante 60 s. Determinou-se a intensidade do corante fluorescente, e cada um dos níveis de expressão de ARNm de GAPDH foi normalizada para
níveis de expressão de ARNm. ensaio de proliferação celular
AGS (4 × 10 3) e células MKN28 (1 × 10 4) foram semeadas em meio completo em microplacas de 96 poços. O meio foi então substituído por um contendo FGF9 recombinante (0-10 ng /ml). WST-1 solução foi adicionado após 72 horas de incubação, e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 1 h. As placas foram analisadas utilizando um leitor de placas de ELISA a 450 nm, com o comprimento de onda de referência fixado a 600 nm. Ensaio de invasão celular
ensaio de invasão celular foi realizada utilizando câmaras de invasão de Matrigel BioCoat (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células AGS (1 × 10 5) ou células MKN28 (3 × 10 5) foram semeadas na inserção da câmara de invasão de Matrigel-revestidas (24 poços, 8 mícrons de tamanho de poro) cheio com soro forma -livre contendo diferentes concentrações de FGF9 (0-10 ng /ml). Em seguida, as células foram incubadas com meio contendo FBS a 10% na câmara inferior a 37 ° C em 5% de CO2. Para inibir os efeitos do FGF9, também foi adicionado anticorpo anti-FGF9 (1 ​​ug /ml) para a câmara superior. Após incubação durante 27 h, as células não invasoras foram removidos usando um cotonete e as células que tinham invadido para a superfície inferior da membrana foram fixadas com etanol. As células invasoras foram então coradas com hematoxilina e contadas usando um microscópio em cinco campos visuais diferentes (Ampliação, x200).
Ensaio de apoptose
AGS (2 × 10 5) e MKN28 (2,5 × 10 5) As células foram semeadas em placas de seis poços em meio de rotina durante 24 h. As células foram então privadas de soro e tratadas com ou sem FGF9 recombinante (1-10 ng /ml) durante 48 h. Para inibir os efeitos do FGF9, também foi adicionado anticorpo anti-FGF9 (1 ​​ug /ml) ao meio de cultura. Após o tratamento, as células flutuantes e ambos ligados foram colhidas, lavadas com PBS e coradas com AnnexinV-FITC e iodeto de propídio (PI) usando um kit de apoptose MEBCYTO (MBL, Nagoya, Japão). As células coradas foram analisadas num citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA), e os dados obtidos foram analisados ​​usando o software Cellquest (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EUA).
análise de Western blot
análises de Western blot foram realizados tal como descrito anteriormente [14]. Resumidamente, após o tratamento, com ou sem reagente, as células foram lisadas em tampão de extracção de proteína, e extracto de proteína (30 ug) foi fraccionado por electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida e transferido para uma membrana de nitrocelulose blotting. A membrana foi incubada com um anticorpo primário e, em seguida, com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase. As proteínas foram detectadas usando um sistema de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). A imuno-histoquímica

Um total de 20 cancros gástricos tecidos foram obtidos a partir de amostras de ressecção cirúrgica em Hyogo College of Medicine. As amostras de tecido foram fixadas em solução de formalina a 10% e embebidos em parafina. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Hyogo College of Medicine Review, eo consentimento informado foi obtido de todos os pacientes. As características dos pacientes com câncer gástrico foram apresentados em arquivo adicionais 2: Tabela S2
coloração imuno-histoquímica para FGF9 foi realizada com um LSAB + kit utilizando anticorpo anti-FGF9 (01:40; I & D Systems, Minneapolis, MN, EUA). tal como descrito anteriormente [15]. Finalmente, as secções foram incubadas em tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzide com 0,05% de H2O2, durante 3 minutos, e depois contra-coradas com hematoxilina de Mayer. Para avaliar a imuno-reactividade de FGF9, pelo menos cinco campos visuais diferentes foram observadas na frente invasiva de lesões gástricas cancerosas. A amostra foi considerada positiva quando ninhos fibroblásticas FGF9-positivas foram observadas nos campos visuais examinados.
Análise Estatística
Todos os valores foram expressos como a média ± SD. Os dados foram analisados ​​usando não pareado bicaudal t
-teste. foram considerados os valores P
de menos de 0,05 para indicar significância estatística.
Resultados
Microarray análise da FAC em tecidos com câncer gástrico
Nós isolados FAC e NGFs (Figura 1A) e comparou o perfil da expressão gênica FAC com a de NGFs utilizando um ensaio de micromatriz. Dez genes representativos que foram regulados positivamente no FAC são listados na Tabela 1. Entre estes genes, que FGF9 alvo como o gene mais altamente expresso para examinar o papel deste factor de crescimento CAF-produzido em células de cancro gástrico, e, de facto, antes de iniciar in vitro
estudos que confirmaram que as células CAF produzida muito maior quantidade de proteína FGF9 do que as células de NGF (Figura 1B). Além disso, constatou-se que FGF9 é fortemente expressa nos fibroblastos no estroma da lesão cancro gástrico a partir do qual a CAF foi isolado (Figura 1C). A Figura 1 Expressão de FGF9 e seus receptores em células de FAC e cancro gástrico. (A) Morfologia da FAC gástricas e NGFs. (B) Produção de FGF9 na FAC gástricas, NGFs e seu meio condicionado (CM). (C) A expressão da FGF9 no FAC da lesão cancro gástrico. Setas indicando FAC. (D) A expressão de receptores de FGF
responsável por FGF9 em linhas celulares de cancro gástrico.
Tabela 1 genes representativos diferencialmente expressos no FAC de NGFs
Nº de Acesso
Símbolo

nome Gene
Dobre mudança
-regulada
NM_014333
CADM1
celular molécula de adesão 1, variante de transcrição 1 | 273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb | is39c09.y1 HR85 ilhéu Homo sapiens clone cDNA imagem: 6554705 5 ', a sequência de mRNA
254,8
NM_001113207
TSTD1
Tiossulfato sulfurtransferase (rodanase) -como domínio contendo 1, transcrito variante 1 | 237,5
NM_000867
HTR2B
5-hidroxitriptamina receptor (serotonina) 2B
171,5
NM_001008539
SLC7A2
Soluto família transportadora 7 (transportador de aminoácidos catiônica, variante de transcrição 2
142,5
NM_002010
FGF9
fator de crescimento 9 (fator ativador de glia)
141,1
NM_005559
LAMA1
A laminina, alpha 1 | 119,0
NM_001040058
SPP1
secretada fosfoproteína 1, variante de transcrito 1
116.1
A_24_P247454
A_24_P247454
Unknown
112.6
NM_014398
LAMP3
Lysosomal-associated proteína de membrana 3
111,3
regulada
NM_001141919
XG
grupo sanguíneo Xg (XG), variante transcrição 2,
0,0035
NM_175569
XG
grupo sanguíneo XG (XG), variante transcrição 1 | 0,0044
NM_000609
CXCL12
quimiocina (motivo CXC) ligando 12 (CXCL12), variante transcrição 2
0,0071
NM_014817
TRIL
TLR4 interagente com repetições ricas em leucina
0,0099
NM_002839
PTPRD
proteína tirosina fosfatase, tipo de receptor D, variante transcrição 1 | 0,0138
NR_021485
EGFEM1P
dominio como EGF e EMI contendo 1, pseudogene, não-codificante RNA
domínio 0,0141
NM_198285
WDR86
WD repeat 86
0,0145
NM_001164000
MECOM
MDS1 e EVI1 lócus complexo (MECOM), variante transcrição 6
antigénio das células do estroma da medula 0,0166
NM_004335
BST2
osso 2
0,0168
ENST00000484765
XLOC_002912
hipotética LOC100507661 (LOC100507661), miscRNA
0,0172
alterar valores Fold foram avaliadas como uma proporção da FAC normalizados /NGFs normalizados.
Expressão da FGFR2c Comprar e FGFR3b /c
em linhas celulares de cancro gástrico
FGF9 tem sido relatada a mostrar uma elevada afinidade para a isoforma FGFR2c e FGFR3b /c isoformas [12]. Portanto, foi examinada a expressão de FGFR
estas em várias linhas de cancro gástrico utilizando RT-PCR. Tal como mostrado na Figura 1D, a expressão de FGFR2c
foi detectada em todas as sete linhas de células de cancro gástrico, enquanto que a expressão de FGFR3b /C
foi detectada em seis das sete, com a excepção de MKN74. Estes resultados sugerem que as células cancerosas gástricas têm a capacidade de responder à estimulação FGF9.
FGF9 ativa as ERK e AKT vias de sinalização em células cancerosas gástricas
Nós investigamos o efeito da estimulação FGF9 sobre possíveis vias incluindo ERK e Akt em gástrica linhas celulares de cancro [16]. A expressão de ambos P-Akt e ERK-P foi aumentada dependentemente da dose por estimulação FGF9 em células AGS e MKN28 (Figura 2A). A melhoria foi evidente a partir de 15 minutos após o tratamento FGF9 (10 ng /mL) em ambas as linhas celulares (Figura 2B). Além disso, examinou-se o efeito do anticorpo neutralizante anti-FGF9 em células de cancro gástrico e encontraram que o aumento da expressão da P-Akt e p-ERK induzida por estimulação FGF9 foi atenuada pela administração concomitante de anticorpo neutralizante anti-FGF9 (Figura 2C). Figura 2 Efeito do tratamento FGF9 na sinalização intracelular em células de cancro gástrico. (A) A fosforilação de Akt e ERK em células cancerosas gástricas tratados com FGF9. AGS (4 × 105) e MKN28 (4 × 105) foram cultivadas em placas de seis poços e tratadas com várias concentrações de FGF9 durante 30 min. proteína extraída foi analisada por transferência Western, como descrito em Materiais e Métodos. (B) Tempo de mudança de curso em Akt e ERK fosforilação em células cancerosas gástricas tratados com FGF9. células AGS e MKN28 foram tratados de modo semelhante com FGF9 (10 ng /mL) durante os tempos indicados. (C) Efeito de anti-FGF9 anticorpo neutralizante em Akt e ERK induzida por fosforilação FGF9 em células de cancro gástrico. células AGS e MKN28 foram pré-tratados com anticorpo anti-FGF9 (Ab; 1 ug /ml) durante 45 minutos e depois estimuladas com FGF9 (10 ng /ml) durante 30 min
Efeito de FGF9 sobre a proliferação celular, invasão e anti. -apoptosis em células de cancro gástrico
Desde FGF9 é conhecida por ter um efeito mitogénico em alguns tipos de células [17], que primeiro testado o efeito de FGF9 sobre a cinética de crescimento de células de cancro gástrico. No entanto, não houve efeito de FGF9 na proliferação de células nas linhas de células AGS e MKN28 (Figura 3A). Figura 3 Efeito de FGF9 no crescimento e anti-apoptose de células de cancro gástrico. (A) Efeito de FGF9 sobre o crescimento de células de cancro gástrico. (B-D) Efeito de FGF9 na capacidade anti-apoptose de células de cancro gástrico. (B) os gráficos representativos de análise FACS utilizando a coloração de anexina V-FITC. As células foram tratadas com AGS FGF9 (10 ng /ml) e avaliados como descrito em Materiais e Métodos. (C) Mudanças no número de AGS apoptóticos e células MKN28 tratados com FGF9. (D) Efeito de anti-anticorpo FGF9 (Neu Ac; 1 ug /ml) em neutralizar FGF9 (10 ng /ml) induzidas por anti-apoptose em células AGS e MKN28. Todos os resultados são expressos como a média ± DP de quatro amostras. Significativamente mais baixa do que o controlo: * P
< 0,05, ** P
< 0,01. Significativamente maior do que o tratado com FGF9 grupo: # P Art < 0,05, ## P Art < 0,01
Para identificar ainda mais o possível papel da FGF9 na progressão tumoral, examinamos se FGF9 exógena confere uma. efeito anti-apoptótico em células de cancro gástrico. A análise FACS revelou que o número de células AGS V-anexina positiva foi significativamente menor no grupo tratado com FGF9 do que no grupo de controlo, e resultados semelhantes foram obtidos em células MKN28 (Figura 3B e C). Além disso, este efeito de FGF9 foi abolido por administração concomitante de anti-FGF9 anticorpo neutralizante em ambas as linhas celulares (Figura 3D).
Além disso, nós próxima examinou o efeito de FGF9 na capacidade invasiva de células de cancro gástrico. Quando as células foram estimuladas com AGS FGF9 (1-10 ng /ml), o número de células invasivas foi significativamente aumentada (Figura 4A). Do mesmo modo, a capacidade invasiva de células MKN28 foi significativamente aumentada dependentemente da dose por estimulação FGF9 (Figuras 4A). Em seguida, examinaram se este efeito pró-invasivo da FGF9 poderia ser abolida pela adição de um anticorpo neutralizante. Em ambas as linhas celulares, após a administração concomitante de anticorpo neutralizante FGF9 (1 ​​ug /ml), o número de células invasivas foi significativamente diminuída em comparação com as células tratadas com FGF9 sozinho (10 ng /mL) (Figura 4B). Além disso, nós examinamos se FGF9 induziu a expressão de MMP, os quais desempenham um papel crucial na invasão de vários cancros. Tal como mostrado na Figura 4C, a estimulação FGF9 comumente aumentou a expressão de MMP7
em ambos os AGS e células MKN28. Figura 4 Efeito da FGF9 na invasão e MMPs expressão de células de cancro gástrico. (A) Efeito de FGF9 na invasão de células de cancro gástrico. Mudança no número de AGS invasivos e células MKN28 tratados com FGF9 foram examinados. Fotografias mostrando imagens representativas de células cancerosas gástricas invasoras no controle e grupos tratados com FGF9. (B) Efeito de anti-anticorpo FGF9 (Neu Ac; 1 ug /ml) em neutralizar FGF9 (10 ng /ml) induzidas por invasão de células AGS e MKN28. (C) Efeito de FGF9 sobre a expressão de MMP
em células de cancro gástrico. Todos os resultados são expressos como a média ± DP de quatro amostras. Significativamente maior do que o controlo: * P
< 0,05, ** P
< 0,01. Significativamente inferior ao tratado com FGF9 grupo: # P Art < 0,05, ## P Art < 0,01
significado clínico-patológico de expressão FGF9 em fibroblastos associados ao câncer gástrico
Do câncer gástrico 20. amostras de tecidos examinados, dezasseis (80%) era positivo para a expressão FGF9. Em relação às características clínico-patológicas, nenhum dos parâmetros ─ idade, sexo, localização do tumor, tipo histológico, ou o estágio do tumor ─ tinha uma relação significativa com a expressão FGF9 (arquivo adicionais 2: Tabela S2)
Discussão
É acreditado. que o desenvolvimento e progressão do tumor depender de conversa cruzada entre as células cancerosas e as células do estroma envolvente. Como uma grande população estromal, fibroblastos "activadas", designado por FAC, têm sido sugeridos para promover a tumorigénese usando vários sinais moleculares, e no presente estudo foram isoladas FGF9
como um novo gene que foi sobre-expresso em cancro gástrico em FAC . O acúmulo de evidências, incluindo os nossos dados atuais, têm demonstrado que a FAC diferem de NGFs em termos de morfologia não só, mas também perfis de expressão gênica [18,19], embora os mecanismos subjacentes responsáveis ​​por essas diferenças ainda não estão claros. Com base nas evidências recentes, é tentador propor que células tumorais iniciar uma mudança de NGFs a FAC através de alguma forma de sinalização [20] ou que FAC originam de células cancerosas através da transição epitelial-mesenquimal [21,22]. Curiosamente, é amplamente aceito que a família FGF é crucial para a transição epitelial-mesenquimal, não só durante o desenvolvimento, mas também na carcinogênese [9,23]. No presente estudo, mostramos que a FAC são uma possível fonte de FGF9, e que as células cancerosas, além disso gástricas têm receptores que respondem a FGF9, sugerindo que FGF9 pode ser um potencial mediador entre CAF e células cancerosas gástricas.
Qual é o possível papel da FGF9 na patogênese do câncer gástrico? Desde FGF9 serve como mitogénio para próstata ou cancro do ovário [17,24], que primeiro investigou a proliferação de células de cancro gástrico na presença de FGF9
in vitro. Subsequentemente, FGF9 falhou para promover a proliferação de ambas as AGS e MKN28 linhas celulares de cancro gástrico; No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que FGF9 pode servir como mitógeno para outros tipos de células cancerosas gástricas porque FGF9 promove a proliferação de outras células cancerosas gástricas como AZ521 ou SGC-7901 [25,26]. Por outro lado, esclarecida no presente estudo que FGF9 tem um efeito anti-apoptótico em células de cancro gástrico, de acordo com os resultados de vários estudos anteriores [26,27]. Em apoio a esta conclusão, Akt e ERK sinalização da via, crucial para anti-apoptose, era comumente activado em ambas as linhas celulares de cancro gástrico. Além disso, induzida por FGF9 Akt e /ou fosforilação de ERK e a invasão de células resultante foi abolida pelo bloqueio FGF9 estimulação, sugerindo que FGF9, pelo menos, age como um factor anti-apoptótico.
Nós também examinado se FGF9 promove a capacidade invasiva de gástrica células cancerosas. Em estudos in vitro demonstraram que
FGF9 tratamento aumentou o número de invadir células de cancro gástrico, enquanto que este aumento da capacidade invasiva foi suprimida por adição de anticorpo neutralizante FGF9. Embora não esteja claro como FGF9 promove a invasão de células de cancro gástrico, degradação da matriz extracelular é uma parte importante do presente processo [28]. Neste contexto, admite-se que as MMPs têm um papel central em tal comportamento celular e promover a capacidade invasiva de várias malignidades [29]. Portanto, nós selecionados para MMPs que estão ligados à estimulação FGF9 e descobriu que MMP7 foi potencialmente envolvidos. Interessantemente, os estudos recentes têm enfatizado a importância de MMP7 na progressão do cancro gástrico, desde MMP7 tem potencial não apenas para degradar a matriz extracelular, mas também conferir um efeito anti-apoptótico em células cancerosas [30-32]. Em conformidade, num futuro estudo, pretende-se concentrar no eixo FGF /MMP7 no contexto da invasão de células de cancro gástrico.

Conclusão Em resumo, demonstrámos que o FAC gástricas diferem das suas NGFs correspondentes em termos de seus perfis de expressão gênica, e propor que FGF9 é uma molécula potencial que medeia cross-talk entre FAC e células cancerosas gástricas. Além disso, temos esclareceu que FGF promove o anti-apoptose e capacidade invasiva das células cancerosas gástricas. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que FGF9 é um possível mediador secretada a partir de fibroblastos associados ao câncer que promove o anti-apoptose e capacidade invasiva das células cancerosas gástricas.
Notas
Chao Sun e Hirokazu Fukui contribuíram igualmente para este trabalho.
abreviações
FGF:
fator de crescimento de fibroblastos
MMP:
Matrix metaloproteinases
ERK :
proteína quinase regulada por sinal extracelular
CAF:
de fibroblastos associados ao câncer de
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid para a Investigação científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, Japão (23591949 para MS, 25460466 a SK e 26460953 para HF). Este trabalho também foi apoiado em parte por Grant-in-Aid para os investigadores, Hyogo College of Medicine e programa apoiado pela Fundação Strategic Research em Universidades Privadas (para MS).
Os autores agradecem Noriko Kamiya (Divisão de Gastroenterologia, Departamento de Medicina interna) e Yuko Yasui (Departamento de Cirurgia) por sua assistência técnica e também apreciam Nobuyuki Adachi e Ryota Shinozaki (instalações HCM Joint-Use Research) para contribuições técnicas arquivos
adicionais
de arquivo adicionais. 1: Tabela S1 . Os primers para a análise em tempo real de RT-PCR. arquivo adicional 2: Tabela S2. Relação entre características clínicas e expressão FGF9 estromal em pacientes com câncer gástrico. interesses concorrentes
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
CS e HF concebidos e realizados todos os experimentos, analisaram dados, e escreveu o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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