FGF9 z rakovinou asociovaných fibroblastov je možné mediátorom invázie a anti-apoptózy buniek karcinómu žalúdka

FGF9 od rakovinou spojené fibroblastov je možné mediátorom invázie a anti-apoptózu rakovinových buniek žalúdka
abstraktné
pozadia
rakoviny spojené s fibroblasty (CAFS), ktoré sú umiestnené okolo nádorových buniek, sú navrhnuté pre prehranie kľúčovú úlohu v progresii nádoru. Tu sme vykonávali microarray analýzy pre porovnanie profilov génovej expresie medzi CAFS a non-rakovinové žalúdočné fibroblastov (NGFs) od pacienta s rakovinou žalúdka a zistil, že fibroblastový rastový faktor 9
(FGF9
) sa nový rastový faktor nadmerne exprimované u CAFS. Potom sme sa zaoberali biologické účinky FGF9 počas progresie karcinómu žalúdka.
Metódy
Expresia FGF9 v CAFS a NGFs, a ich sekretované produkty boli skúmané metódou Western blot. Účinky FGF9 na AGS a MKN28 buniek karcinómu žalúdka, pokiaľ ide o proliferácie, invázie a anti-apoptózu boli hodnotené pomocou testu WST-1, test komory invázie a FACS, v danom poradí. Okrem toho intracelulárnej signalizácie, ktorú FGF9 uplatňuje svoje biologické úloha bola skúmaná in vitro
.
Výsledky
FGF9 bol silne vyjadrená v CAFS v porovnaní s NGFs, že je kompatibilný s microarray dát naznačuje, že FGF9 bol román rast faktor nadmerne vystavený v CAFS. Liečba FGF9 podporoval inváziu a anti-apoptózu aktiváciou EKR a Akt signálnych dráh v AGS a MKN28 buniek, pričom tieto účinky boli zmiernený ošetrením anti-FGF9 neutralizujúce protilátky. Okrem toho, liečenie FGF9 významne zlepšené expresie matrix metaloproteinázy 7 (MMP7) v oboch bunkových líniách.
Závery
FGF9 je možné mediátor vylučovaný CAFS, ktorá podporuje anti-apoptózu a invazívne schopnosť buniek karcinómu žalúdka.
Kľúčové slová
FGF-Cancer spojené invázie fibroblastov Anti-apoptóza EKR Akt karcinóm žalúdka pozadí
tvorby rakovinových lézií je úzko spojená s ich jedinečné mikroprostredie. Progresie úzko súvisí so schopnosťou nádorových buniek na získanie a aktiváciu okolité stromálnych buniek, a následne využiť ich [1]. Rakovinu okolia stromálne bunky, ako sú fibroblasty, endoteliálne bunky a bunky imunitného systému, môže organizovať tumorigenezi a metastáz prostredníctvom interakcie bunka-bunka a /alebo produkciu rozpustných rastových faktorov /cytokínov /chemokiny [1-3]. V tejto súvislosti, fibroblasty v rakovinových lézií sú známe ako rakovina súvisiace s fibroblasty (CAFS) a dostali veľkú pozornosť, pokiaľ ide o ich úlohu v progresii nádoru [4,5]. Aj keď CAFS je známe, že sa značne líši od normálnych fibroblastov v non-neoplastických tkanivách, pokiaľ ide o ich profile génu, mechanizmus, ktorým CAFS podporu rastu nádoru je nejasný. Preto sme porovnali profily génovej expresie z CAFS, s osobitným zameraním na rastové faktory /cytokínov /chemokiny s tými non-rakovinové žalúdočných fibroblasty (NGFs) pomocou microarray testu a následne izolované rastový faktor fibroblastov 9
(FGF9
), ako nový gén, ktorý bol nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka vo CAFS.
FGF9, sekrečnú proteín z rodiny FGF, je údajne vyjadrený v stromálne bunky, vrátane fibroblastov [6-8]. Všeobecne platí, že FGF signalizácia sa vykonáva pomocou FGF receptorov (FGFR), na reguláciu rôznych bunkových biologických správanie, vrátane proliferácie, diferenciácie, prežitie a pohyblivosti [9], a expresie FGF9, FGFR2c, FGFR3b a FGFR3c bola detekovaná v žalúdku a hrubého čreva rakoviny [10]. Tak, ako iné FGF proteínov rodiny, FGF9 môže hrať kľúčovú úlohu v interakcii medzi rakovinových buniek a ich okolie stromálne bunky, a je pozoruhodné, že FGF9 je silne exprimovaný v CAFS v karcinómu žalúdka. V tejto štúdii sme skríning na rozdiely v génovej expresii medzi CAFS a NGFs od pacienta s rakovinou žalúdka. Skúmali sme účinok na FGF9 proliferácie, invázie a anti-apoptózy buniek karcinómu žalúdka, a navyše objasnil intracelulárnu signalizáciu, ktorú FGF9 uplatňuje svoje biologické účinky na buniek karcinómu žalúdka.
Metódy
Činidlá a bunková kultúra
humánne rekombinantné FGF9 a anti-humánne FGF9 neutralizačných protilátok boli kúpené od firmy R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-extracelulárnej signál-regulovaný proteín kinázy (EKR), anti-fosfo-špecifické EKR (p-EKR), anti-Akt, anti-fosfo-špecifické Akt (p-Akt, Ser473), a anti-β-Aktinová protilátky boli zakúpené od Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)
žalúdočné nádorových bunkových línií AGS bola kultivovaná v Hamově F-12 médiu (Sigma, Aurora, Ohio, USA) s 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS ,. Biowest, Nuaillé, Francúzsko) vlhké s inkubátora pri teplote 37 ° C sa v atmosfére 5% CO 2. Podobne, MKN28 bola kultivovaná v médiu RPMI 1640 s 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka, a ďalších päť žalúdočné rakovina bunkové línie MKN1, MKCH 45, MKN74, GCIY a KATOIII boli udržiavané ako bolo opísané skôr [11].
Izolácia a kultúra ľudských žalúdočných fibroblasty
ľudská rakovina žalúdka (zle diferencovaný adenokarcinóm), vzorky boli získané od pacientov, ktorí podstúpili gastrektómii v Hjógo College of Medicine Hospital v roku 2012. rakovina spojené s fibroblasty (CAFS) boli pripravené z rakovinové časti v žalúdku. Non-rakovinové žalúdočné fibroblasty (NGFs) boli pripravené z non-rakovinové časti s atrofickej gastritídy, najmenej 50 mm od nádoru v žalúdku. Tkanivové vzorky boli zbavené tuku a nekrotické tkanivo, mleté ​​s skalpely a premyté v PBS obsahujúcom antibiotikum-antimykotikum činidlo (Anti-Anti®, GIBCO). Tkanivové kusy boli prenesené do 12-jamkové mikrodoštičky (IWAKI, Tokyo, Japonsko) na jednom fragmentu /jamku. Bunky boli kultivované v DMEM médiu (Gibco, Grand Island, NY, USA) s 10% teplom inaktivovaným FBS pri 37 ° C v atmosfére 5% CO2. Fibroblasty, ktoré na začiatku rástli v monovrstvě boli zhromaždené, do iného misky a použité pre experimenty v rámci 10. priechodu. Tieto štúdie boli vykonané so súhlasom Review Board of Hyogo College of Medicine a informovaný súhlas bol získaný od pacienta.
Microarray analýzy for S TRIzolu činidlo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), celková RNA bola extrahuje z troch sád CAFS a NGFs kultivovaných. značenie cDNA, hybridizácia, skenovanie a analýza dát boli vykonané Hokkaido System Science Co., Ltd (Sapporo, Japonsko). Stručne povedané, cyaninového-3 (Cy3) značeného Crna bola pripravená z celkovej RNA (0,05 ug) s použitím nízke vstupné Quick Amp Labeling Kit (Agilent) v súlade s pokynmi výrobcu, a následným čistením na kolóne RNAeasy (QIAGEN, Valencia, CA) , Dye začlenenie a výnos Crna bola kontrolovaná pomocou Nanodrop ND-1000 spektrofotometra. Cy3 značených Crna (0,60 ug) bol roztrieštený pri teplote 60 ° C počas 30 minút v reakčnom objeme 25 ul s obsahom 1 x Agilent fragmentácie pufer a 2x Agilent blokátor v súlade s pokynmi výrobcu. Po ukončení reakcie fragmentácie, 25 ul 2x Agilent hybridizačním pufra sa pridá do zmesi a fragmentácia hybridizována Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression microarray (8x60K Verzia 2.0) počas 17 hodín pri teplote 65 ° C v rotačnej Agilent hybridizačné peci. Po hybridizácii sa mikročipy boli premyté po dobu 1 minúty pri izbovej teplote s GE premývacím pufrom 1 (Agilent) a po dobu 1 min pri 37 ° C s GE premývacím pufrom 2 (Agilent), potom ihneď suší krátkym odstreďovaním. Sklíčka boli naskenované bezprostredne po umytí na Agilent DNA Microarray Scanner (G2565CA) s použitím nastavenia pre diapozitívy pole 8x60K jedného farebného skenovania (Scan Area 61 × 21,6 mm, Rozlíšenie skenovania 3 um, Dye kanál pre Green PMT nastavená na 100%). Naskenované obrázky boli analyzované a sú normalizované s Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent).
Extrakciu RNA a reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR)
Celková RNA bola extrahovaná z bunkových línií karcinómu žalúdka za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen). Štyri mikrogram celkovej RNA bola reverzne transkribovaných s použitím oligo dT podľa (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) a 200 U Superscript ™ II reverznej transkriptázy (Invitrogen) v celkovom objeme 20 ul. Pre nasledujúce PCR páry oligonukleotidových primérov pre ľudské FGFR
boli pripravené ako bolo opísané skôr [12]. Ľudský FGFR2c
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(Vpred) a 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (Reverse); ľudský FGFR3b
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Vpred) a 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(reverzný); človek FGFR3c
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Vpred) a 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (Reverse); ľudský GAPDH
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(Vpred) a 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (Reverse). Jeden mikroliter produktu RT (cDNA) bola amplifikovaná pomocou PCR vo 50 ul reakčného objemu obsahujúce 20 pmol z vyššie uvedených sád primeru, 1,25 U of AMPL-Taq DNA polymerázy (Applied Biosystems, Foster City, CA., USA), a finálna PCR pufer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitolu a 1 mM dNTP. PCR amplifikácia bola vykonaná nasledujúcim spôsobom: pre FGFR
, pri teplote 95 ° C počas 5 min raz; 40 cyklov pri 95 ° C počas 30 s, pri 57 ° C počas 30 s a pri teplote 72 ° C počas 1 min; potom sa pri 72 ° C počas 7 minút; pre GAPDH
, pri teplote 95 ° C počas 7 minút raz; 40 cyklov pri 95 ° C počas 30 s, pri teplote 55 ° C po dobu 1 minúty a pri 72 ° C počas 30 sekúnd; potom pri teplote 72 ° C počas 7 minút.
Real-time RT-PCR
Real-time RT-PCR bola vykonaná s použitím 7900H Fast real-time PCR System (Applied Biosystems), ako bolo opísané skôr [13]. Nasledujúce sady priméry pre ľudské matrix metaloproteinázy 2
(MMP2
), MMP3
MMP7
MMP9 stroje a GAPDH
boli pripravené (Ďalší súbor 1: Tabuľka S1) , Real-time RT-PCR bola vykonaná s 200 ng RNA ekvivalentný cDNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) a 500 nmol /l gén špecifické primery. Cyklovanie PCR podmienky boli 50 ° C počas 15 sekúnd a 60 ° C počas 60 s. Intenzita fluorescenčného farbiva bola stanovená, a každá z úrovní expresie mRNA bola normalizovaná na GAPDH
expresie mRNA hladiny.
Testu proliferácie buniek
AGS (4 x 10 3) a MKN28 bunky (1 x 10 4) boli schovať v kompletnom médiu na 96-jamkové mikrotitračné doštičky. Médium sa potom nahradí jedným obsahujúcim rekombinantný FGF9 (0-10 ng /ml). WST-1 roztoku sa pridá po 72 hodinách inkubácie, a doštičky boli inkubované pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Doštičky boli analyzované za použitia čítačky doštičiek ELISA pri 450 nm s referenčnou vlnovou dĺžkou nastavenou na 600 nm.
Invázia buniek testu
invázie buniek test bol vykonaný s použitím Matrigelu BioCote invázne komory (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) podľa protokolu výrobcu. V stručnosti, AGS bunky (1 x 10 5), alebo MKN28 bunky (3 x 10 5) boli nasadené na vložke na Matrigel potiahnuté invázne komory (24 jamiek, 8-um veľkosť pórov) naplnené sérom -zdarma médium obsahujúce rôzne koncentrácie FGF9 (0-10 ng /ml). Potom boli bunky inkubované s médiom obsahujúcim 10% FBS v dolnej komore pri teplote 37 ° C v 5% CO2. K inhibíciu účinkov FGF9, bol tiež pridaný anti-FGF9 protilátky (1 ug /ml) do hornej komory. Po inkubácii po dobu 27 hodín, non-napádať bunky boli odstránené pomocou bavlneného tampónu a bunky, ktoré napadli do spodného povrchu membrány boli fixované etanolom. Invázne Bunky potom boli zafarbené hematoxylínom a spočítajú pod mikroskopom v piatich rôznych zorných polí (zväčšenie, x200).
Apoptózy testu
AGS (2 x 10 5) a MKN28 (2,5 x 10 5) bunky boli nasadené na šiestich jamkami v bežnom médiu po dobu 24 hodín. Bunky potom boli zbavené séra a spracuje s alebo bez rekombinantného FGF9 (1-10 ng /ml) po dobu 48 hodín. K inhibíciu účinkov FGF9, bol tiež pridaný anti-FGF9 protilátky (1 ug /ml) v médiu. Po spracovaní, ako plávajúce a pripojené bunky boli zozbierané, premyté PBS a zafarbené AnnexinV-FITC a propidium jodidom (PI) použitím MEBCYTO apoptózu Kit (MBL, Nagoya, Japonsko). Zafarbené bunky boli analyzované na FACSCalibur prietokovom cytometri (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), a získané dáta boli analyzované pomocou softwaru CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
Western blot analýza
západnej analýzy blot boli vykonávané ako bolo opísané skôr [14]. Stručne povedané, po liečbe s alebo bez činidla, bunky boli lyžovanie v extrakčnom pufri proteín, a extraktu proteínu (30 ug) bola frakčnom s dodecylsulfát sodným polyakrylamidovom gélu a prenesené na nitrocelulózové membránu blotting. Membrána bola inkubovaná s primárnou protilátkou, a potom sa sekundárnou protilátkou konjugovanou s peroxidázou. Proteíny boli detekované za použitia rozšírenej systému chemiluminiscencie (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Imunohistochemické
celkom 20 karcinómov žalúdka tkaniva boli získané zo vzoriek resekovaných chirurgicky Hyogo College of Medicine. Tkanivové vzorky boli fixované v 10% roztoku formaldehydu a vložené do parafínu. Táto štúdia bola schválená Review Board of Hyogo College of Medicine a informovaný súhlas bol získaný od všetkých pacientov. Charakteristiky pacientov s karcinómom žalúdka boli zobrazené na ďalší súbor 2: Tabuľka S2
Imunohistochemické farbenie pre FGF9 bola vykonaná s použitím súpravy LSAB + anti-FGF9 protilátky (1:40; R &D Systems, Minneapolis, MN, USA). ako bolo opísané skôr [15]. Nakoniec boli rezy inkubované v 3,3-diaminobenzide Tetrahydrochloride 0,05% H2O2 po dobu 3 minút, a potom kontrastne Mayerovým hematoxylínom. Pre vyhodnotenie imunoreaktivitu FGF9, aspoň päť rôznych obrazových polí sa pozorovali pri invazívnym pred rakovinou žalúdka lézií. Vzorka sa považuje za pozitívny, ak sa FGF9-pozitívny fibroblastické hniezda pozorované v zorných polí skúmaných.
Analýza štatistiky
Všetky hodnoty boli vyjadrené ako priemer ± SD. Údaje boli analyzované pomocou nepárové dvojstranný t-test
. P
hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za označujú štatistickú významnosť.
Výsledky
microarray analýzy CAFS v žalúdočnej rakovinové tkanive
sme izolovaných CAFS a NGFs (obrázok 1a) a v porovnaní profile génovej expresie z CAFS s tým NGFs s využitím mikročip testu. Desať reprezentatívne gény, ktoré boli up-regulované v CAFS sú uvedené v tabuľke 1. Z týchto génov, sme sa zamerali na FGF9 ako najviac vysoko exprimovaného génu skúmať úlohu tohto CAF produkovaného rastového faktora na buniek karcinómu žalúdka, av skutočnosti pred začatím in vitro
štúdie sme potvrdili, že CAF bunky sú produkované omnoho väčšie množstvo bielkovín ako FGF9 NGF buniek (Obrázok 1B). Navyše sme potvrdili, že FGF9 je silne exprimovaný v fibroblastov v stromálnych žalúdočné lézie rakoviny, ktorá bola izolovaná CAF (obrázok 1C). Obrázok 1 Expresia FGF9 a jeho receptorov v CAFS a buniek karcinómu žalúdka. (A) Morfológia žalúdočných CAFS a NGFs. (B) Výroba FGF9 v žalúdočných CAFS, NGFs a ich upravené médium (CM). (C) Expresia FGF9 v CAFS žalúdočnej rakoviny lézie. Šípky označujúce CAFS. (D) Expresia FGF receptorov
zodpovedný za FGF9 v žalúdočnej nádorových bunkových línií.
Tabuľka 1 zástupca génov rozdielne exprimovaných v CAFS z NGFs
prístupovej č
Symbol

názov Gene
násobnú zmenu
up-regulované
NM_014333
CADM1
bunkové adhézne molekuly 1, prepis varianty 1
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb

• Diagnostická výzva pľúcne nádorové trombotickej mikroangiopatie ako prezentácia pre karcinómom žalúdka: kazuistika a revízia literature
• Xpert MTB /RIF test môže byť použitý na archivované žalúdočnej sekrécie a indukované vzorky spúta pre citlivú diagnostiku detskej tuberkulózy