FGF9 от рака ассоциированных фибробластов является возможным медиатором вторжения и антиапоптоз желудочного рака cells

FGF9 от рака ассоциированных фибробластов является возможным медиатором вторжения и анти-апоптоза клеток рака желудка
Аннотация
фона <бр> Рак-ассоциированный фибробласты (CAFS), которые находятся вокруг опухолевых клеток, предлагается играть ключевую роль в опухолевой прогрессии. Здесь мы провели анализ микрочипов для сравнения профилей экспрессии генов между CAFS и незлокачественных желудка фибробластов (NGFs) от пациента с раком желудка и обнаружили, что фактор роста фибробластов 9
(FGF9
) был новый фактор роста суперэкспрессированный в CAFS. Затем мы исследовали биологические эффекты FGF9 во время прогрессирования рака желудка.
Методов
Выражение FGF9 в CAFS и NGFs, и их секретируемых продуктов, были исследованы с помощью вестерн-блоттинга. Эффекты FGF9 на АГС и MKN28 рака желудка клеток с точки зрения распространения, инвазии и антиапоптоз оценивали с помощью WST-1 анализа, анализа камеры вторжения и FACS, соответственно. была сильно выражена Кроме того, внутриклеточная сигнализация, с помощью которого FGF9 осуществляет свою биологическую роль был осмотрен в пробирке
.

Результаты FGF9 в CAFS по сравнению с NGFs, быть совместимым с указанием микрочипов данных, FGF9 был роман роста фактор избыточно экспрессируется в CAFS. Лечение с FGF9 способствовало нашествие и антиапоптоз через активацию сигнальных путей ERK и Akt в AGS и MKN28 клеток, в то время как эти эффекты были ослаблены путем обработки анти-FGF9 нейтрализующих антител. Кроме того, лечение FGF9 значительно усиливал экспрессию матриксных металлопротеиназ 7 (MMP7) в обеих клеточных линиях.
Выводы
FGF9 является возможным медиатором секретируется CAFS что способствует антиапоптоз и инвазивные способности клеток рака желудка.
Ключевые слова,
FGF Рак-ассоциированный фибробласты Invasion антиапоптоз ЭРК Akt Желудочный фон рак
образование раковых поражений тесно связана с их уникальной микросреды. Прогрессирование тесно коррелирует со способностью раковых клеток набирать и активировать окружающие стромальных клеток, а затем использовать их [1]. Раковые окружающие стромальные клетки, такие как фибробласты, эндотелиальные клетки и клетки иммунной системы, могут организовать туморогенез и метастазирование через клетки к клетке взаимодействия и /или производство растворимых факторов роста /цитокины /хемокины [1-3]. В этом контексте, фибробласты в раковых поражений известны как рак связаны фибробластов (CAFS) и получили большое внимание с точки зрения их роли в опухолевой прогрессии [4,5]. Хотя CAFS, как известно, в значительной степени отличается от нормальных фибробластов в неопухолевых тканях с точки зрения их профиля генов, механизм, с помощью которого CAFS способствовать прогрессии опухоли неясна. Таким образом, мы сравнили профили экспрессии генов CAFS, обращая особое внимание на факторы роста /цитокинов /хемокинов, с теми незлокачественных желудка фибробластов (NGFs) с использованием микрочипов анализа, а затем выделяют фактор роста фибробластов 9
(FGF9 <бр>) как новый ген, который был сверхэкспрессируется в CAFS при раке желудка.
FGF9, секреторного белка семейства FGF, как сообщается, выражается в стромальных клеток, включая фибробласты [6-8]. В общем, передача сигналов FGF происходит через FGF рецепторы (FGFRs), чтобы регулировать различные биологическое поведение клеток, в том числе пролиферации, дифференцировки, выживания и моторики [9], и выражение FGF9, FGFR2c, FGFR3b и FGFR3c был обнаружен в желудка и толстой кишки раковые заболевания [10]. Таким образом, как и другие белки семейства FGF, FGF9 может играть ключевую роль во взаимодействии между раковыми клетками и окружающими их клетками стромы, и следует отметить, что FGF9 сильно выражен в CAFS при раке желудка. В настоящем исследовании мы провели скрининг различий в экспрессии генов между CAFS и NGFs от пациента с раком желудка. Мы исследовали влияние FGF9 на пролиферацию, инвазию и анти-апоптоза клеток рака желудка, и, кроме того, выясненных внутриклеточной сигнализации, с помощью которого FGF9 оказывает свое биологическое действие на раковые клетки желудка.
Методов
Реагенты и культуры клеток <бр> Человеческий рекомбинантный FGF9 и анти-человеческое антитело FGF9 нейтрализующий были приобретены у R &усилителя; D Systems (Миннеаполис, Миннесота, США). Анти-внеклеточной регулируемой киназы белка (ЭРК), анти-фосфо-специфические ЭРК (п-ЭРК), анти-Akt, анти-фосфо-специфические Akt (п-Akt; Ser473), и анти-β-актин антитела приобретен у Cell Signaling Technology (Беверли, штат Массачусетс, США)
желудочные линий раковых клеток AGS культивировали в Ham F-12 среды (Sigma, Аврора, штат Огайо, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS;. Biowest, Nuaillé, Франция) в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C с атмосфере 5% CO <суб> 2. Точно так же, MKN28 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, и другие пять желудочные клеточные линии рака предстательной MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY и KATOIII поддерживались как описано ранее [11].
Выделение и культивирование желудочные фибробласты человека
человека рак желудка (слабо дифференцированной аденокарциномы) образцы были получены у пациента, перенесших гастрэктомию в Хёго колледже больницы медицины в 2012 году раковые ассоциированных фибробласты (CAFS) получали из раковой части в желудке. Незлокачественный желудочные фибробласты (NGFs) получали из нераковая части с атрофическим гастритом, по меньшей мере 50 мм далеко от опухоли в желудке. Образцы тканей были обрезаны жира и омертвевшей ткани, измельчали ​​скальпелей и промывали в PBS, содержащий антибиотик-противогрибковое реагент (Anti-Anti®, GIBCO). Куски ткани переносили в 12-луночный микропланшет (Иваки Токио, Япония) на одном фрагменте /лунку. Клетки культивировали в среде DMEM (Gibco, Grand Island, NY, США) с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS при 37 ° С в атмосфере 5% СО2. Фибробласты, которые первоначально выросшие в монослое были собраны, переведены на другую тарелку, и использовали для экспериментов в 10-м проходе. Эти исследования были проведены с одобрения Совета по рассмотрению действия Хёго колледжа медицины и информированное согласие было получено от пациента.
Анализ Microarray
Использование реагента тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), общая РНК извлеченный из трех наборов CAFS и NGFs культивируемых. маркировки кДНК, гибридизация, сканирование и анализ данных были выполнены Хоккайдо System Science Co., Ltd (Саппоро, Япония). В кратком изложении, цианин-3 (Су3) меченным кРНК получали из тотальной РНК, (0,05 мкг) с использованием низкого входного Быстрый Ампер Этикетировочное Kit (Agilent) в соответствии с инструкциями производителя, с последующей очисткой на колонке с RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA), , Краситель включение и выход кРНК были проверены с NanoDrop ND-1000 спектрофотометр. Су3-меченых кРНК (0,60 мкг) была раздроблена при 60 ° С в течение 30 мин в объеме реакционной смеси 25 мкл, содержащих 1x Agilent фрагментации буфера и 2x компании Agilent блокирующий агент в соответствии с инструкциями изготовителя. По завершении реакции фрагментации, 25 мкл 2x буфера гибридизации Agilent был добавлен к раздроблению смеси и гибридизовали с Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray (8x60K Ver.2.0) в течение 17 ч при 65 ° С во вращающейся печи компании Agilent гибридизацией. После гибридизации микрочипов промывали в течение 1 мин при комнатной температуре с GE промывочного буфера 1 (Agilent) и в течение 1 мин при 37 ° С с GE промывочным буфером 2 (Agilent), а затем сушат немедленно быстрым центрифугированием. Слайды были отсканированы сразу после мытья на ДНК в компании Agilent микрочипов Сканер (G2565CA), используя одну установку для слайдов массива 8x60K цветное сканирование (Scan Area 61 × 21,6 мм, разрешение сканирования 3 мкм, Dye канал для Green ФЭУ установлен на 100%). Отсканированные изображения были проанализированы и нормализуют Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent).
Выделения РНК и обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
Суммарную РНК экстрагировали из линии клеток рака желудка с использованием реагента тризола (Invitrogen). Четыре микрограмм тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с использованием олиго-дТ (Applied Biosystems, Бранчбург, NJ, США) и 200 ед верхний индекс ™ II с использованием обратной транскриптазы (Invitrogen) в общем объеме 20 мкл. Для следующего ПЦР, пары олигонуклеотидных праймеров для человека FGFRs
были получены, как описано ранее [12]. Человек FGFR2c
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(вперед) и 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (обратный); человек FGFR3b
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(вперед) и 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(обратный); человек FGFR3c
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(вперед) и 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (обратный); человек GAPDH
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(вперед) и 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (обратный). Один микролитр продукта RT (кДНК) амплифицировали с помощью ПЦР в 50-мкл реакционного объема, содержащего 20 пмоль выше наборов праймеров, 1,25 ед Ampli-Taq ДНК-полимеразы (Applied Biosystems, Foster City, CA., США), и конечный ПЦР-буфер: 20 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 50 мМ КСl, 2,5 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ дНТФ. ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: для FGFRs
, при 95 ° С в течение 5 мин один раз; 40 циклов при 95 ° С в течение 30 с, при 57 ° C в течение 30 сек и при 72 ° С в течение 1 мин; затем при 72 ° С в течение 7 мин; для GAPDH
, при 95 ° С в течение 7 мин один раз; 40 циклов при 95 ° С в течение 30 с, при 55 ° С в течение 1 мин и при 72 ° С в течение 30 сек; затем при 72 ° С в течение 7 мин.
в режиме реального времени RT-PCR
Результаты в режиме реального времени RT-ПЦР проводили с использованием 7900H Система быстрой ПЦР в реальном времени (фирмы Applied Biosystems), как описано ранее [13]. Следующие наборы праймеров для человеческой матрицы металлопротеиназы 2
(MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
и GAPDH
были подготовлены (Дополнительный файл 1: Таблица S1) , В режиме реального времени ОТ-ПЦР-анализ проводили с 200 нг РНК эквивалентной кДНК, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), и 500 нмоль /л гена специфических праймеров. Условия ПЦР были езда на велосипеде 50 ° C в течение 15 с, и 60 ° С в течение 60 сек. Интенсивность флуоресцентного красителя определяли, и каждый из уровней экспрессии мРНК нормализовали к GAPDH
уровней экспрессии мРНК.
Анализа клеточной пролиферации
AGS (4 × 10 3) и клетки MKN28 (1 × 10 4) были высеяны в полной среде в 96-луночных микропланшетов. Среду затем заменен одним, содержащим рекомбинантный FGF9 (0-10 нг /мл). WST-1 раствор добавляли после 72 ч инкубации, и планшеты инкубировали при 37 ° С в течение 1 ч. Планшеты анализировали с помощью ELISA-ридер пластины при 450 нм с помощью эталонной длины волны, установленной при 600 нм.
Инвазии клеток анализ
инвазии клеток анализ проводили с использованием Biocoat Матригель вторжения камеры (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) в соответствии с протоколом производителя. В кратком изложении, AGS клетки (1 × 10 5) или клетки MKN28 (3 × 10 5) были высеяны в вставки Матригель покрытием вторжения камеры (24 скважин, 8 мкм размер пор), заполненных сыворотки -бесплатно средой, содержащей различные концентрации FGF9 (0-10 нг /мл). Затем клетки инкубировали с средой, содержащей 10% FBS в нижней камере при 37 ° С в 5% СО2. Для того, чтобы ингибировать эффекты FGF9, анти-FGF9 антителом (1 мкг /мл) также добавляли в верхнюю камеру. После инкубации в течение 27 ч, не-вторжения в клетки удаляют с помощью ватного тампона, и клетки, которые захватившие в нижнюю поверхность мембраны фиксировали этанолом. Захватчики клетки затем окрашивали гематоксилином и подсчитывают с помощью микроскопа в пяти различных полей зрения (увеличение, x200).
Апоптоз анализа
AGS (2 × 10 5) и MKN28 (2,5 × 10 5) клетки высевали в шесть-луночных планшетах в обычной среде в течение 24 ч. Затем клетки лишены сыворотки и обрабатывают с добавлением или без рекомбинантного FGF9 (1-10 нг /мл) в течение 48 часов. Для того, чтобы ингибировать эффекты FGF9, анти-FGF9 антителом (1 мкг /мл) также добавляли к культуральной среде. После обработки, как плавающие и прикрепленные клетки собирали, промывали PBS и окрашивали AnnexinV-FITC и пропидийиодидом (PI) с использованием набора MEBCYTO апоптозом (MBL, Nagoya, Japan). Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), а также данные, полученные анализировали с использованием программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA, США).
Вестерн-блот-анализ
Western блот анализ проводили, как описано ранее [14]. Если коротко, то после обработки с использованием или без реагента, клетки лизируют в буфере для экстракции белка и белкового экстракта (30 мкг) фракционировали с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном сульфат натрия додецилсульфата и переносили на нитроцеллюлозные мембраны блоттинга. Мембрану инкубировали с первичным антителом, а затем с пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами. Белки были обнаружены с помощью усовершенствованной системы хемилюминесценции (Amersham Biosciences, Бакингемшир, Великобритания).
Immunohistochemistry
в общей сложности 20 рака желудка тканей были получены из образцов резецированных хирургическим путем в Хёго медицинском колледже. Образец ткани фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. Данное исследование было одобрено Советом по рассмотрению Хёго колледжа медицины и информированное согласие было получено от всех пациентов. Характеристики больных раком желудка были показаны в дополнительном файле 2: Таблица S2 изображения иммуногистохимического окрашивания для FGF9 проводили с LSAB + комплект с использованием анти-FGF9 антитела (1:40; R &Amp; D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота, США). как было описано ранее [15]. И, наконец, срезы инкубировали в 3,3'-diaminobenzide тетрагидрохлорид с 0,05% H2O2 в течение 3 мин, а затем контрастно гематоксилином Майера. Для оценки иммунореактивности FGF9, наблюдались по крайней мере, пять различных полей зрения при инвазивной перед желудочных поражений раком. Образец считается положительным, когда FGF9-положительных фибробластические гнездах наблюдались в полях зрения рассмотренных.
Анализ статистики
Все значения были выражены как среднее ± стандартное отклонение. Данные были проанализированы с помощью непарного Стьюдента
-test. P
значения менее 0,05 считались указать статистическую значимость.
Результаты
Microarray анализ CAFS в желудочном раковых тканей
Мы изолировали CAFS и NGFs (рис 1А) и сравнили профиль экспрессии генов CAFS с тем, что из NGFs с использованием микрочипов анализа. Десять представительные гены, которые были активируемых в CAFS, перечислены в таблице 1. Среди этих генов мы ориентировались FGF9 как наиболее высокий уровень экспрессии гена, чтобы исследовать роль этого АКР производства фактора роста на желудочную раковых клеток, а на самом деле, прежде чем начать в пробирке
исследования мы подтвердили, что CAF клетки получают гораздо большее количество белка, чем FGF9 клеток NGF (Фигура 1В). Кроме того, мы подтвердили, что FGF9 сильно выражено в фибробласты в строме желудка поражения рака, от которого был выделен АКР (рисунок 1C). Рисунок 1 Экспрессия FGF9 и его рецепторов в CAFS и клеток рака желудка. (A) Морфология желудка CAFS и NGFs. (Б) Получение FGF9 в желудочном CAFS, NGFs и их кондиционированной среды (СМ). (C) Выражение FGF9 в CAFS желудочного поражения рака. Стрелки с указанием CAFS. (D) Экспрессия рецепторов FGF
отвечает за FGF9 в желудочном линиях раковых клеток.
Таблица 1 Представитель генов дифференцированно, выраженные в CAFS из NGFs
инвентарный N

Символ
<бр> имя Gene

Fold изменение

вверх Регулируют
NM_014333
CADM1
молекулы клеточной адгезии 1, стенограмма вариант 1
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
гб | is39c09.y1 HR85 островковых гомо сапиенс кДНК клона IMAGE: 6554705 5 ', мРНК последовательность
254,8
NM_001113207
TSTD1
тиосульфат sulfurtransferase (роданезы) -как домен, содержащий 1, транскрипт вариант 1
237,5
NM_000867
HTR2B
5-гидрокситриптамина (серотонина) рецептора 2B
171,5
NM_001008539
SLC7A2
Растворенный семейство несущей 7 (катионного транспортеру аминокислоты, у системы +), член 2, стенограмма вариант 2
142,5
NM_002010
FGF9
фактор роста фибробластов 9 (глии-активирующий фактор)
141,1
NM_005559
LAMA1 <бр> Laminin, альфа-1
119,0
NM_001040058
SPP1
секретируемый фосфопротеином 1, стенограмма вариант 1
116.1
A_24_P247454
A_24_P247454
Unknown
112.6
NM_014398
LAMP3
Lysosomal-associated мембранный белок 3
111,3
понижающей регуляции
NM_001141919
XG
Xg группа крови (XG), стенограмма вариант 2,
0,0035
NM_175569
XG
Xg группа крови (XG), стенограмма вариант 1
0,0044
NM_000609
CXCL12
хемокинов (СХС мотив) лиганда 12 (CXCL12), стенограмма вариант 2
0,0071
NM_014817
TRIL
TLR4 Interactor с богатого лейцином повторы
0,0099
NM_002839
PTPRD
протеинтирозинфосфатазы, тип рецептора D, транскрипт вариант 1
0,0138
NR_021485
EGFEM1P
EGF-подобный и EMI домен, содержащий 1, псевдогеном, некодирующей РНК
0,0141
NM_198285
WDR86
WD повтор домен 86
0,0145
NM_001164000
MECOM <бр> MDS1 и EVI1 комплекс локус (MECOM), стенограмма вариант 6
0,0166
NM_004335
BST2
Кость антиген стромальных клеток костного мозга 2
0,0168
ENST00000484765
XLOC_002912
Гипотетический LOC100507661 (LOC100507661), miscRNA
0.0172
вислоухие значения изменения были оценены как отношение нормированных CAFS /нормированных NGFs.
Выражение FGFR2c
и FGFR3b /с
в желудочном линиях раковых клеток
FGF9 сообщалось показать высокое сродство к FGFR2c изоформы и FGFR3b /с изоформы [12]. Таким образом, мы исследовали экспрессию этих FGFRs
в различных желудочных линиях рака с использованием RT-PCR. Как показано на рисунке 1D, экспрессия FGFR2c
была обнаружена во всех семи желудочных линий раковых клеток, тогда как экспрессия FGFR3b /C
был обнаружен в шести из семи, за исключением MKN74. Эти результаты свидетельствуют о том, что раковые клетки желудка имеют способность реагировать на стимуляцию FGF9.
FGF9 активирует ERK и AKT сигнальные пути в клетках рака желудка
Мы исследовали эффект стимуляции FGF9 возможных путей, включая ERK и Akt в желудочном клеточные линии рака [16]. Экспрессия как п-Akt и п-ERK была дозозависимо повышается за счет стимуляции FGF9 в клетках AGS и MKN28 (фиг.2А). Усиление было видно с 15 мин после того, как FGF9 (10 нг /мл), лечение в обеих клеточных линиях (Фигура 2В). Кроме того, мы исследовали влияние анти-FGF9 нейтрализующих антител на желудочных раковых клеток и обнаружили, что повышенная экспрессия р-Akt и п-ЭРК, вызванное FGF9 стимуляции, ослабленный сопутствующей введению анти-FGF9 нейтрализующих антител (рис 2C). Рисунок 2 Влияние лечения FGF9 на внутриклеточную передачу сигналов в клетках рака желудка. (А) фосфорилирование АКТ и ERK в желудочном раковых клетках, обработанных FGF9. АГС (4 × 105) и MKN28 (4 × 105) культивировали в шесть-луночные планшеты и обрабатывали различными концентрациями FGF9 в течение 30 мин. Извлеченный белок анализировали с помощью Вестерн-блоттинга, как описано в разделе Материалы и методы. (B) изменение курса Время в Akt и ERK фосфорилирования в желудочном раковых клетках, обработанных FGF9. AGS и MKN28 клетки были аналогичным образом обрабатывали FGF9 (10 нг /мл) в течение указанных периодов времени. (С) действие анти-FGF9 нейтрализующих антител на FGF9-индуцированной Akt и ERK фосфорилирования в клетках рака желудка. AGS и MKN28 клетки предварительно обрабатывают с анти-FGF9 антител (Ab; 1 мкг /мл) в течение 45 мин и затем стимулировали с помощью FGF9 (10 нг /мл) в течение 30 мин
Влияние FGF9 на клеточную пролиферацию, инвазию и анти. -apoptosis в клеток рака желудка
Поскольку FGF9, как известно, имеют митогенетический эффект на некоторых типах клеток [17], мы сначала исследовали влияние FGF9 на кинетику роста клеток рака желудка. Тем не менее, мы не обнаружили какого-либо влияния FGF9 на пролиферацию клеток в AGS и клеточных линий MKN28 (рис 3А). Рисунок 3 Влияние FGF9 на рост и анти-апоптоза клеток рака желудка. (A) Влияние FGF9 на рост клеток рака желудка. (Б-Д) Влияние FGF9 на антиапоптоз способности клеток рака желудка. (Б) Характерные графики анализа FACS с использованием аннексина V-FITC окрашивания. Клетки AGS обрабатывали FGF9 (10 нг /мл) и оценивали, как описано в материалах и методах. (C) Изменение количества апоптотических AGS и клеток, обработанных MKN28 FGF9. (D), действие анти-FGF9 нейтрализующих антител (Ab Neu; 1 мкг /мл) на FGF9 (10 нг /мл) -индуцированного антиапоптоз в AGS и MKN28 клетках. Все результаты выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение четырех образцов. Значительно ниже, чем контроль: * P
&л; 0,05, ** P &
л; 0,01. Значительно больше, чем FGF9 обработанной группы: # P
< 0,05, ## P
&л; 0,01
Для дальнейшего определения возможной роли FGF9 в опухолевой прогрессии, мы исследовали дает ли экзогенный FGF9 ап. антиапоптозный действие на клеток рака желудка. FACS-анализ показал, что количество аннексина V-положительных клеток AGS был значительно меньше в FGF9 обработанной группе, чем в контрольной группе, и аналогичные результаты были получены в MKN28 клеток (фигура 3В и С). Кроме того, этот эффект FGF9 был отменен сопутствующей администрацией анти-FGF9 нейтрализующих антител в обеих клеточных линиях (рис 3D).
Кроме того, мы в следующий раз исследовали влияние FGF9 на инвазивной способности клеток рака желудка. Когда клетки AGS стимулировали FGF9 (1-10 нг /мл), количество инвазивных клеток была значительно увеличена (фиг.4А). Аналогичным образом, инвазивная способность клеток MKN28 была значительно улучшена дозозависимым путем FGF9 стимуляции (фиг.4А). Затем мы исследовали, является ли это про-инвазивная эффект FGF9 может быть отменена путем добавления нейтрализующего антитела. В обеих клеточных лини х, после того, как сопутствующего введения FGF9 нейтрализующего антитела (1 мкг /мл), количество инвазивных клеток было значительно снижено по сравнению с клетками, обработанными только FGF9 (10 нг /мл) (фиг.4В). Кроме того, мы исследовали индуцированное ли FGF9 экспрессию ММР, которые играют решающую роль в инвазии различных видов рака. Как показано на фигуре 4C, FGF9 стимуляция обычно усиливал экспрессию MMP7
в обоих AGS и клеток MKN28. Рисунок 4 Влияние FGF9 на экспрессию инвазии и ММР желудка раковых клеток. (A) Влияние FGF9 на желудочную раковых клеток вторжения. Изменение числа инвазивных AGS и клеток, обработанных MKN28 FGF9 были исследованы. Фотографии, показывающие типичные образы инвазивных клеток рака желудка в контрольной и FGF9 обработанных групп. (Б) Эффект анти-FGF9 нейтрализующих антител (Ab Neu; 1 мкг /мл) на FGF9 (10 нг /мл), индуцированную инвазию AGS и MKN28 клеток. (С) Влияние FGF9 на экспрессию ММР
в клеток рака желудка. Все результаты выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение четырех образцов. Значительно больше, чем контроль: * P
&л; 0,05, ** P &
л; 0,01. Значительно ниже FGF9 обработанной группы: # P
< 0,05, ## P
&л; 0,01
значение клинико-патологическими экспрессии FGF9 в рака желудка ассоциированных с фибробластами
20-рака желудка. образцы ткани исследовали, шестнадцать (80%) был положительным для выражения FGF9. Что касается особенностей клинико-патологическими, ни один из параметров ─ возраста, пола, локализации опухоли, гистологического типа или стадии опухоли ─ не имели существенного отношения к выражению FGF9 (дополнительный файл 2: Таблица S2)
Обсуждение
Считается. что развитие опухоли и прогрессирование зависят от перекрестных помех между раковыми клетками и окружающими их клетками стромы. В качестве основного стромы населения, "активный" фибробласты, именуемые CAFS, было предложено содействовать туморогенез с использованием различных молекулярных сигналов, и в настоящем исследовании мы выделили FGF9
как новый ген, который был избыточная экспрессия CAFS при раке желудка , Накопленные данные, в том числе наших нынешних данных, показали, что CAFS отличаются от NGFs с точки зрения не только морфологии, но и профили экспрессии генов [18,19], хотя основные механизмы, ответственные за эти различия пока не ясны. На основании последних данных, заманчиво, чтобы предложить, что опухолевые клетки инициируют переход от NGFs к CAFS через некоторую форму сигнализации [20] или CAFS происходят из раковых клеток через эпителиально-мезенхимальных перехода [21,22]. Интересно отметить, что широко признано, что FGF семьи имеет решающее значение для эпителиально-мезенхимальных перехода, а не только во время разработки, но и в канцерогенезе [9,23]. В настоящем исследовании мы показали, что CAFS являются возможным источником FGF9, и что, кроме того, желудочные раковые клетки имеют рецепторы, которые реагируют на FGF9, предполагая, что FGF9 может быть потенциальным посредником между CAFS и клеток рака желудка.
Что такое возможная роль FGF9 в патогенезе рака желудка? Поскольку FGF9 служит митогеном для простаты или рака яичников [17,24], мы сначала исследовали пролиферацию клеток рака желудка в присутствии FGF9 в пробирке
. Впоследствии FGF9 не удалось способствовать пролиферации обоих AGS и MKN28 желудка линий раковых клеток; Однако, мы не можем исключить возможность того, что FGF9 может служить митогеном для других типов клеток рака желудка, потому что FGF9 способствует пролиферации других клеток рака желудка, таких как AZ521 или SGC-7901 [25,26]. С другой стороны, мы выяснили в настоящем исследовании, что FGF9 имеет антиапоптозную воздействие на раковые клетки желудка, в соответствии с результатами нескольких предыдущих исследований [26,27]. В подтверждение этого вывода, Akt и ERK сигнальный путь, имеет решающее значение для антиапоптоз, был обычно активируется в обоих желудочных линиях раковых клеток. Кроме того, FGF9-индуцированной Akt и /или ERK фосфорилирование и полученную в результате клеточной инвазии была отменена, блокируя FGF9 стимуляцию, предполагая, что FGF9 по крайней мере, действует как анти-апоптотических фактора.
Мы также исследовали, способствует ли FGF9 инвазивную способность желудка раковые клетки. В пробирке
исследования показали, что лечение FGF9 увеличилось количество вторжения клеток рака желудка, в то время как это увеличило инвазивная способность была подавлена ​​путем добавления FGF9 нейтрализующего антитела. Хотя неясно, как FGF9 способствует вторжению клеток рака желудка, деградация внеклеточного матрикса является важной частью этого процесса [28]. В связи с этим, принято считать, что ММР играют центральную роль в таком поведении клеток и способствуют инвазивного потенциала различных злокачественных новообразований [29]. Таким образом, мы скринингу на ММР, которые связаны с FGF9 стимуляции и обнаружили, что MMP7 был потенциально вовлечен. Интересно отметить, что недавние исследования подчеркивают важность MMP7 в прогрессии рака желудка, так как MMP7 имеет потенциал, чтобы не только ухудшать внеклеточного матрикса, но и придают анти-апоптический воздействие на раковые клетки [30-32]. Соответственно, в будущем исследовании мы намерены сосредоточить внимание на оси FGF /MMP7 в контексте клеток желудка вторжения.
Заключение
В заключение, мы показали, что желудочные CAFS отличаются от соответствующих NGFs с точки зрения их профили экспрессии генов, и предполагают, что FGF9 является потенциальной молекулы, которая опосредует перекрестные помехи между CAFS и клеток рака желудка. Кроме того, мы выяснили, что FGF способствует антиапоптоз и инвазивные способности клеток рака желудка. Взятые вместе, наши данные свидетельствуют о том, что FGF9 возможный посредник секретируется из раковых ассоциированных с фибробластами, что способствует антиапоптоз и инвазивные способности клеток рака желудка.
Notes
Чао ВС и Хироказу Фукуи внесли одинаковый вклад в эту работу.
Сокращения
FGF:
фактор роста фибробластов


ММР:
Матрица металлопротеиназ


ERK :
внеклеточной регулируемой киназы
белка

CAF:
Рак-ассоциированный фибробласте


декларациях
Выражение признательности
Эта работа была частично поддержана грантами-в-помощь для научных исследований Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники, Япония (23591949 в MS, 25460466 к SK и 26460953 к HF). Эта работа также была частично поддержана грантом-в-помощь для исследователей, Хёго медицинский колледж и финансируемая программа для стратегических исследований фонда в частных университетах (для MS).
Авторы благодарят Норико Камия (Отдел гастроэнтерологии, Департамент внутренней медицины) и Юко Ясуи (отделение хирургии) за их технической помощи, а также ценят Нобуюки Адачи и Ryota Shinozaki (HCM Совместное использование-исследовательские учреждения) для технических вкладов
Дополнительные файлы для дополнительного файла 1:. Таблица S1 , Праймеры для анализа в реальном времени RT-PCR. Дополнительный файл 2: Таблица S2. Взаимосвязь между клинико-патологическими особенностями и выражения FGF9 стромы у больных раком желудка. Конкурирующие интересы
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Вклады
Авторского
CS и HF разработаны и выполняются все эксперименты, проанализировали данные, и написал рукопись. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Диагностическая задача легочной опухоли тромботической микроангиопатии в качестве презентации для лечения…
• Xpert MTB /RIF анализ может быть использован на архивизированных аспирата желудка и индуцированных образцов мокро…