FGF9 fra cancer-associerede fibroblaster er en mulig mediator af invasion og anti-apoptose af mavekræft cells

FGF9 fra cancer-associerede fibroblaster er en mulig mediator af invasion og anti-apoptose af gastriske cancerceller
Abstrakt
Baggrund
cancerassocierede fibroblaster (cafeer), der er placeret rundt tumorceller, er foreslået for at spille en central rolle i tumorudvikling. Her har vi udført microarray analyser for at sammenligne genekspressionsprofiler mellem CAF og ikke-kræft gastriske fibroblaster (NGFs) fra en patient med mavekræft og fandt, at fibroblastvækstfaktor 9
(FGF9
) blev en hidtil ukendt vækstfaktor overudtrykt i CAF. Vi derefter undersøgt de biologiske virkninger af FGF9 under progression af mavekræft.
Metoder
Ekspression af FGF9 i CAF og NGFs og deres udskilte produkter, blev undersøgt af Western blotting. Virkningerne af FGF9 på AGS og MKN28 gastrisk kræftceller i form af spredning, invasion og anti-apoptose blev vurderet ved WST-1 assay, invasion kammer assay og FACS hhv. Endvidere blev det intracellulære signalering ved hvilken FGF9 udøver biologisk roller undersøgt in vitro
.
Resultater
FGF9 var stærkt udtrykt i CAF i sammenligning med NGFs, er forenelig med microarray data indikerer, at FGF9 var en roman vækst faktor overudtrykt i CAF. Behandling med FGF9 fremmes invasion og anti-apoptose gennem aktivering af ERK og AKT signalveje i AGS og MKN28 celler, hvorimod virkningen er svækket ved behandling med anti-FGF9 neutraliserende antistof. Desuden FGF9 behandling forbedrede ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinase 7 (MMP7) i begge cellelinier væsentligt.
Konklusioner
FGF9 er en mulig mediator udskilles af CAF der fremmer anti-apoptose og invasiv evne af gastriske cancerceller.
Nøgleord
FGF kræft-associeret fibroblast invasion Anti-apoptose ERK Akt mavekræft Baggrund
dannelsen af ​​kræft er tæt forbundet med deres unikke mikromiljø. Progression er tæt korreleret med evnen til kræftceller at rekruttere og aktivere de omgivende stromale celler, og efterfølgende udnytte dem [1]. Cancer-omsluttende stromale celler, såsom fibroblaster, endotelceller og immunceller, kan orkestrere tumorgenese og metastase gennem celle-til-celle interaktion og /eller produktion af opløselige vækstfaktorer /cytokiner /chemokiner [1-3]. I denne sammenhæng er fibroblaster i kræft kendt som cancerassocierede fibroblaster (CAF) og har fået megen opmærksomhed med hensyn til deres rolle i tumorudvikling [4,5]. Selvom CAF er kendt for at være stort set forskellige fra normale fibroblaster i ikke neoplastiske væv med hensyn til deres gen profil, den mekanisme, hvorved CAF fremmer tumorprogression er uklar. Derfor har vi sammenlignet genekspressionsprofilerne af CAF, især med fokus på vækstfaktorer /cytokiner /kemokiner, med de ikke-kræft gastrisk fibroblaster (NGFs) ved hjælp af microarray analyse og efterfølgende isoleret fibroblast vækstfaktor 9
(FGF9
) som et hidtil ukendt gen, der blev overudtrykt i CAF i gastrisk cancer.
FGF9, et sekretorisk protein af FGF-familien, er efter sigende udtrykt i stromale celler, herunder fibroblaster [6-8]. Generelt FGF signalering forekommer via FGF-receptorer (FGFR'er) for at regulere en række celle biologisk adfærd, herunder proliferation, differentiering, overlevelse og motilitet [9], og ekspression af FGF9, FGFR2c, FGFR3b og FGFR3c er blevet påvist i mave- og tarm cancere [10]. Således ligesom andre FGF-familiemedlemmer proteiner, kan FGF9 spille en central rolle i interaktionen mellem cancerceller og deres omgivende stromale celler, og det er bemærkelsesværdigt, at FGF9 stærkt udtrykkes i CAF i gastrisk cancer. I den foreliggende undersøgelse, vi screenet for forskelle i genekspression mellem CAF og NGFs fra en patient med mavekræft. Vi undersøgte effekten af ​​FGF9 på spredning, invasion og anti-apoptose af gastrisk kræftceller, og desuden præciseret den intracellulære signalering ved hvilken FGF9 udøver biologisk på mavens kræftceller.
Metoder
Reagenser og cellekultur
human rekombinant FGF9 og anti-humant FGF9 neutraliserende antistof blev indkøbt fra R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-ekstracellulært signal-reguleret protein kinase (ERK), anti-phospho-specifik ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-phospho-specifik Akt (p-Akt, Ser473), og anti-β-actin antistoffer var købt hos Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)
Den gastriske cancercellelinier AGS blev dyrket i Hams F-12-medium (Sigma, Aurora, Ohio, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS;. Biowest, Nuaille, Frankrig) i en fugtig inkubator ved 37 ° C med en atmosfære af 5% CO 2. Tilsvarende MKN28 blev dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum, og andre fem gastriske cancercellelinier MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY, og KATOIII blev opretholdt som tidligere beskrevet [11].
Isolering og dyrkning af human gastrisk fibroblaster
humane gastrisk cancer (dårligt differentieret adenocarcinom) prøver blev opnået fra en patient, som gennemgik gastrektomi på Hyogo College of Medicine Hospital i 2012. cancer-associerede fibroblaster (CAF) blev fremstillet af kræft del i maven. Ikke-kræft gastriske fibroblaster (NGFs) blev fremstillet ud fra ikke-kræft portion med atrofisk gastritis mindst 50 mm langt fra tumor i maven. Vævsprøverne blev trimmet af fedt og nekrotisk væv, hakket med skalpeller og vasket i PBS indeholdende antibiotikum-antimycotisk reagens (Anti-Anti®, GIBCO). Vævs- stykker blev overført til en 12-brønds mikroplade (Iwaki, Tokyo, Japan) i den ene fragment /brønd. Cellerne blev dyrket i DMEM-medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) med 10% varmeinaktiveret FBS ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO2. Fibroblasterne der oprindeligt voksede i et monolag blev opsamlet, overført til en anden skål og anvendes til forsøg inden den 10. passage. Disse undersøgelser blev udført med godkendelse af Review Board of Hyogo College of Medicine, og informeret samtykke blev opnået fra patienten.
Microarray analyse
Brug Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), totalt RNA var udvundet fra tre sæt CAF og NGFs dyrkede. cDNA mærkning, hybridiseringer, scanning og dataanalyse blev udført af Hokkaido System Science Co., Ltd (Sapporo, Japan). Kort fortalt cyanin-3 (Cy3) -mærket cRNA blev fremstillet af total RNA (0,05 mg) med en Low Input Quick Amp Mærkning Kit (Agilent) i overensstemmelse med producentens anvisninger, efterfulgt af RNAeasy kolonne oprensning (QIAGEN, Valencia, CA) . Dye inkorporering og cRNA udbytte blev kontrolleret med en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Cy3-mærket cRNA (0,60 ug) blev fragmenteret ved 60 ° C i 30 minutter i et reaktionsvolumen på 25 pi indeholdende 1x Agilent fragmentering buffer og 2x Agilent blokerende middel i overensstemmelse med producentens anvisninger. Ved afslutning af fragmentering reaktionen blev 25 pi 2x Agilent hybridiseringspuffer tilsat til fragmentering blandingen og hybridiseret til Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray (8x60K ver.2.0) i 17 timer ved 65 ° C i en roterende Agilent hybridisering ovn. Efter hybridisering blev microarrays vasket i 1 minut ved stuetemperatur med GE Wash Buffer 1 (Agilent) og i 1 min ved 37 ° C med GE Vaskebuffer 2 (Agilent), derefter tørret straks ved kort centrifugering. Slides blev scannet umiddelbart efter vask på en Agilent mikromatrice Scanner (G2565CA) ved hjælp af en farve scanning indstilling for 8x60K array-slides (Scan Area 61 × 21,6 mm, Scanningsopløsning 3 um, Dye kanal for Green PMT sat til 100%). De scannede billeder blev analyseret og normaliseret med Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent).
RNA-ekstraktion og revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR)
Totalt RNA blev ekstraheret fra gastriske cancercellelinier hjælp Trizol-reagens (Invitrogen). Fire mikrogram af total RNA blev revers-transkriberet ved anvendelse af oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) og 200 U Superscript ™ II revers transkriptase (Invitrogen) i et totalt volumen på 20 pi. I den efterfølgende PCR, par af oligonukleotidprimere for menneskelige FGFR'er
blev fremstillet som tidligere beskrevet [12]. Menneskelig FGFR2c
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(Forward) og 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (Reverse); menneskelig FGFR3b
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Forward) og 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(Reverse); menneskelig FGFR3c
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Forward) og 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (Reverse); menneskelig GAPDH
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(Forward) og 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (Reverse). En mikroliter af RT produkt (cDNA) blev amplificeret ved PCR i en 50-pi reaktionsvolumen indeholdende 20 pmol af de ovennævnte sæt primere, 1,25 U of Ampli-Taq-DNA-polymerase (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA), og den endelige PCR-buffer: 20 mM Tris-HCI (pH 8,4), 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 1 mM dNTP. PCR-amplifikation blev udført som følger: for FGFR'er
, ved 95 ° C i 5 min gang; 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, ved 57 ° C i 30 s, og ved 72 ° C i 1 min; derefter ved 72 ° C i 7 min; for GAPDH
, ved 95 ° C i 7 min gang; 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, ved 55 ° C i 1 min, og ved 72 ° C i 30 sek; derefter ved 72 ° C i 7 min.
Real-time RT-PCR
Real-time RT-PCR blev udført under anvendelse 7900H Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystem) som tidligere beskrevet [13]. Følgende sæt af primere til human matrixmetalloproteinase 2
(MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
, og GAPDH
blev udarbejdet (Yderligere fil 1: Tabel S1) . Real-time RT-PCR-assays blev udført med 200 ng RNA ækvivalent cDNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), og 500 nmol /l genspecifikke primere. PCR cyklusbetingelser var 50 ° C i 15 s, og 60 ° C i 60 s. Intensiteten af ​​det fluorescerende farvestof blev bestemt, og hver af mRNA-ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH
mRNA ekspressionsniveauer.
Celleproliferationsassay
AGS (4 × 10 3) og MKN28 celler (1 × 10 4) blev udsået i komplet medium i 96-brønds mikroplader. Mediet blev derefter erstattet med en, der indeholder rekombinant FGF9 (0-10 ng /ml). WST-1-opløsning blev tilsat efter 72 h inkubation, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Pladerne blev analyseret ved anvendelse af en ELISA-pladelæser ved 450 nm med reference bølgelængde indstillet til 600 nm.
Cell invasion assay
celleinvasion assay blev udført under anvendelse BioCoat Matrigel invasion kamre (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt, AGS celler (1 x 10 5) eller MKN28 celler (3 x 10 5) blev podet i insertet af Matrigel-coatede invasion kammer (24 brønde, 8 um porestørrelse) fyldt med serum -fri medium indeholdende forskellige koncentrationer af FGF9 (0-10 ng /ml). Derefter blev cellerne inkuberet med medium indeholdende 10% FBS i det nedre kammer ved 37 ° C i 5% CO2. Til hæmning af virkningerne af FGF9 blev anti-FGF9-antistof (1 pg /ml) også tilsat til det øvre kammer. Efter inkubation i 27 timer blev ikke-invaderende celler fjernes med en vatpind, og cellerne, som havde invaderet ind i den nedre overflade af membranen blev fikseret med ethanol. De invaderende celler blev derefter farvet med hæmatoxylin og talt under anvendelse af et mikroskop i fem forskellige visuelle felter (forstørrelse, x200).
Apoptose assay
AGS (2 × 10 5) og MKN28 (2,5 × 10 5) celler blev podet i seks-brønds plader i rutinemæssige medium i 24 timer. Cellerne blev derefter frataget serum og behandlet med eller uden rekombinant FGF9 (1-10 ng /ml) i 48 timer. Til hæmning af virkningerne af FGF9 blev anti-FGF9-antistof (1 pg /ml) også tilsat til dyrkningsmediet. Efter behandling blev både flydende og vedhæftede celler høstet, vasket med PBS og farvet med AnnexinV-FITC og propidiumiodid (PI) med en MEBCYTO Apoptosis Kit (MBL, Nagoya, Japan). Farvede celler blev analyseret på en FACScalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), og de opnåede data blev analyseret ved hjælp af CellQuest software (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
Western blot-analyse
Western blot analyser blev udført som tidligere [14] beskrevne. Kort fortalt, efter behandling med eller uden reagens blev celler lyseret i protein ekstraktionsbuffer, og proteinekstrakt (30 ug) blev fraktioneret ved natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese og overført til en nitrocellulose-blotting-membran. Membranen blev inkuberet med et primært antistof og derefter med et peroxidase-konjugeret sekundært antistof. Proteiner blev påvist ved anvendelse af et forøget kemiluminescens (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).
Immunhistokemi
alt 20 gastriske kræftformer væv blev opnået fra prøver operativt fjernede kirurgisk ved Hyogo College of Medicine. Vævsprøven blev fikseret i 10% formalinopløsning og indlejret i paraffin. Denne undersøgelse blev godkendt af Klagenævnet for Hyogo College of Medicine, og informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. De karakteristiske træk ved gastrisk kræftpatienter blev viste i supplerende fil 2: Tabel S2
immunhistokemisk farvning for FGF9 blev udført med en LSAB + kit hjælp af anti-FGF9 antistof (1:40; R &D Systems, Minneapolis, MN, USA). som tidligere beskrevet [15]. Endelig blev sektionerne inkuberet i 3,3'-diaminobenzide tetrahydrochlorid med 0,05% H2O2 i 3 min, og derefter modfarvet med Mayers hæmatoxylin. At evaluere immunoreaktiviteten af ​​FGF9 blev mindst fem forskellige synsfelter observeret ved den invasive foran mavekræft læsioner. En prøve blev betragtet som positive, da blev observeret FGF9-positive fibroblastiske reder i de visuelle områder undersøgt.
Statistik analyse
Alle værdier blev udtrykt som middelværdi ± SD. Data blev analyseret under anvendelse af uparret to-halet t-test
. P
værdier på mindre end 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.
Resultater
Microarray analyser af CAF i gastrisk kræft væv
Vi isolerede CAF og NGFs (figur 1A) og sammenlignede genekspression profil CAF med den for NGFs ved hjælp microarray assay. Ti repræsentative gener, der blev opreguleret i CAF er anført i tabel 1. Blandt disse gener, vi målrettet FGF9 som den mest højt udtrykt gen for at undersøge den rolle, som denne CAF-produceret vækstfaktor på gastriske cancerceller, og faktisk før start in vitro Salg undersøgelser bekræftede vi, at CAF-celler producerede meget større mængde FGF9 protein end NGF celler (Figur 1B). Desuden har vi bekræftet, at FGF9 er stærkt udtrykt i fibroblaster i stroma af gastrisk cancer læsion hvorfra CAF blev isoleret (figur 1C). Figur 1 Ekspression af FGF9 og dets receptorer i CAF og gastriske cancerceller. (A) Morfologi af gastrisk CAF og NGFs. (B) Produktion af FGF9 i gastrisk CAF, NGFs og deres konditioneret medium (CM). (C) Ekspression af FGF9 i CAF af mavekræft læsion. Pile angiver CAF. (D) Angivelse af FGF-receptorer
ansvarlig for FGF9 i gastrisk cancer cellelinjer.
Tabel 1 Repræsentative gener udtrykkes forskelligt i CAF fra NGFs
tiltrædelse No.
Symbol

Gene navn
Fold forandring
opreguleret
NM_014333
CADM1
celleadhæsionsmolekyle 1, afskrift variant 1
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb | is39c09.y1 HR85 holm Homo sapiens cDNA klon IMAGE: 6.554.705 5 ', mRNA sekvens
254,8
NM_001113207
TSTD1
Thiosulfate sulfurtransferase (rhodanese) -lignende domæne, der indeholder en, udskrift variant 1
237,5
NM_000867
HTR2B
5-hydroxytryptamin (serotonin) receptor 2B
171,5
NM_001008539
SLC7A2
opløst stof luftfartsselskab familie 7 (kationiske aminosyre transporteren, y + systemet), medlem 2, afskrift variant 2
142,5
NM_002010
FGF9
fibroblast vækstfaktor 9 (glia-aktiverende faktor)
141,1
NM_005559
LAMA1
Laminin, alfa 1
119,0
NM_001040058
SPP1
udskilt phosphoprotein 1, udskrift variant 1
116.1
A_24_P247454
A_24_P247454
Unknown
112.6
NM_014398
LAMP3
Lysosomal-associated membranprotein 3
111,3
nedreguleret
NM_001141919
XG
Xg blodtype (XG), afskrift variant 2,
0,0035
NM_175569
XG
Xg blodtype (XG), afskrift variant 1
0,0044
NM_000609
CXCL12
chemokin (CXC motiv) ligand 12 (CXCL12), afskrift variant 2
0,0071
NM_014817
TRIL
TLR4 interactor med leucin-rige gentagelser
0,0099
NM_002839
PTPRD
proteintyrosinphosphatase, receptor type D, udskrift variant 1
0,0138
NR_021485
EGFEM1P
EGF-lignende og EMI domæne, der indeholder en, pseudogen, ikke-kodende RNA
0,0141
NM_198285
WDR86
WD gentag domæne 86
0,0145
NM_001164000
Mecom
mds1 og EVI1 kompleks locus (Mecom), afskrift variant 6
0,0166
NM_004335
BST2
knoglemarv stromale celle antigen 2
0,0168
ENST00000484765
XLOC_002912
Hypotetisk LOC100507661 (LOC100507661), miscRNA
0,0172
Fold ændre værdier blev vurderet i forhold til normaliserede CAF /normaliserede NGFs.
Ekspression af FGFR2c
og FGFR3b /c
i gastrisk cancer cellelinjer
FGF9 er blevet rapporteret at vise høj affinitet til FGFR2c isoformen og FGFR3b /c isoformer [12]. Derfor undersøgte vi ekspressionen af ​​disse FGFR'er
i forskellige gastrisk cancer linjer ved hjælp af RT-PCR. Som vist i figur 1 D, blev ekspression af FGFR2c
detekteret i alle syv gastriske cancercellelinier, hvorimod ekspression af FGFR3b /c
blev påvist i seks af de syv, med undtagelse af MKN74. Disse resultater antydede, at gastrisk kræftceller har kapacitet til at reagere på FGF9 stimulation.
FGF9 aktiverer ERK og AKT signalveje i gastriske kræftceller
Vi undersøgte effekten af ​​FGF9 stimulation på mulige veje, herunder ERK og Akt i gastrisk cancercellelinier [16]. Ekspression af både p-Akt og p-ERK blev dosisafhængigt forøget ved FGF9 stimulering i AGS og MKN28 celler (figur 2A). Forøgelsen var tydeligt fra 15 min efter FGF9 (10 ng /ml) behandling i begge cellelinier (figur 2B). Endvidere undersøgte vi virkningen af ​​anti-FGF9 neutraliserende antistof på gastriske cancerceller og fandt, at forøget ekspression af p-Akt og p-ERK fremkaldt af FGF9 stimulering blev svækket ved samtidig administration af anti-FGF9 neutraliserende antistof (figur 2C). Figur 2 Virkning af FGF9 behandling på intracellulær signalering i gastriske cancerceller. (A) Phosphorylering af Akt og ERK i gastrisk cancer celler behandlet med FGF9. AGS (4 × 105) og MKN28 (4 × 105) blev dyrket i seks-brønds plader og behandlet med forskellige koncentrationer af FGF9 i 30 minutter. Ekstraheret protein blev analyseret ved Western blotting, som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) Tidsforløb ændring i Akt og ERK fosforylering i mavekræft celler behandlet med FGF9. AGS og MKN28 celler blev behandlet på lignende måde med FGF9 (10 ng /ml) i de angivne tidsrum. (C) Virkning af anti-FGF9 neutraliserende antistof på FGF9-induceret Akt og ERK-phosphorylering i gastriske cancerceller. AGS og MKN28 celler blev forbehandlet med anti-FGF9-antistof (Ab; 1 pg /ml) i 45 minutter og derefter stimuleret med FGF9 (10 ng /ml) i 30 min
Virkning af FGF9 på celleproliferation, invasion og anti. -apoptosis i gastriske cancerceller
Da FGF9 vides at have en mitogen virkning på visse celletyper [17], vi først afprøvet virkningen af ​​FGF9 på vækstkinetikken af ​​gastriske cancerceller. Vi fandt imidlertid ingen effekt af FGF9 på celleproliferation i AGS og MKN28 cellelinier (figur 3A). Figur 3 Virkning af FGF9 på vækst og anti-apoptose af gastriske cancerceller. (A) Effekt af FGF9 på vækst af gastriske kræftceller. (B-D) Effekt af FGF9 på anti-apoptose evne af gastriske cancerceller. (B) Repræsentative grafer af FACS-analyse under anvendelse Annexin V-FITC-farvning. AGS-celler blev behandlet med FGF9 (10 ng /ml) og evalueret som beskrevet i Materialer og Metoder. (C) Ændringer i antallet af apoptotiske AGS og MKN28 celler behandlet med FGF9. (D) Virkning af anti-FGF9 neutraliserende antistof (Neu Ab; 1 pg /ml) på FGF9 (10 ng /ml) -inducerede anti-apoptose i AGS og MKN28 celler. Alle resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SD af fire prøver. Betydeligt lavere end kontrol: * P
< 0,05, ** P
< 0,01. Betydeligt større end FGF9-behandlede gruppe: # P
< 0,05, ## P
< 0,01
For yderligere at identificere den mulige rolle af FGF9 i tumor progression, vi undersøgt, om eksogen FGF9 giver en. anti-apoptotisk virkning på gastriske cancerceller. FACS-analyser viste, at antallet af annexin V-positive AGS celler var signifikant mindre i FGF9-behandlede gruppe end i kontrolgruppen, og lignende resultater blev opnået i MKN28 celler (figur 3B og C). Endvidere blev denne virkning af FGF9 ophæves ved samtidig administration af anti-FGF9 neutraliserende antistof i begge cellelinier (figur 3D).
Desuden har vi næste undersøgte virkningen af ​​FGF9 på den invasive evne gastriske cancerceller. Når AGS-celler blev stimuleret med FGF9 (1-10 ng /ml), blev antallet af invasive celler signifikant forøget (figur 4A). Tilsvarende blev den invasive evne MKN28 celler forbedret betydeligt dosisafhængigt ved FGF9 stimulation (figur 4A). Vi undersøgte derefter, om dette pro-invasiv effekt af FGF9 kunne afskaffes ved at tilføje en neutraliserende antistof. I begge cellelinier, efter samtidig administration af FGF9 neutraliserende antistof (1 pg /ml), antallet af invasive celler blev signifikant reduceret i sammenligning med celler behandlet med FGF9 alene (10 ng /ml) (figur 4B). Desuden har vi undersøgt, om FGF9 inducerede ekspressionen af ​​MMP'er, som spiller en central rolle i invasionen af ​​forskellige kræftformer. Som vist i figur 4C, FGF9 stimulation almindeligvis forøget ekspression af MMP7
i begge AGS og MKN28 celler. Figur 4 Virkning af FGF9 på invasion og MMP'er ekspression af gastriske cancerceller. (A) Effekt af FGF9 på gastrisk cancercelleinvasion. Ændring i antallet af invasive AGS og MKN28 celler behandlet med FGF9 blev undersøgt. Fotografier, der viser repræsentative billeder af invasive gastriske cancerceller i kontrol- og FGF9-behandlede grupper. (B) Virkning af anti-FGF9 neutraliserende antistof (Neu Ab; 1 pg /ml) på FGF9 (10 ng /ml) -induceret invasion af AGS og MKN28 celler. (C) Effekt af FGF9 på ekspressionen af ​​MMP'er
i gastriske kræftceller. Alle resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SD af fire prøver. Betydeligt større end kontrol: * P
< 0,05, ** P
< 0,01. Betydeligt lavere end FGF9-behandlede gruppe: # P
< 0,05, ## P
< 0,01
klinisk-patologisk betydning af FGF9 udtryk i mavekræft-associerede fibroblaster
Af de 20 mavekræft. vævsprøver undersøges, seksten (80%) var positive for FGF9 ekspression. Med hensyn til de klinisk-patologiske træk, ingen af ​​parametrene ─ alder, køn, tumor placering, histologisk typen, eller tumor stadie ─ havde en signifikant sammenhæng til FGF9 udtryk (Yderligere fil 2: Tabel S2)
Diskussion
Det menes. at tumor udvikling og progression afhænger af krydstale mellem kræftceller og deres omgivende stromale celler. Som en stor stromal population, "aktiveret" fibroblaster, benævnt CAF, er blevet foreslået at fremme tumorigenese ved anvendelse af forskellige molekylære signaler, og i den foreliggende undersøgelse vi isoleret FGF9
som et hidtil ukendt gen, der blev overudtrykt i CAF i gastrisk cancer . Akkumulerende beviser, herunder vores nuværende data, har vist, at CAF adskiller sig fra NGFs i form af ikke blot morfologi men også genekspressionsprofiler [18,19], selv om de underliggende mekanismer, der er ansvarlige for disse forskelle er stadig uklart. På baggrund af de seneste beviser, er det fristende at foreslå, at tumor celler initiere et skift fra NGFs til CAF gennem en form for signalering [20], eller at CAF stammer fra kræftceller gennem epitelial-mesenkymale overgang [21,22]. Interessant er det almindeligt accepteret, at FGF familien er afgørende for epitelial-mesenkymale overgang, ikke kun under udvikling, men også i carcinogenese [9,23]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at CAF er en mulig kilde til FGF9, og at det endvidere gastriske cancerceller har receptorer, som reagerer på FGF9, hvilket antyder, at FGF9 kan være en potentiel mediator mellem CAF og gastriske cancerceller.
Hvad er mulige rolle FGF9 i patogenesen af ​​mavekræft? Da FGF9 tjener som mitogen for prostata- eller ovariecancer [17,24], vi først undersøgte udbredelsen af ​​gastriske cancerceller i nærvær af FGF9 in vitro
. Efterfølgende FGF9 undladt at fremme proliferation af både AGS og MKN28 gastriske cancercellelinier; men vi kan ikke udelukke, at FGF9 kan tjene som mitogen for andre typer af gastrisk kræftceller, fordi FGF9 fremmer udbredelsen af ​​andre mavekræft celler såsom AZ521 eller SGC-7901 [25,26]. På den anden side, vi præciseret i nærværende undersøgelse, at FGF9 har en anti-apoptotisk effekt på mavens kræftceller, i overensstemmelse med resultaterne af en række tidligere undersøgelser [26,27]. Til støtte for denne konklusion, Akt og ERK vej signalering, afgørende for anti-apoptose, var almindeligt aktiveret i begge gastrisk cancer cellelinjer. Endvidere blev FGF9-induceret Akt og /eller ERK phosphorylering og den resulterende celleinvasion afskaffet ved blokering FGF9 stimulering, hvilket antyder, at FGF9 mindst virker som en anti-apoptotisk faktor.
Vi undersøgte også, om FGF9 fremmer den invasive evne gastrisk cancerceller. In vitro
undersøgelser viste, at FGF9 behandling øget antallet af invaderende gastriske kræftceller, mens denne øgede invasiv evne blev undertrykt ved tilsætning af FGF9 neutraliserende antistof. Selv om det er uklart, hvordan FGF9 fremmer invasion af gastriske cancerceller, nedbrydning af den ekstracellulære matrix er en vigtig del af denne proces [28]. I denne forbindelse er det accepteret, at MMP'er spille en central rolle i en sådan celle adfærd og på den invasive kapacitet af forskellige maligniteter [29]. Derfor har vi screenet for MMP'er der er knyttet til FGF9 stimulering og fundet, at MMP7 potentielt var involveret. Interessant nok har nylige undersøgelser understregede vigtigheden af ​​MMP7 i gastrisk cancer progression, da MMP7 har potentiale til ikke kun at nedbryde den extracellulære matrix, men også give en anti-apoptotisk virkning på cancerceller [30-32]. I overensstemmelse hermed i en kommende undersøgelse, vi har til hensigt at fokusere på FGF /MMP7 akse i forbindelse med mavekræft celleinvasion.
Konklusion
Sammenfattende har vi vist, at gastrisk CAF adskiller sig fra deres tilsvarende NGFs i form af deres genekspressionsprofiler, og foreslå, at FGF9 er en potentiel molekyle, der medierer krydstale mellem CAF og gastriske cancerceller. Desuden har vi præciseret, at FGF fremmer anti-apoptose og invasiv evne af gastriske cancerceller. Tilsammen vore data antyder, at FGF9 er en mulig mediator secerneres fra cancerassocierede fibroblaster, der fremmer anti-apoptose og invasiv evne af gastriske cancerceller.
Noter Salg Chao Sun og Hirokazu Fukui bidraget lige til dette arbejde.
Forkortelser
FGF:
fibroblast vækstfaktor
MMP:
Matrix metalloproteinase
ERK :
Ekstracellulær signal-reguleret protein kinase
CAF:
Kræft-associeret fibroblast
erklæringer
Tak
Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud-in-støtte til videnskabelig forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan (23591949 til MS, 25460466 til SK og 26460953 til HF). Dette arbejde blev også delvist understøttet af Grant-in-Aid for forskere, Hyogo College of Medicine og støttet program for Strategic Research Foundation på private universiteter (til MS).
Forfatterne takker Noriko Kamiya (Division of Gastroenterology, Institut for Intern Medicin) og Yuko Yasui (Institut for Kirurgi) for deres tekniske bistand og også sætte pris Nobuyuki Adachi og Ryota Shinozaki (HCM Joint-Brug Forskningsfaciliteter) for tekniske bidrag
Ekstra filer
Yderligere fil 1:. tabel S1 . Primere til real-time RT-PCR-analyse. Yderligere fil 2: Tabel S2. Relationer mellem klinisk-patologiske træk og stromal FGF9 ekspression i patienter med gastrisk cancer. Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Forfattere bidrag
CS og HF designet og udførte alle eksperimenterne, analyserede data, og skrev manuskriptet. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Den diagnostiske udfordring af pulmonal tumor trombotisk mikroangiopati som en præsentation for metastatisk mavekræft: en case-rapport og gennemgang af litteraturen
• Xpert MTB /RIF assay kan bruges på arkiveret gastrisk aspirat og induceret spytprøver til følsom diagnose af pædiatrisk tuberkulose