FGF9 nuo vėžio susijusių fibroblastų yra įmanoma tarpininkas invazija ir anti-apoptozės skrandžio vėžys cells

FGF9 nuo vėžio susijusių fibroblastų yra įmanoma tarpininkas invazija ir anti-apoptozės skrandžio vėžio ląstelių
Anotacija
faktai
vėžio susijęs fibroblastai (CAFS), kurie gyvena aplink vėžinių ląstelių, siūloma vaidinti pagrindinį vaidmenį naviko progresavimo. Čia mes atliekame Mikrogardelė analizuoja palyginti genų ekspresijos profilius tarp kovos su sukčiavimu strategijoje ir nevėžinės skrandžio fibroblastų (NGF) iš paciento su skrandžio vėžiu, ir nustatė, kad fibroblastų augimo faktoriaus 9
(FGF9
) buvo naujoviška augimo faktorių ekspresija į kovos su sukčiavimu strategijoje. tada mes išnagrinėjo biologinį poveikį FGF9 progresavimo skrandžio vėžio metu.
metodai
išraiška FGF9 į kovos su sukčiavimu strategijoje ir NGF ir jų sekretuojamą produktų, išnagrinėjo imunoblotingo. Į FGF9 poveikis AGS ir MKN28 skrandžio vėžio ląstelių požiūriu platinimu, invazija ir anti-apoptozės vertino WST-1 testą, invazijos kamerinės tyrimo ir FACS, atitinkamai. Be to, ląstelėje signalizacijos, kuriuo FGF9 daro savo biologinius vaidmenis buvo tiriama in vitro
.
Rezultatai
FGF9 buvo stipriai išreikštas CAFS lyginant su NGF, yra suderinama su Mikrogardelė duomenys rodo, kad FGF9 buvo romanas augimas veiksnys ekspresija ir kovos su sukčiavimu strategijoje. Gydymas FGF9 skatinamas invazija ir anti-apoptozę per aktyvavimo ERK ir AKT signalizacijos stažuočių AGS ir MKN28 ląsteles, kadangi šie reiškiniai buvo sumažintos gydymo anti-FGF9 neutralizuojančių antikūnų. Be to, FGF9 gydymas žymiai sustiprino matricos metaloproteinazės 7 (MMP7) abiem ląstelių linijų išraiška.
Išvados
FGF9 yra įmanoma tarpininkas išskiriami kovos su sukčiavimu strategijoje, kuri skatina anti-apoptozę ir skrandžio vėžio ląstelių invazinių pajėgumus.
raktiniai žodžiai
FGF Vėžys susijusių fibroblastų invazija antiapoptozės ERK Akt Skrandžio vėžys faktai
vėžinių pakitimų formavimas yra glaudžiai susijęs su savo unikalų mikroaplinka. Progresavimo yra glaudžiai susijęs su vėžio ląstelių gebėjimą įdarbinti ir aktyvuoti aplinkinių stromos ląstelėse, o vėliau juos išnaudoja [1]. Vėžio supančio stromos ląstelės, pavyzdžiui, fibroblastų, endotelio ląstelių, ir imuninių ląstelių, gali muzikinės tumorigenezei ir metastazes per mobilųjį-to-ląstelių sąveiką ir /ar gamyba tirpių augimo veiksnių /citokinų /chemokinus [1-3]. Atsižvelgiant į tai, fibroblastai į vėžinių pakitimų yra žinomas kaip vėžys susijęs fibroblastus (CAFS) ir gavo daug dėmesio dėl savo vaidmens naviko progresavimo [4,5]. Nors kovos su sukčiavimu strategijoje yra žinoma, kad labai skiriasi nuo įprastų fibroblastų ne navikinių audinių pagal jų genų profilio, mechanizmas, pagal kurį kovos su sukčiavimu strategijoje skatinti naviko progresavimas yra neaiški. Todėl mes palygino genų ekspresijos profilius kovos su sukčiavimu strategijoje, ypač su augimo faktoriais /citokinų /chemokinus su tais, ne vėžinių skrandžio fibroblastų (NGF), naudojant mikrogardeliq tyrimą, o vėliau izoliuoti fibroblastų augimo faktoriaus 9
(FGF9
) kaip naują geną, kuris buvo ekspresija ir kovos su sukčiavimu strategijoje skrandžio vėžio.
FGF9 a sekretuojančia baltymų FGF šeimos, kaip pranešama, išreikštas stromos ląstelių, įskaitant fibroblastų [6-8]. Apskritai, FGF signalizacijos įvyksta per fgf receptorių (FGFRs) reguliuoti ląstelių biologinio elgesio įvairovę, įskaitant ginklų neplatinimo, diferenciacija, išlikimo ir judrumas [9], ir išraiška FGF9, FGFR2c, FGFR3b ir FGFR3c buvo aptikta skrandžio ir storosios žarnos vėžio [10]. Taigi, kaip ir kiti FGF šeimos baltymų, FGF9 gali vaidinti pagrindinį vaidmenį tarp vėžinių ląstelių ir jų aplinkinių stromos ląstelėse sąveikos, ir ji yra verta pažymėti, kad FGF9 stipriai išreikštas CAFS skrandžio vėžio. Šiame tyrime mes tikrinami dėl skirtumų genų ekspresijos tarp kovos su sukčiavimu strategijoje ir NGF iš paciento su skrandžio vėžiu. Mes išnagrinėjo FGF9 poveikį dauginimosi, invazija ir anti-apoptozės skrandžio vėžio ląsteles, be to patikslino ląstelėje signalizacijos, kuriuo FGF9 daro savo biologinį poveikį skrandžio vėžio ląsteles.
Metodai
Reagentai ir ląstelių kultūros
žmogaus rekombinantinis FGF9 ir anti-žmogaus FGF9 neutralizuojančių antikūnų buvo įsigytas iš R & D Systems (Mineapolis, MN, JAV). Anti-ekstraląstelinis signalas-reguliuojama baltymų kinazės (ERK), anti-fosfo-specifinis ERK (p-ERK), anti-AKT, anti-fosfo-specifinis AKT (p-AKT; Ser473), ir anti-β-Aktinis antikūnai buvo perkamos iš ląstelių Signalizacijos technologijos (Beverly, MA, JAV)
skrandžio vėžio ląstelių linijas, AGS buvo kultivuojamos Ham "F-12 terpėje (" Sigma, Aurora, Ohajas, JAV) su 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS;. Biowest, Nuaille, Prancūzija) drėgmėje, inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 atmosferoje. Panašiai MKN28 buvo auginamos RPMI 1640 terpė su 10% vaisiaus jaučio serumo ir kiti penki skrandžio vėžio ląstelių linijas MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY ir KATOIII išliko kaip buvo aprašyta anksčiau [11].
Išskyrimas ir kultūra žmogaus skrandžio fibroblastai
žmogaus skrandžio vėžys (blogai diferencijuota adenokarcinoma) egzemplioriai buvo gauti iš paciento, kuris buvo atliktas pašalintas skrandis ne Hyogo medicinos koledžo ligoninės 2012. vėžio susijusių fibroblastus (CAFS) buvo paruošti iš vėžinių dalis skrandyje. Ne vėžiniai skrandžio fibroblastai (NGF) buvo paruoštas iš ne-vėžinių dalį su atrofinio gastrito bent 50 mm toli nuo naviko į skrandį. Audinių mėginiai buvo nuvalyti nuo riebalų ir Nekrotinio audinio, malta su skalpeliai ir išplauti PBS, kuriame yra antibiotikų priešgrybelinį preparatą reagentą (anti-Anti®, GIBCO). Audinių vienetų buvo perkeltas į 12 šulinėlių mikroplokštelę (Iwaki, Tokijas, Japonija) vienu fragmento /duobutėje. Ląstelės buvo auginamos DMEM terpe (Gibco, Grand Island, NY, JAV) su 10% šilumos-inaktyvuota FBS 37 ° C temperatūroje, kad būtų pasiekta 5% CO2 atmosferoje. Kad fibroblastai, kad iš pradžių padidėjo į monosluoksnio buvo surinkti, perduoti į kitą indą ir naudojami eksperimentams, kaip apibrėžta 10-ojo praėjimą. Šie tyrimai buvo atlikti su peržiūros valdybos Hyogo medicinos koledžo patvirtinimo, ir informavo sutikimas buvo gautas iš paciento.
Mikrogardeliq analizę
Naudojant Trizol reagentą (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV), RNR buvo išgauti iš trijų rinkinių kovos su sukčiavimu strategijoje ir NGF kultūringas. kDNR ženklinimas, hibridizacija, nuskaitymo ir duomenų analizė buvo atliekama Hokaido sistemos Mokslas Co Ltd (Saporas, Japonija). Trumpai tariant, cyanine-3 (Cy3) žymėto Juodos buvo ruošiamas iš viso RNR (0,05 mikrogramų), naudojant mažos sąnaudos Greita stiprintuvas Žymėjimas Kit (Agilent) pagal gamintojo nurodymus, po RNAeasy stulpelio valymo (QIAGEN, Valensija, Kalifornija) , Dažų įtraukimas ir Juodos derlius buvo patikrinta su NanoDrop ND-1000 spektrometras. Cy3 žymėto Juodos (0,60 mikrogramų) buvo suskaidyta į 60 ° C temperatūroje 30 min reakcijos tūrio 25 įxL sudėtyje yra 1x AGILENT fragmentaciją buferį ir 2x AGILENT blokuojanti medžiaga pagal gamintojo instrukcijas. Baigus susiskaldymo reakcija, 25 įxL 2x Agilent hibridizacijos buferio buvo įtraukta į fragmentacijos mišinio ir kryžminosi į "Agilent SurePrint G3" Žmogaus genų ekspresijos mikrogardeliq (8x60K ver.2.0) už 17 h 65 ° C rotacijos Agilent hibridizacijos orkaitėje. Po to, kai hibridizacijos, kad mikrogardelių buvo plaunamas iš 1 min kambario temperatūroje su "GE plovimo buferiu 1 (Agilent) ir 1 min 37 ° C temperatūroje su GE plovimo buferiu 2 (Agilent), o po to džiovinami iš karto po trumpo centrifuguojant. Skaidrės buvo nuskaityti iš karto po plovimo ant "Agilent DNR mikrogardeliq Skeneriai (G2565CA), naudojant vieną spalvą nuskaitymo nustatymą 8x60K masyvo skaidres (SCAN erdvės 61 x 21,6 mm, Skenavimo raiška 3μm, Dažų kanalas Žaliosios PMT nustatytas 100%). Nuskenuoti nuotraukas buvo analizuojami ir normalizuotas su atvaizdo požymių išskyrimo Programinė įranga 10.7.3.1 (Agilent).
RNR gavyba ir atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (PGR)
viso RNR buvo išskirta iš skrandžio vėžio ląstelių linijas, naudojant Trizol reagentas (Invitrogen). Keturi mikrogramų visos RNR buvo atvirkštinio perrašyti naudojant oligo DT (taikoma BIOSYSTEMS, Branchburg, NJ, JAV) ir 200 U viršuje ™ II atvirkštinės transkriptazės (INVITROGEN) A bendro tūrio 20μl. Dėl šios PGR, aprašyta anksčiau poros oligonukleidų pradmenys žmogaus FGFRs
buvo paruošti kaip [12]. Žmogaus FGFR2c
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 "(pirmyn) ir 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3" (atgal); žmogaus FGFR3b
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 "(pirmyn) ir 5 '-GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3" (atgal); žmogaus FGFR3c
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 "(pirmyn) ir 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3" (atgal); žmogaus GAPDH
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 "(pirmyn) ir 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3" (atgal). Vienas mikrolitras RT produkto (kDNR) sustiprino PGR į 50-iL reakcijos tūrio, kuriame yra 20 pmol pirmiau rinkinių gruntai, 1,25 u Ampli-Taq DNR polimerazės (taikoma BIOSYSTEMS Foster City, Kalifornija., JAV) ir galutinis PGR buferis: 20 mM Tris-HCl, (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolo, ir 1 mM dNTP. PGR amplifikacija buvo atliekama taip: už FGFRs
, 95 ° C temperatūroje 5 min vieną kartą; 40 ciklų, esant 95 ° C temperatūroje 30 S, 57 ° C temperatūroje 30 S, ir 72 ° C temperatūroje 1 min; tada 72 ° C temperatūroje 7 min; už GAPDH
, 95 ° C temperatūroje 7 min vieną kartą; 40 ciklų, esant 95 ° C temperatūroje 30 S, esant 55 ° C temperatūroje 1 min, ir 72 ° C temperatūroje 30 sek; tai bent 72 ° C 7 min.
realaus laiko PGR
realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant 7900H Greitas realiojo laiko PGR sistema (Taikomoji BIOSYSTEM), kaip aprašyta anksčiau [13]. Šie rinkiniai pradmenis žmonių matrica metaloproteinazės 2
(MMP2 pervežimas), MMP3
, MMP7
, MMP9
ir GAPDH
buvo paruošti (Papildoma failą 1: Lentelė S1) , Realaus laiko PGR tyrimai buvo atlikti su 200 ng RNR lygiavertį kDNR, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) ir 500 nmol /l geno specifinius pradmenis. PGR dviračių sąlygos buvo 50 ° C temperatūroje 15 s, ir 60 ° C iki 60 s. Fluorescentinės dažų intensyvumas buvo nustatomas, ir kiekvienas iš mRNR ekspresijos lygių buvo normalizuoti pagal GAPDH
mRNR ekspresijos lygių.
Mobilusis proliferacijos tyrimu
AGS (4 × 10 3) ir MKN28 ląstelės (1 × 10 4) buvo pasėjamos visiškai terpės 96 šulinėlių mikrolėkštelės. tada vidutinės buvo pakeistas su vienu, kurių sudėtyje yra rekombinantinio FGF9 (0-10 ng /ml). BTS-1, tirpalą pridedama po to, kai 72 h inkubacijos, o plokštelės buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 1 val. Lėkštelės buvo analizuojami naudojant ELISA plokštelių skaitytuvas 450 nm su atskaitos bangos nustatyta 600 nm.
Mobilusis invazija tyrimą
Mobilusis invazija tyrimas buvo atliktas naudojant BioCoat Matrigel invazija kameras (BD biomokslų, Bedford, MA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, AGS ląstelės (1 × 10 5) arba MKN28 ląstelės (3 × 10 5) buvo pasėjamos į Matrigel dengtos invazijos kameros įdėklas (24 šulinius, 8-mkm porų dydis) alsuoja serume -nemokama terpėje, turinčioje skirtingų koncentracijų FGF9 (0-10 ng /ml). Tada, ląstelės buvo inkubuojamos terpėje, turinčioje 10% FBS į apatinę kamerą 37 ° C temperatūroje 5% CO2. Slopinti FGF9 poveikį, anti-FGF9 antikūnas (1 mikrogramai /ml) taip pat buvo įtraukta į viršutinio kameroje. Po to, kai inkubacijos 27 h, ne-invazija ląstelės buvo pašalintas naudojant medvilnės tamponu ir ląstelės, kurios buvo įsiveržė į apatinio paviršiaus membranos buvo nustatyti su etanoliu. tada užplūsta ląstelės buvo tamsintas hematoksilinu ir skaičiuojami naudojant mikroskopą penkių skirtingų regėjimo laukų (priartinimu, X200).
apoptozę tyrimą
AGS (2 × 10 5) ir MKN28 (2,5 × 10 5) ląstelės buvo pasėjamos šešių duobučių plokštelėse kasdieninį terpėje 24 h. Ląstelės tada buvo atimta serumo ir apdorotų su arba be rekombinantinės FGF9 (1-10 ng /ml) už 48h. Slopinti FGF9 poveikį, anti-FGF9 antikūnas (1 mikrogramai /ml) taip pat buvo įtraukta į mitybinės terpės. Po gydymo, abu slankiojo ir pridedamas ląstelės buvo nuimta, išplauti PBS ir tamsintas su AnnexinV-FITC ir propidiumo jodido (PI), naudojant MEBCYTO apoptozę komplektas (MBL, Nagoja, Japonija). Dėmėti ląstelės buvo analizuojama FACScalibur tekėti citometre (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, JAV), o gauti duomenys buvo analizuojami naudojant CELLQUEST programinę įrangą (Becton Dickinson, Mountain View, CA, JAV).
Vakarų dėmė analizė
Western Blot analizė buvo vykdomi, kaip aprašyta anksčiau [14]. Trumpai, po gydymo su arba be reagento, ląstelės buvo lizuojamos baltymų ekstrahavimo buferinio tirpalo, ir baltymų ekstraktas (30 mikrogramų) buvo Frakcionuotas pat natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezės ir perkelti į nitroceliuliozės blotingo membrana. Membrana buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais, o po to peroksidaze konjuguotų antrinio antikūno. Baltymai buvo aptikta naudojant sustiprintą chemiliuminescencine sistemą (Amersham biomokslų, Buckinghamshire, Jungtinė Karalystė).
Imunohistocheminis
20 skrandžio vėžio audiniuose viso buvo gauti iš egzempliorių rezekcijos chirurginiu būdu ne Hyogo medicinos koledžo. Audinių mėginys buvo nustatytas 10% formalino tirpalu ir įdėta į parafiną. Šis tyrimas patvirtino peržiūros valdybos Hyogo medicinos koledžo, ir informavo sutikimas buvo gautas iš visų pacientų. Skrandžio vėžiu sergančių pacientų charakteristikos parodė Papildoma failą 2: Lentelė S2
imunohistocheminis dažymas FGF9 buvo atliktas su LSAB + rinkinio naudojant anti-FGF9 antikūnas (1:40; & D sistemos, Mineapolis, MN, JAV). kaip aprašyta anksčiau [15]. Galiausiai, sekcijos buvo inkubuojami 3,3'-diaminobenzide tetrahidrochlorido su 0,05% H2O2 3 min, tada counterstained su Mayer hematoksilinu. Įvertinti FGF9 reaktyvumas, bent penkių skirtingų regėjimo laukai buvo pastebėtas invazinės skrandžio vėžio pažeidimų priekyje. Egzempliorius buvo laikomas teigiamu, kai FGF9 teigiamas fibroblastq lizdai buvo pastebėtas regėjimo laukų tirtų.
Statistika analizė
Visos vertės, išreikštas vidurkis ± SD. Duomenys buvo analizuojami naudojant neporiniai du-tailed T
-test. buvo laikomi P
vertės mažesnis nei 0,05 nurodyti statistinį reikšmingumą.
rezultatai
mikrogardeliq analizė CAFS skrandžio vėžio audiniuose
Mes izoliuotų kovos su sukčiavimu strategijoje ir NGF (1a paveikslas), o palyginti su genų ekspresijos profilio CAFS su ta NGF naudojant mikrogardeliq tyrimu. Dešimt atstovybės genai, kurie buvo aktyvinama į kovos su sukčiavimu strategijoje, yra išvardyti 1 lentelėje Tarp šių genų, mes tikslingai FGF9 kaip labiausiai išreikšta geno išnagrinėti šio BVM pagamintos augimo faktoriaus skrandžio vėžio ląstelių vaidmenį, ir tai prieš pradedant in vitro
tyrimai mes patvirtino, kad CAF ląstelės gaminamos daug didesnį kiekį FGF9 baltymų nei NGF ląstelių (1b pav.) Be to, mes patvirtino, kad FGF9 stipriai išreikšta į skrandžio vėžio pažeidimo, iš kurio BVM buvo izoliuotas (1c pav) stromos fibroblastų. 1 pav išraiška FGF9 ir jo receptorius kovos su sukčiavimu strategijoje ir skrandžio vėžio ląsteles. (A), morfologija skrandžio kovos su sukčiavimu strategijoje ir NGF. (B), gamyba FGF9 skrandžio kovos su sukčiavimu strategijoje, NGF ir jų kondicionieriai vidutinio (cm). (C), išraiška FGF9 į kovos su sukčiavimu strategijoje dėl skrandžio vėžio pažeidimo. Rodyklės rodo, kovos su sukčiavimu strategijoje. (D), išraiška fgf receptorių
atsakingas už FGF9 skrandžio vėžio ląstelių linijas.
1 lentelė Atstovybės genus skirtingai išreikštas CAFS iš NGF
Stojimo Nr
Akcija

Genų vardas
Sulenkite pokyčius
Iki reguliuojama
NM_014333
CADM1
ląstelių adhezijos molekulės 1 stenograma variantas 1 273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
GB | is39c09.y1 HR85 salelių homo sapiens kDNR klonas vaizdas: 6.554.705 5 ', iRNR sekos
254,8
NM_001113207
TSTD1
tiosulfato sulfurtransferase (rhodanese) -kaip domeną, turintį 1, stenograma 1 variantas
237,5
NM_000867
HTR2B
5-hidroksitriptamino (serotonino) receptorių 2B
171,5
NM_001008539
SLC7A2
tirpinio vežėjas šeima 7 (katijonų aminorūgščių transporteriu, Y + "sistema), valstybės 2, stenograma variantas 2
142,5
NM_002010
FGF9
fibroblastų augimo faktorius 9 (Glia įsijungiantis faktorius)
141,1
NM_005559
LAMA1
lamininas, alfa 1
119,0
NM_001040058
SPP1
sekretuojamą fosfoproteinu 1, stenograma variantas 1
116.1
A_24_P247454
A_24_P247454
Unknown
112.6
NM_014398
LAMP3
Lysosomal-associated membranos baltymo 3
111,3
žemyn reguliuojama
NM_001141919
XG
Xg kraujo grupė (XG), stenograma variantas 2,
0,0035
NM_175569
XG
xg kraujo grupė (XG), stenograma variantas 1 0,0044
NM_000609
CXCL12
chemokino (CXC motyvas) ligando 12 (CXCL12), stenograma variantas 2 0,0071
NM_014817
Til
TLR4 sąveikautojo su Leucinas turtingas kartojasi
0,0099
NM_002839
PTPRD
baltymų tirozino fosfatazės, receptorių D tipo, stenograma 1 variantas
0,0138
NR_021485
EGFEM1P
EGF kaip ir EPI domeną, turintį 1, pseudogene, ne kodavimo RNR
0,0141
NM_198285
WDR86
WD pakartoti domeną 86
0,0145
NM_001164000
MECOM
MDS1 ir EVI1 kompleksas lokusas (MECOM), stenograma variantas 6
0,0166
NM_004335
BST2
Kaulų čiulpų stromos ląstelių antigeno 2
0,0168
ENST00000484765
XLOC_002912
Hipotetinis LOC100507661 (LOC100507661), miscRNA
0.0172
sulankstykite kaita vertės buvo vertinamos kaip normalizuotų CAFS /normalizuotų NGF santykis.
išraiška FGFR2c parsisiųsti ir FGFR3b /c
skrandžio vėžio ląstelių linijas
FGF9 buvo pranešta rodo didelį afinitetą FGFR2c izoformos ir FGFR3b /c izoformų [12]. Todėl mes išnagrinėjo šių FGFRs išraiška
įvairiais skrandžio vėžio linijas, naudodamos RT-PGR. Kaip parodyta 1D paveiksle, išraiška FGFR2c
buvo aptikta visų septynių skrandžio vėžio ląstelių linijų, kadangi išraiška FGFR3b /c
buvo aptikta šešis iš septynių, su MKN74 išskyrus. Šie rezultatai rodo, kad skrandžio vėžio ląstelės turi pajėgumų reaguoti į FGF9 stimuliacijos.
FGF9 aktyvina ERK ir AKT signalizacijos kelius skrandžio vėžio ląstelių
Mes tyrė FGF9 stimuliacijos poveikį galimų kelių, įskaitant ERK ir AKT skrandžio vėžio ląstelių linijos [16]. Išraiška tiek p-Akt ir p-ERK buvo priklausomai nuo dozės sustiprina FGF9 stimuliacija AGS ir MKN28 ląstelių (2A pav.) Telefono priedas buvo akivaizdu, nuo 15 min po FGF9 (10 ng /ml) gydymas abiem ląstelių linijų (2b pav). Be to, mes išnagrinėjo anti-FGF9 neutralizuojančių antikūnų poveikį skrandžio vėžio ląsteles ir nustatė, kad padidėjo išraiška p-Akt ir p-ERK sukėlė iki FGF9 stimuliacijos buvo sumažintos vartojant kartu anti-FGF9 neutralizuojančių antikūnų (2C pav.) 2 pav poveikis FGF9 gydymo nuo ląstelėje signalizacijos skrandžio vėžio ląsteles. (A), fosforilinimas Akt ir ERK skrandžio vėžio ląstelių gydomiems FGF9. AGS (4 × 105) ir MKN28 (4 × 105) buvo auginamos šešių duobučių lėkštelėse ir apdorojimo su įvairios koncentracijos FGF9 30 min. Ekstrahuotosios baltymas buvo analizuojami Vakarų blotingo metodu, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai. (B), laikui bėgant pasikeitė Akt ir ERK fosforilinimo skrandžio vėžio ląstelių gydomiems FGF9. AGS ir MKN28 ląstelės buvo panašiai gydomi FGF9 (10 ng /ml) už nurodyto laiko. (C) poveikis anti-FGF9 neutralizavimo antikūnų apie FGF9 sukeltos Akt ir ERK fosforilinimo skrandžio vėžio ląsteles. AGS ir MKN28 ląstelės buvo išvalytos su anti-FGF9 antikūnų (AB; 1 g /ml), 45 min ir tada skatino su FGF9 (10 ng /ml) 30 min
Poveikis FGF9 ant ląstelių proliferaciją, invazijos ir priešinfekciniai. -apoptosis skrandžio vėžio ląstelių
nuo FGF9 yra žinoma, kad mitogeniniu poveikį kai kurių tipų ląstelių [17], pirmiausia išbandė FGF9 poveikį augimo kinetika skrandžio vėžio ląsteles. Tačiau mes nerado FGF9 poveikį ląstelių proliferacijos į AGS ir MKN28 ląstelių linijas (3a pav.) 3 pav poveikis FGF9 augimui ir anti-apoptozės skrandžio vėžio ląsteles. (A) poveikis FGF9 augimui skrandžio vėžio ląsteles. (B-D) poveikis FGF9 dėl antiapoptozės pajėgumą skrandžio vėžio ląsteles. (B), atstovas grafikai FACS analizė naudojant aneksinu-FITC dažymo. AGS ląstelės buvo gydomi FGF9 (10 ng /ml) ir įvertinti, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai. (C) pokyčiai apoptozinių AGS ir MKN28 ląstelių gydomiems FGF9 numerį. (D) Poveikis anti-FGF9 neutralizuojančių antikūnų (Neu Ab; 1 g /ml) ant FGF9 (10 ng /ml) indukuotų antiapoptozės į AGS ir MKN28 ląstelių. Visi rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD keturių mėginių. Žymiai mažesnis nei kontrolės: * p
< 0,05, ** p
< 0,01. Reikšmingai didesnis nei FGF9 tiriamoji grupė: # P
< 0,05, ## P,
< 0,01
toliau nustatyti galimą vaidmenį FGF9 auglio progresavimo, mes nagrinėjo, ar egzogeninė FGF9 suteikia. anti-aprotoninis poveikis skrandžio vėžio ląsteles. FACS analizė parodė, kad aneksinu teigiamas AGS ląstelių skaičius buvo žymiai mažesnis į FGF9 gydytų pacientų grupėje nei kontrolinėje grupėje, ir panašūs duomenys buvo gauti MKN28 ląstelių (3b ir C pav.) Be to, šis FGF9 poveikis buvo panaikinta kartu vartojami anti-FGF9 neutralizuojančių antikūnų abiejų ląstelių linijas (3D pav.)
Be to, mes šalia išnagrinėjo FGF9 poveikį invazinės gebėjimą skrandžio vėžio ląsteles. Kai AGS ląstelės buvo stimuliuojama su FGF9 (1-10 ng /ml), invazinių ląstelių skaičius buvo žymiai padidėjęs (4a paveikslas). Be to, invazinių gebėjimas MKN28 ląstelių buvo daug didesnis priklausomai nuo dozės iki FGF9 stimuliacija (fig.4A). Mes tada išnagrinėti, ar šis Pro-invazinių FGF9 poveikis gali būti panaikinta, pridedant neutralizuojančių antikūnų. Abiem ląstelių linijų, kai kartu vartojami FGF9 neutralizuojančių antikūnų (1 g /ml), invazinių ląstelių skaičius buvo gerokai sumažėjo, palyginti su ląstelėmis gydomų vien FGF9 (10 ng /ml) (4b pav.) Be to, mes nagrinėjo, ar FGF9 sukeltas dėl MMP, kurios atlieka pagrindinį vaidmenį invazijos įvairių vėžio išraiška. Kaip parodyta 4C paveiksle, FGF9 stimuliacija dažniausiai sustiprino MMP7
išraišką tiek AGS ir MKN28 ląsteles. 4 pav poveikis FGF9 nuo invazijos ir MMP raiškos skrandžio vėžio ląsteles. (A), poveikis FGF9 skrandžio vėžio ląstelių invaziją. buvo išnagrinėti skaičiaus pasikeitimas invazinių AGS ir MKN28 ląstelių gydomiems FGF9. Fotografijos rodantys atstovybes vaizdus invazinių skrandžio vėžio ląstelių kontrolės ir FGF9 gydytų grupių. (B) Poveikis anti-FGF9 neutralizuojančių antikūnų (Neu Ab; 1 g /ml) ant FGF9 (10 ng /ml) indukuotų invazija AGS ir MKN28 ląstelių. (C) poveikis FGF9 ant išraiška MMPs
skrandžio vėžio ląsteles. Visi rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD keturių mėginių. Žymiai didesnis nei kontrolės: * P
< 0,05, ** p
< 0,01. Žymiai mažesnis nei FGF9 tiriamoji grupė: # P
< 0,05, ## P,
< 0,01
klinikos reikšmė FGF9 raiškos skrandžio vėžys susijęs fibroblastų
Iš 20 skrandžio vėžiu. audinio mėginiai išnagrinėjo, šešiolika (80%) buvo teigiamas FGF9 išraiška. Dėl klinikos ypatybių, nė vienas iš parametrų ─ Amžius, lytis, naviko vietos histologinis tipas, arba naviko stadijos ─ turėjo didelę ryšį su FGF9 išraiškos (papildomas failą 2: Lentelė s2), kaip manoma Diskusijos
It
. kad naviko vystymosi ir progresavimo priklauso nuo kryžminio aptarimas tarp vėžinių ląstelių ir jų aplinkinių stromos ląstelėse. Kaip pagrindinis stromos gyventojų ", aktyvuotos" fibroblastai, vadinama kovos su sukčiavimu strategijoje, buvo siūloma skatinti tumorigenezei naudojant įvairius molekulinius signalus, o šiame tyrime mes izoliuoti FGF9
kaip naują geną, kuris buvo ekspresija ir kovos su sukčiavimu strategijoje skrandžio vėžio , Daugėja įrodymų, įskaitant mūsų dabartinių duomenų, parodė, kad kovos su sukčiavimu strategijoje skirtis nuo NGF požiūriu ne tik morfologijos, bet ir genų ekspresijos profilius [18,19], nors pagrindiniai mechanizmai, atsakingi už šių skirtumų vis dar neaišku. Remiantis neseniai įrodymais, kyla pagunda pasiūlyti, kad vėžinių ląstelių inicijuoti perėjimą nuo NGF į CAFS per tam tikrą signalinių [20] forma arba kad kovos su sukčiavimu strategijoje kilę iš vėžinių ląstelių per epitelio-mezenchiminių perėjimo [21,22]. Įdomu tai, kad ji yra plačiai pripažįstama, kad FGF šeima yra labai svarbi epitelio-mezenchiminių perėjimo, o ne tik per vystymuisi, bet ir kancerogeninio poveikio [9,23]. Šioje studijoje, mes parodė, kad kovos su sukčiavimu strategijoje yra įmanoma šaltinis FGF9 ir kad, be to skrandžio vėžio ląstelės turi receptorius, kurie reaguoja į FGF9, tai rodo, kad FGF9 gali būti potencialus tarpininkas tarp kovos su sukčiavimu strategijoje ir skrandžio vėžio ląsteles.
Kas yra galimas vaidmuo FGF9 į skrandžio vėžio patogenezės? Nuo FGF9 tarnauja kaip mitogenas prostatos ar kiaušidžių vėžiu [17,24], pirmiausia tyrė skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją į FGF9 in vitro
buvimą. Vėliau FGF9 nepavyko skatinti abiejų AGS ir MKN28 skrandžio vėžio ląstelių linijų platinimu; Tačiau mes negalime atmesti galimybės, kad FGF9 gali tarnauti kaip mitogenas kitų tipų skrandžio vėžio ląsteles, nes FGF9 skatina kitų skrandžio vėžio ląsteles, pavyzdžiui, AZ521 ar SGC-7901 [25,26] platinimu. Kita vertus, mes paaiškinti šio tyrimo, FGF9 turi anti-Apoptozė poveikį skrandžio vėžio ląstelės, in sutarimu su keliais ankstesniais tyrimais [26,27] išvadas. Grįsdama šį vertinimą, Akt ir ERK kelias signalizacijos, svarbu anti-apoptozės, paprastai buvo aktyvuota abiejų skrandžio vėžio ląstelių linijas. Be to, FGF9 sukeltos Akt ir /arba ERK fosforilinimo ir dėl to ląstelių invazija buvo panaikintas blokavimas FGF9 stimuliacija, tai rodo, kad FGF9 bent veikia kaip anti-apoptozės faktorius.
Mes taip pat išnagrinėjo, ar FGF9 skatina invazinių gebėjimas skrandžio vėžio ląstelės. In vitro
tyrimai parodė, kad FGF9 gydymas padidino užplūsta skrandžio vėžio ląstelių skaičių, kadangi ši išaugo invazinės gebėjimas buvo nuslopintas pridedant FGF9 neutralizuojančių antikūnų. Nors ir nėra aišku, kaip FGF9 skatina skrandžio vėžio ląstelių invaziją, blogėjant tarpląsteliniame užpilde yra svarbus šio proceso dalis [28]. Atsižvelgdama į tai, ji yra priimta, kad MMPs vaidinti pagrindinį vaidmenį tokio ląstelių elgesį ir skatinti invazinių įvairių piktybinių navikų [29] pajėgumus. Todėl mes tikrinami dėl MMP kurios yra susietos su FGF9 stimuliacijos ir nustatė, kad MMP7 buvo potencialiai dalyvauja. Įdomu tai, kad naujausi tyrimai pabrėžė MMP7 skrandžio vėžio progresavimo svarbą, nes MMP7 turi potencialą ne tik pabloginti tarpląsteliniame bet ir suteikia anti-Apoptozė poveikį vėžio ląstelių [30-32]. Taigi, ateityje tyrime mes ketiname sutelkti dėmesį į FGF /MMP7 ašies skrandžio vėžio ląstelių invaziją kontekste.
Išvada
Apibendrinant, mes parodė, kad skrandžio CAFS skiriasi nuo savo atitinkamų NGF požiūriu jų genų ekspresijos profilius, ir pasiūlyti, kad FGF9 yra potencialus molekulė, kuri tarpininkauja kryžminio aptarimas tarp kovos su sukčiavimu strategijoje ir skrandžio vėžio ląsteles. Be to, mes paaiškinti, kad FGF skatina antiapoptozės ir skrandžio vėžio ląstelių invazinė galimybes. Kartu paėmus, mūsų duomenys rodo, kad FGF9 yra įmanoma tarpininkas išsiskiria nuo vėžio susijusių fibroblastų, kuri skatina anti-apoptozę ir skrandžio vėžio ląstelių invazinių pajėgumus.
Notes
Čao Saulė ir Hirokazu Fukui prisidėjo vienodai prie šio darbo.
Santrumpos
FGF: Rīga, fibroblastų augimo faktorius
MMP: Rīga, Matrica metaloproteinazės
ERK : Rīga, tarpląstelinio signalo reguliuojamas baltymų kinazės
BVM: Rīga, vėžio susijusių fibroblastų
deklaracijų
Padėkos
Šis darbas buvo iš dalies remiamą dotacijos-in-pagalbos moksliniams tyrimams iš švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų, Japonijoje ministerijos (23591949 VN, 25460466 SK ir 26460953 su HF). Šis darbas taip pat buvo iš dalies remiamą Grant-in-pagalbos mokslininkams, Hyogo medicinos koledžo ir remiama programa dėl Strateginių tyrimų fondo privačiuose universitetuose (VN).
Autoriai dėkoja Noriko Kamiya (skyrius Gastroenterologijos skyrius Vidaus ligų) ir Yuko YASUI (departamentas chirurgijos) už jų techninę pagalbą ir taip pat vertiname Nobuyuki Adachi ir Ryota Shinozaki (HCM Uždaroji Naudokite mokslinių tyrimų infrastruktūra) už techninę įmokų
papildomų failų
Papildoma failą 1. lentelė S1 , Gruntai realaus laiko AT-PGR analizė. Papildoma failą 2: Lentelė S2. Ryšys tarp klinikos funkcijų ir stromos FGF9 išraiškos pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. Konkuruojančių interesų Viesbutis The autoriai deklaruoja, kad jie neturi jokių konkuruojančių interesų.
Autorių indėlį
AP ir AD suprojektuoti ir atlieka visas eksperimentus, išanalizavo duomenis, ir parašė rankraštį. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Diagnostikos iššūkis plaučių naviko mikroangiopatinės trombozės kaip pristatant skrandžio vėžiui: atvejo ataskaitos ir literatūros apžvalga
• Xpert MTB /rifas tyrimas gali būti naudojamas ant archyvą skrandžio išsiurbimo ir sukeliama skreplių mėginius jautriai diagnozuoti vaikų tuberkuliozės